Штамм гриба nectria pityrodes montagne, используемый в качестве биофунгицида (варианты), биофунгицид, способ его получения (варианты), способ подавления грибковой инфекции у растений, метод скрининга фунгицидных микроорганизмов

 

Изобретение относится к биологическим методам борьбы с болезнями растений. Получены новые штаммы грибов вида Nectria pityrodes Montagne DSM 7522, 8805, 8806, 8807, 8808, используемые в качестве биофунгицида. На основе штаммов создан биофунгицид, содержащий вышеуказанные штаммы и наполнитель. Последний выбирают из группы, включающей двуокись кремния, сухое молоко, карбоксиметилцеллюлозу, сахарозу, аскорбиновую кислоту. Разработан метод скрининга фунгицидных микроорганизмов, заключающийся в том, что семена растений высевают в песок, на семена и песок наносят мицелий и споры патогена, смесь засыпают песком, выдерживают до получения ростков растений. Исследуют ростки на интенсивность их поражения фитопатогеном и отбраковывают грибки, не влияющие на развитие болезни или сами оказавшиеся патогенными. Семена зерновых культур инфицируют патогенными грибками и засевают отобранными на первом этапе грибками. Обработанные семена высевают в торф, выращивают, а затем исследуют ростки и отбирают изоляты, подавляющие развитие патогенных грибков. Изобретение позволяет получить эффективное средство борьбы с болезнями растений. 10 с. и 2 з.п. ф-лы, 3 ил., 20 табл.

Предметом настоящего изобретения являются биологические методы борьбы с болезнями растений и, в частности, новые микроорганизмы, относящиеся к роду Nectria, а также их применение для борьбы с грибковыми инфекциями у растений. Кроме того, данное изобретение относится к составам, включающим новые штаммы рода Nictria и используемым для указанной цели. Настоящим изобретением предусматривается метод скрининг-теста эффективных организмов в микробных штаммах, выделенных из почвы.

Сельскохозяйственные культуры подвержены различным болезням, вызываемым грибками, бактериями и вирусами, и могут быть поражены рядом насекомых-вредителей. Для борьбы с такими болезнями разработаны методы культивации, химические и биологические методы. Эти методы направлены на предотвращение качественных и количественных потерь сельскохозяйственных культур вследствие болезней и поражения насекомыми-вредителями.

Как правило, термин "биологическая борьба с болезнями растений" означает уничтожение патогенов растений другими организмами, которые можно назвать биоконтролирующими агентами (БКА). Продукты, вырабатываемые биоконтролирующими агентами, часто называют биопестицидами. Механизмы биологической борьбы с болезнями растений могут быть весьма различны, и желаемый эффект часто достигается в результате совместного действия нескольких разных механизмов. Эффект подавления может быть вызван ингибирующими метаболитами, образуемыми биоконтролирующими агентами, которые иногда паразитируют на патогене или борются с ним за жизненное пространство и/или питательные вещества.

Потребность разработки биоконтролирующих агентов еще больше возросла в связи с тем, что многие традиционные химические контролирующие агенты оказались вредными для окружающей среды и людей. Недостатком химикатов является также то, что многие вредители быстро приобретают иммунитет к одному и даже нескольким контролирующим средствам. Выработка иммунитета к биопестицидам маловероятна, так как в основе их действия лежат механизмы разных типов. Химикаты обычно оказывают более быстрое и эффективное действие, чем биопестициды. С другой стороны, действие биопестицидов часто бывает более продолжительным, чем у химикатов, так как производимый ими эффект создается жизнеспособными и воспроизводимыми микроорганизмами.

Наиболее важную группу биопестицидов составляют бактериальные продукты, оказывающие целенаправленное действие на насекомых-вредителей. Наиболее распространенными являются биоинсектициды на основе бактерий Bacillus thuringiensis. В Финляндии производится биофунгицид на основе актиномицета Streptomyces, который эффективен против ряда грибковых болезней растений, источником которых являются почва и семена. Продукт, который предотвращает распространение корневой гнили (вызываемой грибком Heterobasidion annosum) в хвойных лесах, был получен из безвредного лесного гнилостного грибка Phlebia gigantea.

Были всесторонне изучены бактерии рода Pseudomonas, в частности вида Pseudomonas fluorescens, и в настоящее время известно большое число штаммов P. fluorescens, обладающих фунгицидным действием. См., например, опубликованные заявки на патент WO 92/18613, FI 921722 и WO 90/01327, a также европейский патент N 228457.

В процессе поиска микроорганизмов, пригодных для биологической борьбы, обычно производится тестирование большого числа микробных штаммов с целью выявления их биоконтролирующей активности или других нужных свойств. В опубликованных патентах рассматриваются некоторые методы скрининг-теста.

В патенте США N 4647533 рассматривается трехэтапный метод скрининг-теста, в соответствии с которым бактерии сначала выделяют из почвы, содержащей множество спор болезнетворного грибка Pythium. На втором этапе выделенные бактерии подвергают скрининг-тесту в теплице путем проращивания семян зерновых культур в почве, содержащей большое количество спор Pythium, при этом тестируют каждый вид бактерий и проводят контрольный тест без этих бактерий. На основании теста отбирают бактерии, в присутствии которых растения достигают наибольшей высоты и имеют наиболее развитые листья. На третьем этапе отобранные бактерии еще раз проходят отбор в полевых условиях при проведении такого же испытания, что и в теплице. Кроме того, на третьем этапе отбирают те бактерии, в присутствии которых растения растут лучше всего.

В заявке на патент Финляндии N 921722 описывается следующий способ. Сначала в соответствующей среде выращивают мицелий штамма Pythium. Этот мицелий покрывают слоем стерильной почвы, в которую добавляют исследуемые микроорганизмы, после чего оценивают их воздействие на рост грибка Pythium. На втором этапе почвенный образец инокулируют штаммом Pythium, вызывающим ризоктиниоз. В почву высевают семена растения, восприимчивого к этой грибковой инфекции, и определяют влияние испытуемого организма на рост растений. Для последующих испытаний отбирают такие вещества, которые оказывают ингибирующее действие на грибок Pythium в обоих вышеуказанных испытаниях.

