Способ получения агрегатов протеогликанов из соединительной ткани животного (варианты)

 

Изобретение относится к медицине и медицинской промышленности, а именно к способам получения агрегатов протеогликанов из соединительных тканей, применяемых в качестве лекарственного средства. Данный способ позволяет получать агрегаты протеогликанов в твердом сухом виде и использовать их в составе лекарственных препаратов, применяемых для лечения заболеваний кожи (диатез, аллергия, псориаз и др.), и травм роговицы. Сущность изобретения: диализ проводят до полного удалей солей, освобождаются от растворимого коллагена и неагрегированных противогликанов путем их осаждения лимонной кислотой, далее проводят диализ до полного удаления кислоты, полученный раствор обрабатывают Н⁺ - формой катионита для получения кислой формы агрегатов противогликонов, далее солевой формой катионита для получения кислой солевой формы агрегат протеогликанов, которую затем обрабатывают не менее чем двойным объем 96,6^oС этанола, насыщенного ацетатом металла, для осаждения основной формы агрегатов протеогликанов, с последующей промывкой и сушкой осадка этиловым спиртом и эфиром, при этом кисло-солевая и основная - солевая формы агрегатов протеогликанов могут быть лиофизированы. 2 с. и 2 з.п. ф-лы.

Изобретение относится к медицине и медицинской промышленности, а именно к способам получения агрегатов протеогликанов из соединительной ткани, применяемых в качестве лекарственного средства.

Известен способ получения агрегатов протеогликанов из различных видов хрящевой ткани путем экстракции из измельченной ткани концентрированными растворами гуанидин гидрохлорида, магний- и кальций-хлоридов, диализа с неполным удалением солей и центрифугированием слабых солевых растворов в градиенте плотности для получения агрегатов протеогликанов только в растворенном виде (HascuLR V. C. Sajdera S.W. Y.Biol. Chem. 1969, У.244, N 9, p.2384-2396).

В предлагаемом способе в отличие от известных способов техническим результатом является то, что солевой экстракт из измельченной хрящевой ткани последовательно диализируют против дистиллированной воды. Из освобожденного от солей раствора удаляют центрифугированием осадок солерастворимого коллагена и неагрегированных протеогликанов в присутствии лимонной кислоты. Очищенный раствор замораживают, обрабатывают двукратным объемом охлажденного до (-10) и (-15)^oС этилового спирта в присутствии ацетатов металлов. Образующийся осадок агрегатов протеогликанов отделяют центрифугированием при 2-4^oС.

Техническим результатом является новый способ получения агрегатов протеогликанов в твердом сухом виде, высокой степени очистки, исключающий их денатурацию и деполимеризацию.

Предложенный способ осуществляется следующим образом.

Хрящевые кольца трахеи крупного рогатого скота очищают от всех прилегающих к ним тканей и измельчают на мясорубке до размера частиц 1-3 мм, последовательно дважды обрабатывают 0,15 М раствором NaCl при 2-4^oС в течение трех часов каждый раз для удаления растворимых неагрегированных протеогликанов, далее экстрагируют агрегаты протеогликанов одним из трех растворов (2М СаСl₂; М Сl₂, 4 М гуанидин гидрохлорид) в течение 36-40 ч при 2-4^oС в массовом соотношении ткань раствор 1 15, экстракт отделяют, насыщают хлороформом, диализируют против дистиллированной воды до полного освобождения от солей, остатки коллагена и растворимых неагрегированных протеогликанов осаждают добавлением лимонной кислоты, образовавшийся осадок удаляют центрифугированием при 2-4^oС, центрифугат насыщают хлороформом и освобождают от лимонной кислоты диализом против дистиллированной воды при 2-4^oС, далее (I) раствор агрегатов протеогликанов обрабатывают кислой формой ионнообменной смолы для перевода агрегатов протеогликанов в кислую форму, затем солевой формой ионнообменной смолы, получают кисло-солевую форму целевого продукта, который осаждают этанолом, насыщенным ацетатом металла, получают основную-солевую форму агрегатов протеогликанов; (II) раствор агрегатов протеогликанов обрабатывают кислой формой ионнообменной смолы, получают кислую форму агрегатов протеогликанов, раствор обрабатывают этиловым спиртом, насыщенным ацетатом металла и получают основную-солевую форму агрегатов протеогликанов. В I варианте кисло-солевую форму агрегатов протеогликанов лиофилизируют непосредственно из раствора. В I и во II вариантах образовавшийся осадок основной-солевой формы агрегатов протеогликанов собирают центрифугированием, промывают этанолом, эфиром, окончательное высушивание осуществляют над СаСl₂ и парафином. Основную-солевую форму агрегатов протеогликанов лиофилизируют, предварительно растворив его в воде.

