Циклопептиды, способ их получения, содержащая их фармацевтическая композиция, способ ее получения

 

Изобретение относится к новым циклопептидам формулы цикло-(nАrg-nGly-nAsp-nD-nE), где n, D, и Е имеют значения, указанные в формуле изобретения, и к фармацевтической композиции на их основе, обладающей ингибирующей активностью в отношении α_vβ₃ и/или α_vβ₅-интегринов и к способу получения фармацевтической композиции, обладающей ингибирующей активностью. Циклопептиды действуют как ингибиторы интегринов и могут быть использованы для лечения и профилактики опухолей и/или метастаза. 4 с. и 6 з.п. ф-лы.

Изобретение касается новых циклопептидов формулы I Цикло-(nArq-nGly-nAsp-nD-nE) (I), где D и E каждый независимо один от другого означает Gly, Ala, β -Ala, Asn, Asp, Asp(OR), Arg, Cha, Cys, Gln, Glu, His, Ile, Leu, Lys, Lys(Ac), Lys(AcNH₂), Lys(AcSH), Met, Nal, Nle, Orn, Phe, 4-Hal-Phe, Homo-Phe, Phg, Pro, Pya, Ser, Thr, Tia, Tic, Trp, Tyr или Val, причем указанные аминокислотные остатки могут быть дериватизированы, R алкил с 1-18 C-атомами, Hal, F, Cl, Br, I, Ac алканоил с 1-10 атомами, ароил с 7-11 C-атомами или аралканоил с 8-12 C-атомами, n не обозначает никакого заместителя или обозначает алкильный остаток R, бензил или аралкильный остаток с 7-18 C-атомами в альфа-аминофункции соответствующего аминокислотного остатка, с тем условием, что по меньшей мере один аминокислотный остаток имеет заместитель n, причем поскольку речь идет об остатках оптически активных аминокислот и производных аминокислот, охватываются как D-, так и L -формы, а также их физиологически приемлемые соли.

Подобные соединения, не имеющие, однако, N-алкильных заместителей, известны, например, из EP 0406428 и FEBS Lett. 291, 50-54 (1991).

В основе изобретения лежит задача найти новые соединения с ценными свойствами, в частности такие, которые могут быть применены для получения лекарственных средств.

Неожиданно было найдено, что соединения формулы I и их соли обладают очень ценными свойствами. Прежде всего они действуют как ингибиторы интегрина, причем они в частности тормозят взаимодействия рецепторов интегрина β₃ или β₅ с лигандами. Особую активность соединения проявляют в случае интегринов α_vβ₃,α_vβ₅ или α₁₁β₃, но также и по отношению к рецепторам α_vβ₃α_vβ₆ и α_vβ₈. Эти действия могут быть доказаны, например, методом, описанным J.W. Smith et al in J. Biol. Chem. 265, 12267-12271 (1990). Дополнительно проявляются противовоспалительные эффекты.

Зависимость возникновения ангиогенеза от взаимодействия между сосудистыми интегринами и внеклеточными матричными протеинами описана P.C. Brooks, P.A.Clark und D.A.Cherish in Science 264, 569-71 (1994).

Возможность ингибирования взаимодействия и тем самым начала апотозиза (программируемой смерти клетки) ангиогенных сосудистых клеток циклическим пептидом описана P.C. Brooks, A.M. Montgomery, M.Rosenfeld, R.A.Reisfeld, T. -Hu, G.Klier und D.A.Cherish in Cell. 79, 1157-64 (1994).

Соединения формулы I, блокирующие взаимодействие рецепторов интегрина с лигандами, как, например, фибриногеном у рецептора фибриногена (циклопротеин IIb/IIIa), препятствуют в качестве GPIIb/IIIa-антагонистов распространению опухолевых клеток метастазом. Это подтверждается следующими наблюдениями: Соединения могут тормозить присоединение металлопротеиназ к интегринам и препятствовать настолько, что клетки могут использовать ферментативную активность протеиназы. Пример этого можно усмотреть в затрудняемости присоединения MMP-2 (матриксметаллопротеиназа-2) к витронектин-рецептору α_vβ₃ цикло-RGD-пептидом, как описано у P. C. Brooks et al. in Cell 85, 683-693 (1996).

Распространение опухолевых клеток от локальной опухоли в сосудистую систему происходит путем образования микроагрегатов (микротромбов) вследствие взаимодействия опухолевых клеток с кровяными пластинками. Опухолевые клетки экранируются защитой в микроагрегате и не распознаются клетками иммунной системы.