Предметом настоящего изобретения являются микроорганизмы рода Nectria, в частности Nectria pityrodes Montagne, которые оказались весьма эффективными для борьбы с грибками Fusarium.

Кроме того, данное изобретение относятся к биофунгицидному составу на основе микробного штамма, который содержит в качестве активного ингредиента вышеуказанные грибковые штаммы, принадлежащие к роду Nectria, а также известные добавки или наполнители. Примерами таких препаратов являются составы, пригодные для протравливания семян, порошкообразные или гранулированные составы, вносимые в субстраты, необходимые для роста, или жидкие составы, предназначенные для обработки почвы.

Настоящим изобретением предусматривается также новый и эффективный способ скрининг-теста грибковых штаммов, представляющий собой трехэтапное испытание, включающее тестирование в песке, торфе и полевой почве. На каждом этапе испытания грибковые штаммы, оказавшиеся неэффективными, исключают из последующих тестов. Грибковые штаммы, показавшие наилучшие результаты в теплице, затем испытывают в полевых условиях.

Фиг. 1 - эксперимент по выявлению реакции на дозу при использовании штамма J76 летом 1992 г. Процент пораженных ростков при инокулировании семян грибками F.culmorum.

K = обработка не производилась, B = протравливание составом "Байтан", J76-0 = суспензия спор J76, 1,2·10⁷ КОЕ/мл J76-1 = суспензия спор J76, 1,2·10⁶ КОЕ/мл J76-2 = суспензия спор J76, 1,2·10⁵ КОЕ/мл J76-3 = суспензия спор J76, 1,4·10⁴ КОЕ/мл Фиг. 2 - эксперимент по выявлению реакции на дозу при использовании штамма J76 летом 1992 г. Процент пораженных ростков при использовании здоровых семян. Используемые аббревиатуры аналогичны фиг. 1.

Фиг. 3a - 3d - гистрограммы, представляющие результаты воздействия грибковых изолятов, забракованных на различных этапах испытаний, проведенных в теплице, на состояние ростков в полевых условиях.

K = обработка не производилась, B = протравливание составом "Байтан 1", Подробное описание изобретения.

Ниже дается детальное описание грибковых штаммов по настоящему изобретению. Приводятся данные об их выделении, подробно рассматриваются штаммы и указывается их эффективность в полевых условиях. Далее рассматриваются способы получения биофунгицидных составов из этих штаммов, характеристики составов и испытания эффективности этих составов. Помимо этого описывается метод скрининг-теста грибковых штаммов, выделенных из почвенных образцов.

Выделение микроорганизмов.

Почвенные образцы, из которых выделяли грибковые штаммы по настоящему изобретению, отбирали в 1989, 1990 и 1991 гг. Их общее количество составляло 190. Почвенные образцы разных типов и из севооборотов различной ротации брали в разных частях Финляндии, главным образом с научно-исследовательских станций Сельскохозяйственного научно-исследовательского центра. Образцы брали из корневого слоя (с глубины 0-15 см). С каждого слоя брали несколько аналитических образцов, которые делили на части от 1 до 2 л.

Выделение микроорганизмов производили по методу разбавления (выделение из почвы) или по методу культивирования на растениях (выделение из корней). Полученные результаты подробно описываются ниже в разделе "Методы".

Характеристика микроорганизмов Грибковые штаммы, выделенные из почвенных образцов, испытывали с помощью метода скрининг-теста по настоящему изобретению, которое описывается ниже в разделе "Методы". Было обнаружено пять штаммов, которые позволили получить очень хорошие результаты. Штаммы, названные J76, J1431, J1432, MOS1 и ROS2, были отправлены на исследование в Центральное управление сельскохозяйственных культур, г. Баарн, Нидерланды. В соответствии с Будапештским договором эти штаммы были внесены в банк данных DSM (Deutsch Sammlung von Microorganismes und Zellkulturen GmbH) под номерами DSM 7522 (15 марта 1993 г.), DSM 8805 (10 декабря 1993 г.), DSM 8806 (10 декабря 1993 г.), DSM 8807 (10 декабря 1993 г.) и DSM 8808 (10 декабря 1993 г.).

Эти микроорганизмы имеют следующие морфологические характеристики.

Морфология: спороходий без краевых стерильных гифов. Периодические ответвления конидиофор при наличии нескольких ответвлений в каждом узле. Конечные ответвления содержат мутовки фиалид, образующиеся в столбчатом слое. Фиалиды имеют цилиндрическую форму длиной до 15 мкм с апикальными порами. Конидии в виде цепей или слизистых шариков эллипсоидной или каплеобразной формы с коротким хилусом, 7-8х4 мкм, гладкостенные без отростков.

Характер развития колонии: колония на агаре из овсяных хлопьев увеличилась в диаметре до 40 см в течение 7 дней при температуре 22^oC; гиалин мицелия, спорообразующие участки покрыты зелеными, концентрическими кольцами спороходия. Запах отсутствует, колония обесцветилась, эксудат ограничен, светлый.

Структура конидиофора штамма J76 аналогична структуре Myrothecium verrucaria, но отличается от этого вида образованием неграничного спороходия, наличием конидий в виде сухих цепей и без типичного веерообразного отростка.

Представители рода Gliocladium отличаются от новых штаммов тем, что для рода Gliocladium типично образование отдельных кистеобразных конидиофоров.

Таким образом, штаммы J76, J1431, J1432, MOS1 и ROS2 были идентифицированы в качестве видов Nectria pityrodes Montagne.