Идентификацию агрегатов протеогликанов осуществляют аналитическими методами по содержанию в них гексуроновых кислот (26,20% ± 1,27) (T.Bitter, H.M. Muir.Anal.Biochem. V.4,1962, p.330), аминосахара (29,40% ± 1,45) (Бычков С. М. Колесникова М.Ф. Биохимия, 1966, т.31, c.533), сульфатных групп (11,22% ± 0,45) (Бычков С. М. Фомина В.А. Т.6, 1960, с.528), белкового компонента (16,50% ± 2,30) (по Лоури).

Пример 1. Хрящевые кольца трахеи крупного рогатого скота тщательно очищают от всех прилегающих к ним тканей и измельчают на мясорубке до размера частиц 1-3 мм. Измельченную ткань (25-50 г) для удаления из нее растворимых неагрегированных протеогликанов последовательно дважды каждый раз по три часа обрабатывают 0,15 М раствором NaCl при 2-4^oС в массовом соотношении ткань раствор 115. Далее раствор над тканью отделяют декантированием или центрифугированием (3000 об/мин) при 2-4^oС. Для извлечения из хряща агрегатов протеогликанов ткань обрабатывают при 2-4^oС в течение 36-40 ч 4 М гуанидин гидрохлоридом в массовом соотношении ткань раствор 1 15. Экстракт агрегатов протеогликанов отделяют от ткани центрифугированием (3000 об/мин) при 2-4^oС. Далее к отделенному центрифугированием раствору добавляют хлороформ до насыщения и раствор диализируют против дистиллированной воды до полного освобождения от соли. Из отдеализированного раствора коллаген и остатки растворимых неарегированных протеогликанов удаляют добавлением лимонной кислоты до концентрации 0,01 М, рН 4,0-5,0. Образовавшийся после добавления лимонной кислоты в растворе осадок удаляют центрифугированием при 3500-4000 об/мин в течение одного часа при 2-4^oС. Очищенный раствор агрегатов протеогликанов насыщают хлороформом и освобождают от лимонной кислоты диализом против дистиллированной воды в течение 24 ч при 2-4^oС. Далее раствор агрегатов протеогликанов обрабатывают ионнообменной смолой Н⁺-формой (рН 2,0-3,0) для перевода агрегатов протеогликанов в кислую форму. После этого раствор, содержащий кислую форму агрегатов протеогликанов, обрабатывают Na⁺-формой ионнообменной смолы, получают кисло-солевую форму целевого продукта. Целевой продукт осаждают из предварительно замороженного раствора 2-3 объемами 96,6^o этилового спирта, насыщенного ацетатом натрия, предварительно охлажденного до (-10)-(15)^oС и получают основную-солевую форму агрегатов протеогликанов. Смесь оставляют на 24-48 ч для концентрации осадка при 2-4^oС. Осадок собирают на центрифуге (3000 об/мин) при 2-4^oС, промывают один раз 80% и трижды 96,6^o этанолом, охлажденным до (-10) (-15)^oС, и три раза наркозным эфиром. Окончательное высушивание осуществляют над СаСl₂ и парафином в вакууме. Выход агрегатов протеогликанов в виде твердого сухого препарата натриевой соли составляет 8-12% сырой массы исходной ткани. При необходимости кисло-солевую форму агрегатов протеогликанов лиофилизируют непосредственно из раствора, а основную-солевую форму агрегатов протеогликанов лиофилизируют предварительно растворив в воде сухой продукт.

