Способ получения человеческого лейкоцитарного интерферона

 

Изобретение относится к медицинской промышленности, в частности к производству человеческого лейкоцитарного интерферона. Способ предусматривает выделение лейкоцитов, их суспендирование в питательной среде, индукцию, биосинтез интерферона, инактивацию вируса-индуктора. Для повышения выхода интерферона и обеспечения стабильных показателей активности препарата, для индукции лейкоцитов используют холодоадаптированный вирус болезни Ньюкасл, полученный при последовательных до 30 пассажей, в развивающихся куриных эмбрионах при температуре ниже 35°С. Изобретение обеспечивает повышение выхода интерферона.

Изобретение относится к медицинской промышленности, в частности к производству человеческого лейкоцитарного интерферона.

Известен способ получения человеческого лейкоцитарного интерферона, в котором для индукции используют аллантоисный вирус болезни Ньюкасл, очищенный и концентрированный методом ультрафильтрации на мембранах с размером пор 0,1 - 0,45 мМ (1).

Способ осуществляется следующим образом.

Осветленную вируссодержащую аллантоисную жидкость подают на микрофильтрационные мембраны VVPP или GVLP или HVLP (Миллипор, США) с порогом отсечения 0,1 или 0,2 или 0,45 мМ соответственно, заправленные в плоскорамную разделительную установку и концентрируют не менее чем в 40 раз, затем проводят диафильтрацию концентрата вируса в постоянном объеме 8-10 объемами 0,9% хлористого натрия. Суспендируют лейкоциты в 199 среде, содержащей необходимые добавки, и добавляют очищенный концентрат вируса-индуктора к лейкоцитам, из расчета 2 - 4 ГАЕ на 1000000 лейкоцитов, инкубируют взвесь при 37^oC в течение 18 - 20 часов, постоянно перемешивая. Затем лейкоциты удаляют центрифугированием, а надосадочную жидкость, содержащую интерферон, подкисляют 10% соляной кислотой до pH 2,2 - 2,4. Выдерживают подкисленный полуфабрикат интерферона в течение 10 дней для инактивации вируса-индуктора. Противовирусная активность полученного таким способом интерферона составляет 8 - 10000 МЕ в мл. Этот метод позволяют исключить из технологии этап центрифугирования после стадии индукции и вести биосинтез интерферона одновременно с индукцией без смены питательной среды. Однако полученный этим способом интерферон характеризуется нестабильными значениями титра активности, а используемый индуктор обладает высокой инфекционностью, что вызывает гибель до 40% клеток-продуцентов интерферона уже в первый час после добавления вируса.

Задачей изобретения является повышение выхода интерферона и обеспечение стабильных показателей активности препарата.

Для решения поставленной задачи в способе получения интерферона, включающем выделение лейкоцитов, их суспендирование в питательной среде, индукцию, биосинтез интерферона, инактивацию вируса-индуктора, согласно изобретению для индукции используют холодоадаптированный вирус болезни Ньюкасл, полученный при последовательных до 30 пассажей, в развивающихся куриных эмбрионах при температуре ниже 35^oC.

Предлагаемый метод позволяет получить интерферон со стабильными значениями титра противовирусной активности 11000 - 14000 МЕ/мл, и снизить процент гибели интерферонпродуцирующих клеток на стадии индукции до 25%.

Способ осуществляется следующим образом.

Пример 1. Вирус маточного штамма "Н" болезни Ньюкасл пассировали 19 раз при пониженной до 32^oC температуре. Полученный вирус приобрел признаки температурочувствительности и холодоадаптированности. Для получения производственного штамма в аллантоисную полость 9-10 дневного куриного эмбриона вводят с соблюдением условий стерильности 0,2 мл исходной суспензии маточного холодоадаптированного вируса болезни Ньюкасл, в разведении 10^-6. Инкубируют в течение 48 часов при температуре (32±0,5)^oC. После инкубации эмбрионы охлаждают в течение 18 - 20 часов при 4^oC, отсасывают вируссодержащую аллантоисную жидкость. Вируссодержащую жидкость после осветления, пропускают, через микрофильтрационные мембраны, с порогом отсечения 0,1 или 0,2 или 0,45 мМ (Миллипор США) и концентрируют, не менее чем в 40 раз, проводят диафильтрацию концентрата вируса в постоянном объеме 8 - 10 объемами 0,9 % хлористого натрия. Лейкоциты суспендируют в 199 среде и добавляют очищенный концентрат вируса - индуктора. Индуцирующая доза вируса составляет 4,9 ГАЕ на 1000000 лейкоцитов. Взвесь инкубируют в течение 18 - 20 часов, при постоянном перемешивании, затем лейкоциты удаляют центрифугированием. Надосадочную жидкость, содержащую интерферон, подкисляют 10% соляной кислотой до pH 2,2 - 2,4. Полуфабрикат интерферона выдерживают 10 дней для инактивации вируса - индуктора. Титр, полученного таким способом интерферона a-типа, составляет 14000 МЕ/мл, процент гибели интерферонпродуцирующих клеток на стадии индукции не более 25%.

Пример 2. Вирус маточного штамма "Н" болезни Ньюкасл пассировали 19 раз при пониженной до 31,5 ^oC температуре. Полученный вирус приобрел признаки температурочувствительности и холодоадаптированности. Для получения производственного штамма в аллантоисную полость 9 - 10 дневного куриного эмбриона вводят с соблюдением условий стерильности 0,2 мл исходной суспензии маточного холодоадаптированного вируса болезни Ньюкасл, в разведении 10^-6. Инкубируют в течение 48 часов при температуре (32± 0,5)^oC. После инкубации эмбрионы охлаждают в течение 18-20 часов при 4^oC. Выруссодержащую жидкость после осветления, пропускают через микрофильтрационные мембраны, с порогом отсечения 0,1 или 0,2 или 0,45 мМ (Миллипор, США), и концентрируют, не менее чем в 40 раз, проводят диафильтрацию концентрата вируса в постоянном объеме 8 - 10 объемами 0,9% хлористого натрия. Лейкоциты суспендируют в 199 среде и добавляют очищенный концентрат вируса-индуктора. Индуцирующая доза вируса составляет 4 ГАЕ на 1000000 лейкоцитов Взвесь инкубируют в течение 18 - 20 часов, при постоянном перемешивании, затем лейкоциты удаляют центрифугированием. Надосадочную жидкость, содержащую интерферон, подкисляют 10% соляной кислотой до pH 2,2 - 2,4. Полуфабрикат интерферона выдерживают 10 дней для инактивации вируса-индуктора. Титр, полученного таким способом интерферона a-типа, составляет 11000 МЕ/мл, процент гибели интерферонпродуцирующих клеток на стадии индукции не более 25%.

Источник информации 1. Патент РФ N 2066188, кл. A 61 K 37/66, 1996 г.

Формула изобретения

Способ получения человеческого лейкоцитарного интерферона, включающий выделение лейкоцитов, их суспендирование в питательной среде, индукцию аллантоисным вирусом болезни Ньюкасл, биосинтез интерферона, инактивацию вируса-индуктора, отличающийся тем, что для индукции используют холодоадаптированный вариант вируса болезни Ньюкасл, полученный при последовательных до 30 пассажей, в развивающихся куриных эмбрионах при температуре ниже 35^oС.

MM4A - Досрочное прекращение действия патента СССР или патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 07.07.2007

Извещение опубликовано: 10.02.2009        БИ: 04/2009

---