Из этих штаммов можно получить устойчивые составы, которые легко наносятся на пораженные болезнью посевы. Состав можно получить в виде порошка. Культивирование микробов может быть начато с инокулята, который представляет собой содержащую споры пеллету (лепешку) картофельного агара с глюкозой, выдерживаемую при температуре -80^oC. Микробы можно культивировать в жидкой среде или на твердой подложке. Питательная среда включает сахар, например сахарозу, и азот, а также небольшие количества других питательных веществ. Для культивирования микробов можно использовать неспецифические питательные среды, например кукурузный экстракт, или специфические питательные среды, например ГДС (глюкоза 4 г/л, дрожжевой экстракт 4 г/л, солодовый экстракт 10 г/л) или картофельно-декстрозный бульон. Показатель pH равен примерно 6,0 и регулируется вначале до стерилизации. Культивирование производится при встряхивании в течение одной-двух недель. Биомассу можно отделить от бульона путем фильтрования черев фильтровальную бумагу или центрифугирования. Если культивирование производят в жидкой среде, к биомассе примешивают наполнитель, например двуокись кремния, сухое молоко и/или карбоксиметилцеллюлозу (КМЦ). Эту массу сушат при комнатной температуре и измельчают в порошок.

Методы
Выделение микробов.

a). Метод разбавления (выделение из почвы).

10 г почвы смешивали со 100 мл 0,5% водного раствора агара (бактоагар). Из этой смеси отбирали три 10 мл пробы и из каждой из них готовили два разведения (10^-1 и 10^-2) в 0,5% водном растворе агара. Разбавленные пробы встряхивали (в водяной бане) в шейкере в течение 20-30 мин. 1 мл разведения помещали с помощью пипетки на пустую чашку Петри и добавляли 20 мл агара из бычьей желчи Литмана. Эти чашки инкубировали при комнатной температуре в течение 3-7 дней, после чего в чистые культуры на картофельном агаре с глюкозой вводили индивидуальные грибки.

b). Метод культивирования на растениях (выделение из корней).

15 горшков в виде матрицы с последовательным расположением (матрица с последовательно расположенными 50 мл горшками Vefi-VP) заполняли почвой одного образца. В один горшок высевали четыре семени пшеницы, ячменя или примерно 15 семян репы, причем для каждого вида растений использовали пять горшков. Семена покрывали песком, поливали и инкубировали в камере для выращивания при температуре +15^oC с 14-часовым световым периодом. После двух недель культивирования растения вытаскивали и промывали в проточной воде или очищали сухой щеткой. От корней отрезали маленькие кусочки и клали на плоские чашки. Используемые среды: агар из бычьей желчи Литмана (10 г пептона, 10 г декстрозы, 15 г бычьей бактожелчи, 0,01 г B-кристаллического фиолетового красителя, 0,03 г стрептомицина, 20 г агара и 1000 мл воды), PCNB (15 г пептона, 1 г KH₂PO₄, 0,5 г MgSO₄·7H₂O, 2 г авикола, 3 части на миллион стрептомицина, 20 г агара и 1000 мл воды), картофельно-декстрозный агар со стрептомицином (39 мг картофельного агара с декстрозой, 300 ч. на миллион стрептомицина и 1000 мл воды). Через несколько дней инкубирования выделяли отдельные грибки и инокулировали на плоские чашки картофельного агара с декстрозой. Штаммы хранили на пеллетах картофельного агара с декстрозой в ампулах (Nalgene 5000-0012, стерильный пирофосфат 1,2 мл) при температуре -80^oC.

Проведение испытаний в теплице по методу скрининг-теста
Испытание в песке.

Семена зерновой культуры высевали в слой песка. На эти семена и субстрат, необходимый для роста, с помощью пипетки наносили сначала мицелий и споры патогена в водной суспензии, a затем споры испытуемого грибка, после чего семена покрывали песком. Через две с половиной недели проверяли интенсивность проявления симптомов болезни. Из последующих испытаний исключали грибки, которые не влияли на интенсивность болезни, или сами оказались патогенными.

Испытание в торфе.

Семена зерновой культуры замачивали в суспензии спор патогена и сушили. После этого семена смачивали в суспензии спор испытуемого грибка, сушили и высевали. В качестве субстрата, необходимого для роста, использовали пропаренный торф. Черев две с половиной недели культивирования проверяли состояние ростков. Штаммы грибков, которые препятствовали возникновению болезни, отбирали для испытаний в полевой почве.

Испытания в полевой почве.

Измельченную и увлажненную полевую почву помещали в горшки емкостью 1,5 л и в каждый горшок высевали 36 семян зерновых культур. Перед посевом семена обрабатывали так же, как при испытании в торфе, причем использовали по 3 репликатных горшка для каждой обработки. Симптомы болезни у ростков проверяли черев четыре недели культивирования.

Штаммы, показавшие хорошие результаты в этих испытаниях, отбирали для полевых испытаний, которые позволили окончательно определить биопестицидную эффективность микробных изолятов.

Патогенность грибковых штаммов.

Экспериментальным путем проверяли возможные вредные воздействия грибкового штамма J76. Полученные результаты показали, что этот грибок не оказывает патогенного действия на растения. Испытания проводились в отношении растений 33 видов.

Экспериментальная часть.

Следующие эксперименты иллюстрируют возможности применения настоящего изобретения. В разделе (A) рассматривается использование суспензий пор Nectria pityrodes штаммов J76, J1431, J1432, MOS1 и ROS2 по этому изобретению для борьбы с болезнями растений, вызываемыми главным образом видом Fusarium spp. В разделе (B) описывается способ получения и использования составов на основе этих штаммов. В разделе (C) рассматриваются эксперименты, с помощью которых исследовали действие, оказываемое грибковым штаммом J76, и в разделе (D) приводится осуществление и оценка метода скрининг-теста по настоящему изобретению.

(A) Использование грибковых штаммов в виде суспензий спор
Эксперименты с суспензией спор штамма J76.

Летом 1992 г. на трех испытательных площадках проверяли воздействие суспензии спор штамма J76. В этих испытаниях использовали семена двух разных зерновых культур: семена пшеницы, искусственного инокулированные Fusarium culmorum, и семена ячменя, зараженные Finivale естественным путем.

Результаты испытаний в отношении пшеницы приведены в табл. 1. Показатели урожайности искусственно инокулированной пшеницы даны в табл. 2.

Результаты проверки ростков ячменя представлены в табл. 3. Эта болезнь не оказала статистически значимого влияния на урожайность ячменя.