Микроагрегаты могут закрепляться на стенках сосудов, благодаря чему облегчается дальнейшее проникновение опухолевых клеток в ткань. Так как образованию микротромбов способствует связывание фибриногена с рецепторами фибриногена на активированных кровяных пластинках, то GPIIa/IIIb-антагонисты могут рассматриваться как действенные ингибиторы метастаза.

Соединения формулы I могут далее применяться как антимикробные вещества при операциях, при которых применяются биоматериалы, имплантаты, катетеры или сердечные стимуляторы. При этом они действуют антисептически. Антимикробная эффективность может быть доказана способом, описанным P.Valentin-Weigund et al. in Infection and Immunity, 2851-2855 (1988).

Так как соединения формулы I представляют собой ингибиторы связывания фибриногена и тем самым лигандов рецепторов фибриногена на кровяных пластинках, их можно использовать как диагностические средства для обнаружения и локализации тромбов в сосудистой системе in vivo, поскольку они замещаются остатком, меченным изотопом или обнаруживаемым с помощью УФ-лучей. Способ визуализации позволяет обнаруживать и локализовать с их помощью даже опухоли (визуализация опухолей; PET).

Соединения формулы I могут применяться в качестве ингибиторов связывания фибриногена также и как эффективные вспомогательные вещества для изучения метаболизма кровяных пластинок в различных стадиях активации или внутриклеточных сигнальных механизмов рецептора фибриногена. Обнаруживаемая единица встраиваемой метки ("label"), например биотинил, позволяет после присоединения к рецептору исследовать названные механизмы.

Соединения имеют также свойство ингибировать связывание природных или искусственных лигандов с интегринами, особенно интегринами α_vβ₃,α_vβ₅,α_11bβ₃, но также и α_vβ₁,α_vβ₆ и α_vβ₈. В сравнении с уровнем техники они имеют к тому же то преимущество, что благодаря N-алкилированию одной или нескольких пептидных связей достигается метаболическая стабилизация и повышенная растворимость в жирах. Благодаря уменьшению возможных водородных мостиков, так как N-алкил не может быть H-донором для C=O, улучшается способность проникания через мембраны, так что может быть получена повышенная оральная всасываемость, к тому же может увеличиться образование протеина плазмы.

N-Алкилирование пептидной связи поднимает ингибирующую потенцию соединений и повышает селективность ингибирования в отношении определенных интегринов. В частности, на селективность можно влиять выбором положения и количества N-алкильных групп.

Соединения могут применяться в качестве действующего начала лекарственных средств в медицине и ветеринарии, в частности для профилактики и лечения заболеваний кровообращения, тромбоза, инфаркта миокарда, артериосклероза, воспалений, апоплексии, стенокардии, опухолевых заболеваний, остеолитических заболеваний, в частности остеопороза, ангиогенеза и обусловленных ангиогенезом заболеваний, как, например, диабетической ретинопатии глаз, макулярной дегенерации, миопии, окулярного гистоплазмоза, ревматического артрита, остеоартрита, рубеотической глаукомы, но также и колита, болезни Крона (Morbus Crohn), рассеянного склероза, псориаза, а также рестеноза после ангиопластии. Далее, соединения могут применяться для улучшения и поддержки процессов заживления ран при микробных инфекциях и острой почечной недостаточности.

Эти соединения могут быть обнаружены, например, с помощью известных из литературы методов, описанных, например, P. C.Brooks et al. in Cell, 79, 1157-1164 (1994) или Science 264, 569-571 (1994).

Выше- и нижеприведенные сокращения аминокислотных остатков обозначают остатки следующих аминокислот.

Abu 4-Аминомасляная кислота
Aha 6-Аминогексановая кислота
Ala Аланин
Asn Аспарагин
Asp Аспарагиновая кислота
Asp (OR) Аспарагиновая кислота ( β -эфир)
Arg Аргинин
Cha 3-Циклогексилаланин
Cit Цитрулин
Cys Цистеин
Dab 2,4-Диаминомасляная кислота
Dap 2,3-Диаминопропионовая кислота
Gln Глутамин
Glu Глутаминовая кислота
Gly Глицин
His Гистидин
Ile Изолейцин
Leu Лейцин
Lys Лизин
Lys(Ac) NΣ -Алканоиллизин
Lys(AcNH₂) NΣ -аминоалканоиллизин
Lys(AcSH) NΣ -Меркаптоалканоиллизин
Met Метионин
Nal 3-(2-Нафтил)-аланин
Nle Норлейцин
Orn Орнитин
Phe Фенилаланин
4-Hal-Phe 4-Галоген-фенилаланин
Phg Фенилглицин
Pro Пролин
Pya 3-(2-Пиридил)-аланин
Sar Саркозин (N-метилглицин)
Ser Серин
Tia 3-(2-Тиенил)-аланин
Tic Тетрагидроизохинолин-3-карбоновая кислота
Thr Треонин
Trp Триптофан
Tyr Тирозин
Val Валин.

