Модулятор клеточного иммунитета

 

Изобретение относится к медицине, а именно к фармакологии, к классу препаратов, воздействующих на иммунную систему. Сущность изобретения состоит в том, что предложенный препарат представляет собой водный экстракт из смеси 30-40 вес. ч. свежих листьев герани, 1-5 вес.ч. сухих листьев подорожника, 1-5 вес. ч. календулы на 300 вес.ч. воды. Предлагаемый экстракт может быть использован как иммуномодулятор и, кроме того, может быть использован для профилактики и лечения опухолей, вирусных и бактериальных инфекционных заболеваний, и таким образом существенно расширяет спектр использования. 2 ил. , 1 табл.

Изобретение относится к медицинe, а конкретно к фармакологии, к классу препаратов, воздействующих на иммунную систему.

К иммуномодуляторам относят только те вещества, которые специфически воздействуют на систему клеточного или гуморального иммунитета в целом, причем это воздействие не является только фоном или одним из результатов общего воздействия на организм (как у многих адаптогенов, тонизирующих, антисептических и других средств).

Иммунная система человека постоянно является объектом пристального изучения и переосмысления новых знаний. Принято различать гуморальный (определяемый циркулирующими в крови антителами и уровнем их продукции) и клеточный (определяемый составом отдельных субпопуляций лимфоцитов и их функциональной активностью) иммунитет.

Механизмы клеточного иммунитета изучены не полностью, однако во всяком случае известно, что клетки-медиаторы иммунного ответа способны к многообразным реакциям при взаимодействии с различными антигенами; они включают размножение клонов клеток со специфической чувствительностью к данному антигену, образование и размножение клеток, осуществляющих разнообразные иммунные функции, включая продукцию антител и реакции против чужеродных клеток, в том числе опухолевых.

Качественные и количественные характеристики ответа зависят от многих факторов, включая гормоны тимуса и надпочечников, интерферонов и других медиаторов клеточного ответа, таких как гистамин, серотонин, простагландины.

В соответствии с изложенным и сами иммуномодуляторы принято подразделять на модуляторы клеточного гуморального ответа.

Для полноты взгляда упомянем наиболее известные иммуномодуляторы животного происхождения, получаемые при экстракции и концентрировании тканевых культуральных жидкостей, состоящих из стимулированных митогенами лимфоидных или миелоидных клеток животных или человека. Это иммуномодуляторы, относящиеся к одной из трех групп: интерфероны, интерлейкины, кортикостероиды и лейкотриены.

В настоящее время все большее внимание уделяется препаратам растительного происхождения. Большие традиции в лечении травами, вытяжками грибов и растениями имеются в тибетской медицине, Китае, Японии и Корее, в народной медицине вообще.

Из растений, обладающих общим воздействием на организм, затрагивающих иммунную систему, наиболее изучены иммуностимулирующие свойства известных адаптогенов, таких как женьшень, элеутероккок, китайский лимонник, родиола розовая.

Водные и водно-спиртовые экстракты этих растений, полученные по традиционным хорошо разработанным методикам, однако, далеко не всегда можно назвать иммуномодуляторами, только, возможно, указав какие-либо дополнительные их характеристики, при которых будет доказано, что иммунная реакция есть прямое следствие их воздействия непосредственно на иммунную систему.

Поэтому для характеристики подобных иммуномодуляторов на основе известных компонентов наравне с традиционными характеристиками могут быть использованы новые выявленные "нетрадиционные" характеристики.

Известны иммуномодуляторы клеточного иммунитета на основе растительного сырья, представляющие собой их водные и/или водно-спиртовые экстракты: растения рода Buxacea (PCT N 95/23606); растения рода Epimeduim violaceum Morr. et decne (PCT 82/03771); растения рода Gymnospermae, Monocotyledoneae, Dicotyledoneae, Algae, Fungi (EBP пат. 0384798); мицелий гриба Coriolus versikalov Lentinus edodes Ganoderma lucidum Ganoderma applanatum (Купин В.И. Назад в будущее, М., 111 с.) и др.

Любой из указанных аналогов может быть принят за прототип.