Испытание по выявлению реакции на дозу штамма J76, проведенное летом 1992 г.

Поскольку штамм J76 продемонстрировал действительно хорошие результаты во время опытов, проведенных в начале лета 1992 г., было исследовано воздействие этого штамма в зависимости от дозы на зерновую культуру, посеянную в начале лета. Использовали как здоровые семена пшеницы, так и семена, искусственно инокулированные Fusarium culmorum.

Этот эксперимент проводили на небольших делянках площадью 2 м². Вели наблюдение за появлением всходов и проявлением симптомов болезни у ростков. Образцы ростков для проверки развития болезни брали через четыре равных периода времени. Образцы для каждой обработки брали с четырех делянок, посев на которых был произведен отдельно для каждого времени отбора образцов. Количество ростков указано в табл. 4, а процентные значения пораженных ростков приведены в табл. 5 отдельно для пораженных и здоровых семян. Данные, представленные в табл. 5, графически показаны на фиг. 1 и 2.

Полевые опыты с использованием суспензии спор J76, проведенные летом 1993 г.

Эти опыты были проведены на научно-исследовательских станциях Хокиойнен, Метиойнен и Палкане. В опытах использовали образцы семян шести типов:
пшеница "Luja", зараженная грибками F.culmorum естественным путем;
пшеница "Luja", искусственно инокулированная грибком F.cilmorum;
пшеница "Luja", незараженная;
пшеница "Laari", незараженная;
ячмень "Kustaa, зараженный разными грибками Fusarium и Bipolaris sorokiniana естественным путем;
овес "Yty", зараженный грибком F. avenaccum естественным путем.

Здоровые семена были посеяны только в Хокиойнене; в отношении других четырех образцов семян опыты проводились в каждом из трех испытательных районов. Для проведения опытов делянки 10 м² засевали шестью дублированными образцами, предназначенными для каждой обработки.

Все образцы семян подвергали аналогичной обработке:
K = необработанные контрольные семена;
B = химически обработанные семена, протравленные составом "Байтан 1";
J76S = суспензия спор J76 из культуры на плоских чашках (8,4·10⁹ КОЕ/кг семян).

В табл. 6 приведены значения интенсивности поражения болезнью отдельно для каждой обработки и образцов семян. Показатели урожайности суммированы в табл. 7.

Испытание штамма J76 в отношении воздействия на твердую головню пшеницы и гниль корневой шейки ячменя.

Летом 1993 г. штамм J76 был включен в полевые опыты, в ходе которых десять химических фунгицидов, используемых для протравливания семян зерновых культур, испытывали в отношении воздействия на твердую головню пшеницы (вызываемую грибком Tilletia caries). Штамм J76 применяли в виде суспензии конидий, а химикаты - в соответствии с инструкциями по использованию. Опыты проводили на делянках площадью 0,1 м² при пятикратном дублировании (табл. 8).

В состав "Байтан" активным ингредиентом был триадименол. Состав "Байтан 1" представлял собой смесь, которая включала триадименол и имазалил. Состав "Тайссато S" содержал карбоксил и имазалил. Активным ингредиентом в составе "Паноктин" являлся квазатин.

Во время полевых опытов по испытанию химикатов в отношении уничтожения гнили корневой шейки ячменя (вызываемой Bipolaris sorokiniana) также производили обработку семян спорами J76. Опыты проводили на делянках площадью 10 м² с четырехкратным дублированием. Не было обнаружено никаких различий в появлении всходов при различных обработках. Штамм J76 позволил в значительной степени устранить симптомы болезни (табл. 9), хотя этот патоген сильно отличается от грибков Fusarium, для борьбы с которыми он был выбран.

(B) Препараты, полученные из грибковых штаммов, эффективность их применения в полевых опытах
Порошкообразные составы из грибкового штамма J76 были получены следующим образом.

Состав 1
Культивирование производили в колбе Эрленмейера емкостью 1 л, в которую помещали 0,5 л питательной среды, содержащей 4 г/л сахарозы, 4 г/л дрожжевого экстракта и 10 г/л солодового экстракта. Показатель pH доводили до 6,0 перед стерилизацией в автоклаве. В качестве инокулята использовали пеллету агара со спорами, которую хранили при температуре -80^oC (картофельно-декстрозный агар). Скорость вращения шейкера равнялась 150 оборотам в минуту, культуру выращивали при комнатной температуре (22^oC) и период культивирования составлял от 7 до 12 дней. Клетки отделяли фильтрованием через фильтровальную бумагу. С биомассой (клеточной) смешивали SiO₂, сухое молоко и карбоксиметилцеллюлозу в следующих количествах,%:
Биомасса - 20
Двуокись кремния - 55
Сухое молоко - 15
Карбоксиметилцеллюза (7%-ный водный раствор) - 10
Эту смесь в течение 2 дней сушили на открытых чашках Петри при комнатной температуре в стерильной атмосфере. Толщина слоя составляла 1-2 см. Высушенную смесь измельчали в порошок. Жизнеспособность препарата равнялась 10⁷ КОЕ/г .

КОЕ (колониеобразущая единица) - это единица, которая используется для определения жизнеспособности микробов.

Разбавленную суспензию микробов помещали на плоские чашки агара и через несколько дней подсчитывали колонии. Если известна степень разведения, можно высчитать количество колоний или количество микробных клеток в первоначальном образце.

Состав 2
Клетки культивировали так же, как при получении состава 1, после чего с биомассой смешивали SiO₂, сухое молоко, карбоксиметилцеллюлозу и аскорбиновую кислоту в следующих количествах,%:
Биомасса - 60
SiO₂ - 20
Сухое молоко - 14
Карбоксиметилцеллюлоза (7%) - 3
Аскорбиновая кислота - 3
Эту смесь сушили так же, как при получении состава 1, и измельчали в порошок. Жизнеспособность этого препарата составила 10⁷ КОЕ/г.