Далее обозначают ниже:
Boc трет.-Бутоксикарбонил
Brl Бензил
DCCl Дициклогексилкарбодиимид
DMF Диметилформамид
EDCI N-Этил-N'-(3-диметиламинопропил)-карбодиимид-гидрохлорид
Et Этил
Fmoc 9-Флоренилметоксикарбонил
HoBt 1-Гидроксибензотриазол
Me Метил
Mtr 4-Метокси-2,3,6-триметилфенил-сульфонил
NMe N-метилированная α -аминогруппа
OBut Сложный трет.-бутиловый эфир
OMe Сложный метиловый эфир
OEt Сложный этиловый эфир
POA Феноксиацетил
i-Pr Изопропил
n-Pr н-Пропил
TBTU 2-(1H-Бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилуроний-тетрафторборат
TFA Трифторуксусная кислота
Поскольку вышеназванные аминокислоты встречаются в нескольких энантиомерных формах, то выше и ниже все эти формы и также их смеси (например, DL-формы) включены, например, в качестве составных частей соединений формулы I. Далее, аминокислоты, например в качестве составной части соединений формулы I, могут быть снабжены соответствующими известными сами по себе защитными группами.

Далее, изобретением охватываются также такие пептиды, аминокислотные остатки которых частично или полностью дериватизированы. Под "дериватизированы" следует понимать, что включены также и так называемые пролекарства, как, например, N-гуанидино-ацилпроизводные Arg, бета-эфиры Asp, NΣ-алканоил-, аминоалканоил-, меркаптоалканоил-производные лизина, (здесь названы лишь некоторые из них). Кроме того, аминокислотные остатки могут быть частично альфа-алкилированы или, например, для диагностических целей, мечены изотопами. Далее включены такие соединения формулы I, которые в боковых цепях звеньев D и E дополнительно дериватизированы амино-, карбокси- или меркаптогруппами, так как такого рода производные являются важными исходными соединениями для получения более высокомолекулярных конъюгатов, например для цели иммунизации и получения антител. Далее, возможно применять функциональные группы в боковой цепи определенных аминокислотных остатков или дериватизированных аминокислотных остатков для иммобилизации пептидов на полимерных материалах с целью получения аффиннохроматографических колонок или использовать функциональные группы для дериватизации с диагностическими вспомогательными реагентами, как то: флуоресцирующие заместители.

Предметом изобретения далее является способ получения соединения формулы I по п. 1 или одной из его солей, отличающийся тем, что его выделяют в свободном виде из одного из его функциональных производных обработкой сольволизирующим или гидрогенолизирующим средством или тем, что пептид формулы II
H-Z-OH (II),
где Z обозначает -nArg-nGly-nAsp-nD-nE-nGly-nAsp-nD-nE-nArg-nAsp-nD-nE-nArg-nGly-nD-nE-nArg-nGly-nAsp- или -nE-nArg-nGly-nAsp-nD-
или реакционноспособное производное такого пептида обрабатывают циклизирующим средством,
или что циклопептид, сам по себе соответствующий формуле I, но имеющий одну или несколько свободных аминогрупп, кислотных групп и/или активированные α-C-атомы, дериватизируют алкилированием, ацилированием или этерификацией
и/или что основное или кислое соединение формулы I обработкой кислотой или основанием переводят в одну из его солей.

Выше и ниже остатки D, E и n имеют указанные в формулах I и II значения, не указано ничего иного. Использованные буквы для соответствующих остатков не находятся ни в какой связи с однобуквенным кодом для аминокислот.

В вышеприведенных формулах алкил обозначает преимущественно метил, этил, изопропил, н-бутил, втор.-бутил или трет.-бутил.

Группа D преимущественно является Phe, также предпочтительно D-Phe, но также 4-Hal-Phe, особенно 4-I-Phe, а также Trp, Tyr, гомо-Phе, Nal или Phg, причем равным образом предпочтительны также и D-формы.