Пример 2. Хрящевые кольца трахеи рогатого скота тщательно очищают от всех прилегающих к ним тканей и измельчают на мясорубке до размера частиц 1-3 мм. Измельченную ткань (25-30 г) для удаления из нее растворимых неагрегированных протеогликанов последовательно дважды каждый раз по три часа обрабатывают 0,15 М раствором NaCl при 2-4^oС в массовом соотношении ткань раствор 1 15. Далее раствор над тканью отделяют декантированием или центрифугированием (3000 об/мин) при 2-4^oС. Для извлечения из хряща агрегатов протеогликанов ткань обрабатывают при 2-4^oС в течение 36-40 ч 2 М СаСl₂ в массовом соотношении ткань раствор 1 15. Экстракт агрегатов протеогликанов отделяют от ткани центрифугированием (3000 об/мин) при 2-4^oС. Далее к отделенному центрифугированием раствору добавляют хлороформ до насыщения и раствор диализируют против дистиллированной воды до полного освобождения от соли. Из отдиализированного раствора коллаген и остатки растворимых неагрегированных протеогликанов удаляют добавлением лимонной кислоты до концентрации 0,01 М, рН 4,0-5,0. Образовавшийся после добавления лимонной кислоты в растворе осадок удаляют центрифугированием при 3500-4000 об/мин в течение одного часа при 2-4^oС. Очищенный раствор агрегатов протеогликанов насыщают хлороформом и освобождают от лимонной кислоты диализом против дистиллированной воды в течение 24 ч при температуре 2-4^oС. Далее раствор агрегатов протеогликанов обрабатывают ионнообменной смолой Н⁺-формой (рН 2,0-3,0) для перевода агрегатов протеогликанов в кислую форму. Целевой продукт осаждают из предварительно замороженного раствора агрегатов протеогликанов 2-3 объемами 96,6^o этилового спирта, насыщенного ацетатом калия, предварительно охлажденного до (-10)-(-15)^oС, и получают основную-солевую форму агрегатов протеогликанов. Смесь оставляют на 24-48 ч для концентрации осадка при 2-4^oС. Остаток собирают на центрифуге (3000 об/мин) при 2-4^oС, промывают один раз 80% и трижды 96,6^o, охлажденным до (-10)-(-15)^oС этанолом и три раза наркозным эфиром. Окончательное высушивание осуществляют над СаСl₂ и парафином в вакууме. При необходимости основную-солевую форму лиофилизируют из предварительно растворенного в воде сухого целевого продукта.

Выход агрегатов протеогликанов в виде твердого сухого продукта составляет 8-12% сырой массы исходной ткани.

Данный способ позволяет получать агрегаты протеогликанов в твердом сухом виде и использовать их в составе лекарственных препаратов, применяемых для лечения заболеваний кожи (диатез, аллергия, псориаз и др.) и травм роговицы.

Формула изобретения

1. Способ получения агрегатов протеогликанов из соединительной ткани животного путем измельчения ткани, экстрагирования раствором концентрированной соли, диализа экстракта, удаления растворимого коллагена с последующей очисткой целевого продукта, отличающийся тем, что диализ проводят до полного удаления солей, добавляют к диализату лимонную кислоту для одновременного удаления растворимого коллагена и неагрегированных протеогликанов, повторно проводят диализ, в начале обрабатывают кислой формой ионообменной смолы, затем солевой формой ионообменной смолы, получают кислую солевую форму целевого продукта, которую затем обрабатывают этиловым спиртом, насыщенным ацетатом металла, получают основную солевую форму агрегатов протеогликанов.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что кисло-солевую и основную солевую формы агрегатов протеогликанов лиофилизируют.

3. Способ получения агрегатов протеогликанов из соединительной ткани животного путем измельчения ткани, экстрагирования раствором концентрированной соли, диализа экстракта, удаления растворимого коллагена с последующей очисткой целевого продукта, отличающийся тем, что диализ проводят до полного удаления солей, добавляют к диализату лимонную кислоту, для одновременного удаления растворимого коллагена и неагрегированных протеогликанов, повторяют диализ, диализат обрабатывают кислой формой ионообменной смолы, получают раствор, содержащий кислую форму агрегатов протеогликанов, раствор обрабатывают этиловым спиртом, насыщенным ацетатом металла и получают основную солевую форму агрегатов протеогликанов.

4. Способ по п.3, отличающийся тем, что основную солевую форму лиофилизируют.