Состав 3
Клетки культивировали так же, как при получении состава 1, после чего с клеточной биомассой смешивали сахарозу и крахмал в следующих количествах,%:
Биомасса - 20
Сахароза - 25
Крахмал - 55
Эту смесь сушили так же, как при получении состава 1, и измельчали в порошок. Жизнеспособность этого препарата составила 10⁷ КОЕ/г.

Состав 4
Штамм J76 культивировали в твердой питательной среде с наполнителем из SiO₂. В качестве питательного бульона использовали 8%-ный солодовый экстракт (Мальтакс MP10, Lahden Polttimo). 120 г питательного бульона смешивали в химическом стакане с 50 г порошкообразного силикагеля и на 20 мин помещали в автоклав при температуре 120^oC. Охлажденную среду инокулировали 10 г суспензии спор J76, которую получали путем соскабливания спор с чашки картофельного агара с глюкозой в стерильную воду. Эту среду инкубировали в течение 20 дней при температуре 16^oC, после чего ее 2 дня сушили при комнатной температуре. Жизнеспособность сухого препарата составила 10⁷ КОЕ/г.

Остальные штаммы по настоящему изобретению можно получить аналогичным образом.

Эффективность применения порошкообразных составов в полевых опытах.

Рассматриваемые ниже опыты проводились Институтом защиты растений в Сельскохозяйственном научно-исследовательском центре Финляндии летом 1993 г. при использовании порошкообразного состава штамма J76. Эти опыты проводились в Сельскохозяйственном научно-исследовательском центре в Хокиойнене, Миетойнене и Палкане. При проведении этих опытов использовали образцы семян шести видов:
пшеница "Luja", зараженная грибком F.culmorum естественным путем;
пшеница "Luja", искусственно инокулированная грибком F.culmorum;
пшеница "Luja", незараженная;
пшеница "Laari", незараженная;
ячмень "Kustaa", зараженный разными грибками Fusarium и грибком Bipolaris sorokiniana естественным путем;
овес "Yty", зараженный грибком F.avenaceum естественным путем.

Образцы здоровой пшеницы сеяли только в Хокиойнене, а опыты с четырьмя другими образцами семян проводили на всех трех испытательных участках. В ходе опытов засевали делянки площадью 10 м² с шестикратным дублированием для каждой обработки.

Все образцы семян подвергали одинаковой обработке:
K = необработанные контрольные семена;
B = химически обработанные контрольные семена, протравленные составом "Байтан 1";
J76PK = порошкообразный состав J76, используемый в виде сухой протравки (8,4·10⁸ КОЕ/кг = наибольшее количество, поглощаемое семенами);
J76PN = порошкообразный состав J76, используемый в виде жидкой протравки (8,4·10⁸ КОЕ/кг).

В табл. 10 приведены величины интенсивности поражения болезнью отдельно для каждой обработки и образцов семян. Показатели урожайности суммированы в табл. 11.

Кроме того, в 1993 г. проводили испытания по эффективности воздействия составов, полученных из штамма J76, на разные грибки. Результаты этих экспериментов приведены в табл. 12 - 18.

Результаты экспериментов по выявлению эффективности воздействия пяти штаммов Nectria pityrodes по настоящему изобретению (J76, J1431, MOS1 и ROS2) на грибок Fusarium culmorum, поражающий пшеницу, приведены в табл. 18. Результаты даны в виде средних значений, полученных в двух экспериментах, в одном из которых в качестве субстрата использовали торф, а в другом - полевую почву.

(C) Характер воздействия штамма J76
Предварительные исследования характера воздействия штамма J76 в качестве антагониста других грибков производили с помощью микроскопа и лабораторных испытаний.

Наблюдения под микроскопом позволили установить, что гифы J76 взаимодействуют с грибком F. culmorum и первые отчетливо воспринимаемые реакции происходят очень быстро. В местах соприкосновения мицелия клетки гифов грибка Fusarium начинают разлагаться примерно через час после взаимодействия. Сначала клеточные стенки теряют свою форму, затем исчезает содержимое клеток и, наконец, полностью разлагаются клеточные стенки. Процесс разложения гифов грибка Fusarium медленно распространяется. При выращивании смеси J76 и F.culmorum в течение нескольких дней гифы грибка Fusarium полностью пропадают. Под действием штамма J76 разлагаются также споры этого грибка (как конидии, так и хламидоспоры), но медленнее, чем гифы. Обычно гифы штамма J76 свободно обволакивают споры грибка Fusarium до их разложения. Проникновение штамма J76 в гифы грибка Fusarium не наблюдалось.

На основании наблюдений под микроскопом был сделан вывод о том, что штамм J76 скорее всего выделяет в окружающую среду биологически активные вещества. По своей природе они могут быть подобны ферментам или антибиотикам. Действие штамма J76 может быть связано с выработкой именно таких веществ, так как не было обнаружено признаков его паразитирования на других грибках, и вследствие медленного роста он не может эффективно бороться за питательные вещества. При выполнении испытаний на целлофане были также высказаны предположения о выделении этим грибком метаболитов, действующих на рост других грибков.

При выращивании штамма J76 и F.culmorum в непосредственной близости друг от друга на очень тонком субстрате формируется зона ингибирования, в которой прекращается рост грибка Fusarium. На субстрате нормальной толщины такой эффект обнаружен не был. Это, вероятно, связано с диффузией в субстрат выделяемых веществ в небольших концентрациях. Кроме того, было установлено, что летучие вещества, выделяемые штаммом J76, также замедляют рост грибка F.culmorum.

Испытание на целлофане: на субстрат, необходимый для роста, помещали целлофановую пленку, на которой культивировали штамм J76. После культивирования в течение 10 дней пленку вместе со штаммом J76 удаляли. Вещества, выделенные штаммом J76 и прошедшие через пленку, оставались в субстрате. В качестве контрольных образцов использовали чашки, в которые помещали целлофановую пленку без штамма J76. Результаты испытания на целлофане приведены в табл. 19.

(D) Выполнение метода скрининг-теста и оценка полученных результатов
Испытания в песке.

Субстрат для посева.