Однако имеется настоятельная задача поиска новых эффективных иммуномодуляторов из отечественного природного сырья как широкого профиля, так и для лечения определенных заболеваний, различающихся по типу воздействия на иммунную систему, в частности поиск иммуномодуляторов клеточного ответа.

Задача решается тем, что предлагается модулятор клеточного иммунитета, представляющий собой водный экстракт растительного сырья, отличием которого является то, что водный экстракт получен из смеси растений: свежих листьев герани (Geranium), сухих листьев подорожника (Plantago) и календулы (Calendula), взятых в следующих соотношениях, вес. ч.: Герань - 30 - 40 Подорожник - 1 - 5 Календула - 1 - 5 Вода - 300, при этом сухой остаток экстракта составляет не менее 4,5 мг/мл, экстракт ингибирует на 50% пролиферацию делящихся клеток в разведении не менее чем 1: 50 и повышает в разведении 1:200 цитотоксическую активность T-лимфоцитов, моноцитов, нейтрофилов не менее чем на 20%.

Экстракт получают путем настаивания смеси указанных растений при температуре 15-25^oC в течение 3-15 дней, после чего экстракт фильтруют, стерилизуют и хранят при температуре 4^oC.

Используемые для экстракции растения хорошо известны. Водные настои герани используют в медицине для восстановления и повышения работоспособности как растение, обладающее успокаивающим запахом (Иванченко В.А. Растения и работоспособность.- М.: Знание, 1984 г.). Водные настои календулы и подорожника применяются в сборах и самостоятельно для лечения и профилактики многих заболеваний, таких как аритмия, блефарит, гепатит, гипертоническая болезнь, стоматит, тромбофлебит (календула), дерматит, дизентерия (подорожник), мозоли, ожоги, ранозаживление (календула, подорожник) и др. (Лекарственные растения в научной и народной медицине, Саратов: изд-во Саратовского университета, 1967 г.).

Указанная совокупность признаков является существенной и ранее не описанной. В частности, положительный результат достигается только при использовании свежесобранных листьев герани.

Неожиданно было установлено также, что вышеуказанные характеристики патентуемых составов являются их интегральными показателями качества и однозначно связаны с проявлением ими целевых свойств иммуномодуляторов. Поясним это.

Иммунный ответ могут вызывать или запускать различные клетки иммунной системы, однако для данной смеси лекарственного сырья заявитель установил, что препарат будет активен in vivo, если в опытах in vitro он будет активировать цитотоксическую активность T-лимфоцитов, моноцитов и нейтрофилов (см. фиг. 1).

Эмпирически было установлено также, что активные препараты должны проявлять неспецифическую цитотоксическую активность (ингибируют пролиферацию делящихся клеток) в разведении не менее чем 1:50 (IC50 - 1:50) (фиг. 2), при этом сухой остаток экстрактов должен составлять не менее чем 4,5 мг/мл.

Активаторная активность в отношении клеток иммунной системы оценивалась с использованием известных методик, описанных в (J.Immunol. Meth. 1984, 68, 205-211; 1988, 108, 255-264; 1979, 29, 17-22; Scand. J.Clin Lab. Invest., 1968, 21 (Suppl. 97), 51-71), а неспецифическая цитотоксичность измерялась по методике (Cancer Res. 1988, 48, 589-601).

Для всех заявленных препаратов была получена острая токсичность для животных при в/б введении. Для этого препарат вводили в различных дозах и оценивали выживаемость животных через 24 ч. Было установлено, что LD_50/24 лежит в диапазоне 5,5-28 мл/кг, следовательно, по классификации ВОЗ экстракты относятся к нетоксичным веществам.

Способ получения экстракта иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Приготовление растительного экстракта.

В стеклянный сосуд вносят 360 г свежих листьев Geranium robertanium, 25 г сухих листьев Plantago lanceolata, 25 г сухих листьев Calendula officinales, и 3 л воды.

Герметически закрыв сосуд, настаивают листья в течение 8 дней при комнатной температуре (около 23^oC), при одно- или многократных ежедневных помешиваниях.