E является преимущественно гидрофобным аминокислотным остатком, в частности Gly, Ala, Val, Leu, Nle или Ile. Переменная n обозначает преимущественно N-метил, N-этил, N-пропил-, N-бензил- или N-изопропил-замещенные α-аминогруппы в пептиде, причем несколько аминокислотных остатков могут быть N-замещены одинаковыми или различными алкильными остатками.

В соответствии с этим являются предметом изобретения, в частности, те соединения формулы I, в которых по меньшей мере один из названных остатков имеет одно из вышеуказанных предпочтительных значений.

Предпочтительная группа соединений может быть выражена частной формулой Ia, соответствующей формуле I, в которой, однако, обозначают:
D D-Phe, Phe, D-Trp, Trp, D-Tyr, Tyr, D-гомоPhe, гомоPhe, D-Nal, Nal, D-Phg или 4-HAl-Phe (D- или L-форма) и
E Val, Gly, Ala, Leu, Ile или Nle.

Еще одна предпочтительная группа соединений может быть выражена частной формулой Ib, соответствующей формуле I, в которой, однако,
D обозначает D-Phe и
E обозначает Gly, Ala, Val, Leu, Ile или Nle и один из аминокислотных остатков Arq, Gly или Asp в α-аминогруппе имеет алкильный заместитель.

Еще одна предпочтительная группа соединений может быть выражена частной формулой Ic, соответствующей частным формулам Ia и Ib, а также формуле I, в которой, однако, один из аминокислотных остатков D или E алкилирован в α-аминогруппе.

Далее особенно предпочтительны все физиологически переносимые соли соединений, подпадающих под частные формулы Ia, Ib и Ic.

Соединения формулы I и также исходные вещества для их получения получают впрочем по известным методам, описанным в литературе (например, в стандартных трудах, как то: Houben-Weyl, Methoden der organischen Chemie, Georg-Thieme-Verlag, Stuttgart), а именно в условиях реакции, которые известны и подходящи для названных превращений. При этом можно воспользоваться известными, подробно здесь не оговариваемыми вариантами.

Исходные вещества могут, при желании, быть образованы in situ, так что их не выделяют из реакционной смеси, а тотчас же подвергают дальнейшему взаимодействию с получением соединений формулы I.

Соединения формулы I могут быть получены выделением их в свободном виде из их функциональных производных путем сольволиза, в частности гидролиза, или гидрогенолиза.

Предпочтительными исходными веществами для сольволиза или, соответственно, гидрогенолиза являются такие, которые содержат вместо одной или нескольких свободных амино- и/или гидроксигрупп соответствующие защищенные амино- и/или гидроксигруппы, предпочтительно такие, которые вместо H-атома, соединенного с N-атомом, несут одну аминозащитную группу, например такие, которые соответствуют формуле I, но вместо NH-группы содержат NHR'-группу (где R' обозначает аминозащитную группу, например BOC или CBZ).

Далее предпочтительны исходные вещества, несущие вместо H-атома гидроксильной группы гидроксизащитную группу, например такие, которые соответствуют формуле I, но вместо гидроксифенильной группы содержат R''O-фенильную группу (где R'' обозначает гидроксизащитную группу).

В молекуле исходного вещества может быть также несколько одинаковых или разных - защищенных амино- и/или гидроксигрупп. В случае, если имеющиеся защитные группы отличаются одна от другой, их можно во многих случаях селективно отщепить.

Выражение "Аминозащитная группа" в общем известно и относится к группам, пригодным для защиты (блокирования) аминогруппы от химических превращений, но которые легко могут быть удалены, после того как нужная химическая реакция проведена в другом месте молекулы. Типичны для таких групп - в частности незамещенные или замещенные ацил-, арил-, аралкоксиметил- или аралкилгруппы. Так как аминозащитные группы после прохождения желательной реакции (или серии реакций) удаляются, то их вид и величина в общем не имеют критически важного значения; предпочтительны, однако, группы, содержащие 1-20, в частности 1-8 C-атомов. Выражение "Ацильная группа" следует понимать в связи с настоящим способом в самом широком смысле. Оно охватывает ацильные группы, производные от алифатических, аралифатических, ароматических или гетероциклических карбоновых кислот или сульфоновых кислот, а также, в частности, алкоксикарбонильные, арилоксикарбонильные и прежде всего аралкоксикарбонильные группы. Примерами такого рода ацильных групп являются алканоил, как то: ацетил, пропионил, бутирил; аралканоил, как то: фенилацетил; ароил, как то: бензоил или толуоил; арилоксиалканоил, как то: POA; алкоксикарбонил, как то: метоксикарбонил, этоксикарбонил, 2,2,2-трихлорэтоксикарбонил, BOC, 2-йодэтоксикарбонил; аралкоксикарбонил, как то: CBZ ("карбобензокси"), 4-метоксибензилоксикарбонил, Fmoc; арилсульфонил, как то: Mtr. Предпочтительные аминозащитные группы - это BOC и Mtr, далее CBZ, Fmoc, бензил и ацетил.