В качестве субстрата для посева использовали песок с размером зерен 0,2-0,7 мм (Kauniston Sora Oy, Loimaa). Песок увлажняли путем смешивания 4 ч. песка с 1 ч. воды. Из матрицы последовательно расположенных горшков (Vefi-VP 96) вырезали пластину размером 5х7 горшков (емкостью 50 мл), которую помещали в пластиковый ящик. Горшки наполняли увлажненным песком так, чтобы он не доходил до верхнего края на 1-1,5 см. В каждый горшок высевали по три зерна яровой пшеницы "Luja".

Обработка
Заражение грибком Fusarium culmorum. Грибок F.culmorum выращивали на чашках картофельного агара с декстрозой при комнатной температуре в течение 1 месяца (до полного спорообразования). Мицелий со спорами отделяли от чашки и смешивали с дистиллированной водой при помощи гомогенизатора "Ультра-Турракс". Количество спор доводили до 10⁶ спор/мл. Этот раствор замораживали в виде 30 мл порций в мешках "Мини-грип" до -20^oC. Для проведения испытаний замороженные растворы оттаивали и вновь смешивали. Этот раствор использовали как есть (основной раствор) и в виде разбавления до 10^-2. Патогенность штаммов Fusarium сохраняли путем последовательного заражения им растений (семена пшеницы инокулировали суспензией грибка Fusarium, после чего патоген вновь выделяли из пораженных ростков).

Суспензия антагониста. Пеллету картофельного агара с декстрозой, содержащую антагонист, брали из морозильной камеры, делили на три части и помещали на три чашки картофельного агара с декстрозой. Чашки инкубировали при комнатной температуре (в темноте) в течение трех недель. Основной раствор суспензии антагониста готовили путем соскабливания содержимого из двух чашек с антагонистом в 50 мл дистиллированной воды. Полученную смесь перемешивали с помощью гомогенизатора "Ультра-Турракс". Из основного раствора готовили два раствора - разведения до 10^-1 и 10^-3.

Обработка семян. На посеянные в горшки семена с помощью пипетки наносили сначала 1 мл суспензии F.culmorum, а затем 1 мл суспензии антагониста. 15 семян в пяти 50 мл горшках обрабатывали всеми шестью комбинациями суспензий с разной плотностью спор (два разведения суспензии F.culmorum x три разведения суспензии антагониста).

Контрольная обработка. Для тестирования одного грибка использовали пять горшков, в которые дополнительно высевали 15 семян и обрабатывали только основным раствором испытуемого грибка.

В испытаниях на песке одновременно тестировали от 15 до 30 грибковых штаммов. В день начала испытаний также производили посев в горшки, которые служили для проверки состояния семян и патогенности инокулята F.culmorum. Контрольные семена, посеянные в отдельную матрицу горшков, подвергали трем обработкам, которые включали: без инокуляции (только вода), инокуляцию основным раствором F.culmorum и инокуляцию разбавленным основным раствором F. culmorum (10^-2). Каждую из этих трех обработок производили в отношении 30 семян, посеянных в 10 горшков.

Условия роста.

После нанесения с помощью пипетки грибковых суспензий семена покрывали увлажненным песком. Ящики с горшками заворачивали в прозрачный пластик и переносили в камеру для выращивания (температура 10-15^oC, 14-часовой световой период).

Наблюдения.

После выращивания проростков в течение 16-18 дней их тщательно промывали в проточной водопроводной воде и исследовали симптомы болезни. Ростки, у которых корневые или колеоптильные клетки побурели, и непроросшие семена, оставшиеся твердыми, считались здоровыми. Ростки с отчетливыми симптомами болезни и непроросшие семена, которые стали мягкими, были признаны больными.

Первыми исследовали растения, подвергавшиеся контрольной обработке. Если из семян, обработанных водой, развились только здоровые растения, и у семян, обработанных патогеном, наблюдались четко выраженные симптомы болезни, результаты испытания считались действительными и производилась проверка растений, обработанных грибковыми штаммами.

При испытании в песке оценку, присваиваемую каждому выделенному грибковому штамму, определяли, исходя из количества обработанных им растений, которые оказались больными. Если всхожесть растений, обработанных испытуемым грибком, была значительно меньше, чем у контрольных здоровых растений, или были обнаружены симптомы другой болезни, этот грибок считался непригодным для дальнейших исследований. Если поражения отсутствовали, каждую из шести комбинаций плотности спор патогена и спор испытуемого грибка оценивали отдельно по следующей шкале:
0 = все 15 растений здоровы
1 = не более 2 пораженных растений
2 = 3-5 пораженных растений
3 = 6-9 пораженных растений
4 = 10-13 пораженных растений
5 = не более одного здорового растения
На основании шести вышеуказанных оценок выбирали грибковые штаммы, которые использовали на следующем этапе испытаний, т.е. в испытаниях в торфе. Для последующих испытаний были отобраны также штаммы, которые не менее трех раз получали оценки 0 и 1. Если грибок не получил ни одной оценки 0, его отбирали для последующих исследований, если он получал не менее четырех раз - оценку 1.

Испытания в торфе
Субстрат для выращивания.

В качестве субстрата для выращивания использовали пропаренный, удобренный и известкованный торф. До осени 1992 г. применяли непросеянный неочищенный торф из Торронсуо, а затем просеянный неочищенный торф из Эруахоки. (Внесение удобрений: 800 г доломитовой извести и 100 г удобрения Y-lannos /100 л торфа (Y-lannos = торговая марка, означающая финское универсальное удобрение). Увлажненный торф помещали в пластиковые ящики (28,5х49,5х9,4 см. ящик "Hammut" компании Weibulls Robusta, Muoviyhtyma Oy) в виде слоя толщиной 5 см. На дно ящика клали пластиковую пленку.

Обработка.

T = Здоровые, неинокулированные семена яровой пшеницы "Luja". Полив производили дистиллированной водой.

F = Семена, инокулированные грибком F.culmorum. Семена вымачивали в основном растворе F.culmorum (раствор использовали в избыточном количестве), содержащем примерно 10⁶ спор/мл (культивирование грибка Fusarium, сравни с испытанием в песке). После обработки семена рассыпали на бумаге и оставляли для высушивания на ночь.