По окончании мaцерации смесь отжимают и полученный водный раствор подвергают центрифугированию, а затем фильтрованию через фильтр 0,22 мкм и бактериологическому контролю.

При этом состав характеризуется следующими характеристиками:
1) сухой остаток составляет 4,5 мг/мл;
2) экстракт ингибирует пролиферацию опухолевых клеток человека различных линий (QOS, Im9, SKOV3, SKVLB и др.) и нормальных стимулированных митогенами лимфоцитов в разведении 1:10-1:50;
3) повышает цитотоксическую активность T-лимфоцитов, моноцитов, нейтрофилов в соотношении мишень:эффектор 1:20 на 50-100% при разведении экстракта 1:200.

Приготовленный таким способом растительный экстракт хранится при температуре 4^oC.

Пример 2. Готовят растительный экстракт согласно примеру 1, но соотношение растительных компонентов при этом составляет 300:10:10 соответственно. Экстракцию проводили при температуре 15^oC в течение 3 дней.

При этом состав характеризуется следующими характеристиками:
1) cухой остаток составляет 4,6;
2) экстракт ингибирует пролиферацию клеток в разведении 1:50;
3) повышает цитотоксическую активность T-лимфоцитов, моноцитов, нейтрофилов в соотношении мишень:эффектор 1:10 при разведении 1:200 на 75%.

Пример 3. Приготовление растительного экстракта то же, что и в примере 1, однако соотношение компонентов составляет 400:50:50, экстракцию проводят при 25^oC в течение 15 дней.

Измеряемые свойства следующие:
1) 4,7;
2) 1:40;
3) активация происходила при соотношении мишень:эффектор 1:10 - 1:40 при разведении экстракта 1:200 на 38%.

Пример 4. Иммуномодулирующие свойства экстрактов, полученных по примерам 1-3.

Иммуномодулирующие свойства полученных экстрактов оценивались по общепринятой методике, заключающейся в предварительном воздействии препаратом на здоровых животных и оценке устойчивости действия иммунной системы организма после повреждающего воздействия. С этой целью препараты вводили мышам линии BALB/c (10 мышей в каждой группе и в контроле) ежедневно в течение трех недель, в/ж, 8 раз в день по 0,05 мл. После этого введение препарата прекращали. Затем контрольным и опытным животным вводили суспензию опухолевых клеток линии Sp 2/0 подкожно в область спины (0,5 млн в 0,1 мл). За развитием опухолей наблюдали в течение 90 суток. Результаты представлены в таблице.

Контроль N 1 и N 2 (см. таблицу) представляют собой составы, полученные по предлагаемой рецептуре, однако их свойства составляют соответственно следующие величины: сухие остатки 3,5 и 2,4 мг/мл, неспецифическая токсичность наблюдалась только в разведении 1:10 и отсутствовала уже при разведении 1: 20, препараты оказались неактивными in vitro в отношении указанных клеток иммунной системы при разведении 1:50, 1:100 и 1:200.

Данные таблицы свидетельствуют о высокой противоопухолевой эффективности профилактического введения препаратов по предлагаемому изобретению, причем необходимо отметить, что заявителем были изучены более 50 различных рецептур по предлагаемому изобретению, при этом наблюдалась полная корреляция заявляемых параметров экстрактов с иммуномодулирующими свойствами, наблюдаемыми in vivo.

Предполагается, что новый экстракт может быть использован как иммуномодулятор широкого профиля, однако одна из наиболее перспективных областей его использования является онкология, т.к. патентуемый состав показал также свою иммуномодулирующую активность на животных и добровольцах на некоторых видах уже развившихся опухолей в виде ингибирования их развития и остановке роста.

Формула изобретения

Модулятор клеточного иммунитета, представляющий собой водный экстракт растительного сырья, отличающийся тем, что водный экстракт получен из смеси растений: свежих листьев герани (Geranium), сухих листьев подорожника (Plantago) и календулы (Calendula), взятые в следующих соотношениях, вес.ч.:
Свежие листья герани - 30 - 40
Сухие листья подорожника - 1 - 5
Календула - 1 - 5
Вода - 300

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3