F0 = Инокулирование грибком F.culmorum производили так же, как в случае обработки F. Когда семена высыхали, их смачивали основным раствором антагониста. Основной раствор получали путем соскабливания мицелия и спор из одной чашки антагониста в 25 мл дистиллированной воды. Обработку производили посредством встряхивания семян и раствора антагониста в маленькой пластиковой склянке. После обработки семена сушили на бумаге.

F2 = Инокулирование грибком F.culmorum производили так же, как в случае обработки F. Обработку антагонистом выполняли так же, как в случае обработки F0, с использованием основного раствора антагониста, разбавленного до 10^-2.

В торфе делали 10 рядков, в каждый из которых высевали по 30 семян. Посев производили в следующей последовательности: защитный ряд, F, F0, F2, T, F, F0, F2, T, защитный ряд. После посева семена покрывали торфом, который увлажняли.

Условия роста.

Посеянные семена выращивали в теплице при температуре около 15^oC. В темное время года при помощи лампы с несколькими нитями накаливания создавали дополнительное освещение в течение 12 часов/день. При необходимости посеянные семена смачивали водой. Период культивирования составлял 18 дней.

Сортировка.

Ростки промывали и определяли у них симптомы болезни аналогично тому, как это делали после испытания в песке. На основании результатов наблюдений, полученных после обработок T и F, принимали решение о достоверности испытания. У здоровых контрольных растений (T) не допускалось наличие более 12 пораженных растений (из 60 посеянных семян), а в контрольной группе (F), зараженной патогеном, должно было быть не менее 52 пораженных растений (из 60 семян). Испытуемый грибковый штамм считался приемлемым для следующего этапа испытаний (опыты в полевой почве), если из семян (60 семян), обработанных раствором, имеющим одну из двух концентраций, развивалось не более 19 пораженных растений.

Испытания в полевой почве
Субстрат для посева.

Используемую почву (песчаная глина) брали с опытного поля в Хокиойнене. Почву измельчали руками или (зимой 1992-1993 г.г.) просеивали через грохот с отверстиями размером 1х1 см. Пластиковые горшки емкостью 1,5 л (диаметром 14 см) заполняли почвой так, чтобы верхний край оставался пустым на высоту 3-4 см. На дно горшка клали фильтровальную бумагу.

Обработка.

1. Здоровые семена. Смоченные только дистиллированной водой.

2. Контрольная группа, обработанная грибком Fusarium. Семена смачивали инокулянтом Fusarium (препарат, используемый в испытаниях в песке), содержащим 10⁶ спор/мл; этот раствор использовали в избыточном количестве.

3. Инокулирование, произведенное так же, как в контрольной группе, обработанной грибком Fusarium. После высыхания семян их обрабатывали суспензией антагониста, которую получали путем смешивания мицелия и спор из одной чашки с 25 мл дистиллированной воды. Обработку производили в пластиковой склянке, куда помещали 130 семян (120-150 семян) и 1 мл (или 1,5 мл) суспензии антагониста.

4. Контрольная группа, обработанная фунгицидом. Инокулирование производили так же, как в контрольной группе, обработанной Fusarium. После высыхания семена обрабатывали 2 г протравливающего порошка "Байтан 1" на один кг семян. Кроме того, производили ранее применявшиеся обработки составами "Серезан" и "Тайссато S".

В горшки высевали по 36 обработанных семян, по три дубликата на каждую обработку. Посеянные семена покрывали полевой почвой. Условия роста были такими же, как при испытании в торфе. Период культивирования составлял четыре недели.

Проверка и сортировка.

Ростки промывали и оценивали у них симптомы болезни:
0 = полностью здоровые растения,
1 = незначительное поражение грибком Fusarium;
2 = от среднего до сильного поражения болезнью;
3 = ростки полностью побурели - гибель растений.

Эффективность испытаний в теплице
Летом 1993 г. был проведен один широкомасштабный полевой опыт по проверке метода скрининг-теста по настоящему изобретению. В ходе этого испытания проверяли, правильно ли были выбраны для дальнейшего тестирования грибковые штаммы, выделенные во время серии опытов, проведенных между октябрем 1991 г. и февралем 1993 г. Для обработки семян произвольно выбирали 60 штаммов из тех, которые были отвергнуты при испытаниях в песке, но не оказали патогенного воздействия на пшеницу. Из штаммов, забракованных во время испытаний в торфе, отобрали 92 штамма. Были отобраны все 58 грибков, использовавшихся во время испытаний в почве. 43 грибка были забракованы во время этого испытания и 15 были отобраны для полевых опытов.

Помимо вышеуказанных 210 обработок испытание включало 6 контрольных обработок: необработанные семена (K), протравление составом "Байтан 1" (B) и четыре грибковых штамма, исследованных в предыдущих испытаниях, в том числе J76.

В этом испытании использовали пшеницу "Luja", зараженную грибком F. culmorum естественным путем. Наблюдения за рядом длиной 1,4 м, в котором было посеяно 5,5 г семян. Для выполнения всех 216 обработок было посеяно шесть дублирующих рядов. Рендомизация достигалась с помощью кубической решетки экспериментальной конструкции. Таким образом, уменьшали ошибочные вариации, связанные с почвенными факторами. Через пять недель после посева ростки выкапывали из почвы, подсчитывали и исследовали симптомы болезни.

Результаты испытания иллюстрируют четыре гистрограммы, приведенные на фиг. 3a - 3d. Между изолятами, забракованными во время испытания в торфе, и непатогенными изолятами, забракованными во время испытания в песке, не было обнаружено никаких различий. Испытание в торфе дало очень хорошие результаты. Штаммы, отобранные после него для последующих испытаний, были в среднем гораздо лучше, чем отвергнутые в ходе испытания грибки.

Во время испытаний в песке и торфе неправильно было забраковано всего несколько грибков. С другой стороны, при испытании в почве отвергнуто достаточно большое количество очень хороших изолятов, но из тех изолятов, которые были отобраны для полевых опытов, лишь два из 15 показали отрицательные результаты в естественных условиях.

На основании полученных результатов можно сделать вывод о том, что испытания в песке и торфе позволяют надежно отобрать лучшие антагонисты для дальнейших исследований, а вот во время испытаний в полевой почве могут быть забракованы даже хорошие антагонисты.

Отборочные испытания грибкового штамма J1431
Из грибковых штаммов по настоящему изобретению штамм J1431 исследовали во всех трех отборочных испытаниях, выполненных в теплице.

При испытании в песке штамм J1431 получил оценки 0, 0, 1, 1, 1 и 2 и был отобран для последующих испытаний.

При испытании в торфе с использованием штамма J1431 были получены следующие результаты:
T: 3 пораженных растения
F: 36 пораженных растений
F0: 3 пораженных растения
F2: 7 пораженных растений
Во время испытаний в полевой почве с использованием штамма J1431 при выполнении разных обработок были получены следующие значения пораженных ростков,%:
Здоровые растения - 66
Контрольная группа, обработанная грибком Fusarium - 87
Протравление составом "Байтан 1" - 31
J1431 - 19
На основании отборочных испытаний, проведенных летом 1993 г., штамм J1431 был отобран для полевых опытов вместе с 61 другим грибковым штаммом. В этом испытании использовали яровую пшеницу "Luja", искусственно инокулированную суспензией спор грибка F.culmorum. Семена высевали на однорядных делянках (1,4 м) при шестикратном дублировании этого опыта. Через 34 дня после посева ростки выкапывали из почвы, промывали и определяли симптомы болезни. При разных обработках было получено указанное ниже количество здоровых ростков на метр ряда:
Контрольная группа, обработанная грибком Fusarium - 5,9
Протравление составом "Байтан 1" - 56
J76 - 61
J1431 - 65
Другие испытанные штаммы - 30-38
Отборочные испытания грибкового штамма J1432
Штамм J1432 исследовали во всех трех отборочных испытаниях, выполненных в теплице.

При испытании в песке штамм J1432 получили оценки 0, 0, 0, 1, 1 и 2 и был отобран для последующих испытаний.

При испытании в торфе с использованием штамма J1432 были получены следующие результаты:
T: 10 пораженных растений
F: 60 пораженных растений
F0: 10 пораженных растений
F2: 37 пораженных растений
Во время испытания в полевой почве с использованием штамма J1432 при разных обработках были получены следующие значения пораженных ростков,%:
Здоровые растения - 56
Контрольная группа, обработанная грибком Fusarium - 98
Протравление составом "Байтан 1" - 18
J1432 - 38
На основании результатов испытания в полевой почве штамм J1432 был изъят из полевых опытов.

Микроорганизмы, внесенные в банк данных
На основании Будапештского договора следующие микроорганизмы (см. табл. 20) были внесены в банк данных по адресу DSM-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Maseheroder Weg 1b, D-38124 Брауншвейг, Германия.

Формула изобретения

1. Штамм гриба Nectria pityrodes Montagne DSM 7522, используемый в качестве биофунгицида.

2. Штамм гриба Nectria pityrodes Montagne DSM 8805, используемый в качестве биофунгицида.

3. Штамм гриба Nectria pityrodes Montagne DSM 8806, используемый в качестве биофунгицида.

4. Штамм гриба Nectria pityrodes Montagne DSM 8807, используемый в качестве биофунгицида.

5. Штамм гриба Nectria pityrodes Montagne DSM 8808, используемый в качестве биофунгицида.

6. Биофунгицид, содержащий микроорганизм, отличающийся тем, что он содержит грибковый штамм, выбираемый из группы, включающей грибковые штаммы Nectria pityrodes Montagne DSM 7522, или DSM 8805, или DSM 8806, или DSM 8807, или DSM 8808.

7. Биофунгицид по п.6, отличающийся тем, что он дополнительно содержит наполнители и/или добавки, обычные в этой области.

8. Биофунгицид по п.7, отличающийся тем, что наполнители и добавки выбирают из группы, включающей двуокись кремния, сухое молоко, карбоксиметилцеллюлозу, сахарозу, аскорбиновую кислоту и крахмал.

9. Способ получения биофунгицида по п. 7 или 8, отличающийся тем, что включает выращивание грибкового штамма по любому из пп.1-5 в приемлемой ростовой среде, отделение клеточной массы, добавление к ней наполнителей и/или добавок, высушивание и измельчение этой массы в порошок.

10. Способ получения биофунгицида по п. 7 или 8, отличающийся тем, что включает выращивание грибкового штамма по любому из пп.1-5 в приемлемой среде вместе с двуокисью кремния и добавление при желании наполнителей и/или добавок, высушивание и измельчение этой массы в порошок.

11. Способ подавления грибковой инфекции у растений, включающий нанесение на растение или его семена или внесение в субстрат для роста растения биофунгицида, отличающийся тем, что используют биофунгицид по пп.6-8.

12. Метод скрининга фунгицидных микроорганизмов в образцах микробов, включающий следующие этапы: (а) испытание в песке, в соответствии с которым семена зерновых культур высевают в слой песка, на семена и субстрат пипеткой наносят мицелий и споры патогена, а затем споры испытуемого грибка в водной суспензии, после чего семена покрывают песком, через определенный период времени проверяют интенсивность симптомов поражения ростков и отбраковывают грибки, которые не повлияли на развитие болезни или сами оказались патогенными, и (b) испытание отобранных грибков в торфе, в соответствии с которым семена зерновых культур замачивают в суспензии спор патогена и сушат, а затем смачивают суспензией спор испытуемого грибка, сушат и высевают в обработанный паром торф, выращивают в течение определенного периода времени, наблюдают за состоянием ростков и отбирают для последующих испытаний изоляты, однозначно подавляющие развитие болезни.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9, Рисунок 10, Рисунок 11, Рисунок 12, Рисунок 13

MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 28.01.2005

Извещение опубликовано: 20.04.2006        БИ: 11/2006

---