Выражение "Гидроксизащитная группа" также общеизвестно и относится к группам, пригодным для защиты гидроксигруппы от химических превращений, но которые легко могут быть удалены после того, как нужная химическая реакция проведена в другом месте молекулы. Типичны для таких групп вышеназванные незамещенные или замещенные арил-, аралкил- или ацилгруппы, затем также алкильные группы. Природа и величина гидроксизащитных групп не являются критическими, так как после прохождения нужной химической реакции или серии реакций они снова удаляются; предпочтительны группы с 1-20, особенно с 1-10 C-атомами. Примерами гидроксизащитных групп являются, между прочим, бензил, п-нитробензоил, п-толуолсульфонил, трет.-бутил и ацетил, причем бензил и трет.-бутил особенно предпочтительны. COOH-группы в аспарагиновой и глутаминовой кислотах предпочтительно защищаются в форме их трет.-бутилэфиров (например, Asp(OBut)).

Функциональные производные соединений формулы I, применяемые в качестве исходных веществ, могут быть получены обычными методами аминокислотного и пептидного синтеза, описанными, например, в названных стандартных трудах и патентных заявках, а также, например, твердофазным методом по Меррифилду (B. F, Gysin и R.B.Merriffield, J. Am. Chem. Soc. 94, 3102 ff. (1972)).

Выделение в свободном виде соединений формулы I из их функциональных производных удается - в зависимости от примененной защитной группы - например, с сильными кислотами, предпочтительно с TFA или хлорной кислотой, но также и с другими сильными неорганическими кислотами, как то: соляной или серной кислотами, сильными органическими карбоновыми кислотами, как то: трихлоруксусная кислота, или сульфоновыми кислотами, как то: бензол- или п-толуолсульфокислоты. Присутствие дополнительного инертного растворителя возможно, но не всегда требуется. В качестве инертных растворителей годятся, как правило, органические, например, карбоновые кислоты, как то: уксусная кислота, эфиры, как то: тетрагидрофуран или диоксан, амиды, как то: диметилформамид, галогенированные углеводороды, как то: дихлорметан, затем также спирты, как то: метанол, этанол или изопропанол, а также вода. Далее могут применяться смеси вышеназванных растворителей. TFA применяется, как правило, в избытке без добавки другого растворителя, хлорная кислота в виде смеси из уксусной кислоты и 70%-ной хлорной кислоты в соотношении 9:1. Температуры реакции для отщепления целесообразно выбираются между 0 и прибл. 50^oC, как правило работают при температуре от 15 до 30^oC (комнатная температура).

Группы BOC, OBut и Mtr могут предпочтительно отщепляться с помощью TFA в дихлорметане или прибл. 3 - 5 н. HCl в диоксане при 15 - 30^oC, группа Fmoc - с помощью прибл. 5 - 50%-ного раствора диметиламина, диэтиламина или пиперидина в диметилформамиде при 15 - 30^oC.

Гидрогенолитически удаляемые защитные группы (например CBZ или бензил) могут быть отщеплены, например, обработкой водородом в присутствии катализатора (например, благородного металлического катализатора, как то: палладий, предпочтительно на носителе, например на угле). В качестве растворителя при этом годятся вышеуказанные, в частности, например, спирты, как то: метанол или этанол или амиды, как то: диметилформамид. Гидрогенолиз проводят, как правило, при температурах от 0 до 100^oC и давлениях от 1 до 200 бар, предпочтительно при 20 - 30^o и 1-10 бар. Гидрогенолиз CBZ-группы удается, например, хорошо на 5-10%-ном Pd-C в метаноле или с формиатом аммония (вместо H₂) на Pd-С в метанол/диметилформамиде при 20 - 30^oC.

Соединения формулы I могут быть получены путем циклизации соединений формулы II в условиях пептидного синтеза. При этом работают целесообразно по обычным методам пептидного синтеза, описанным, например, в Houben-Weyl, 1.c. Band 15/11, Seiten 1 bis 806 (1974).

Проведение реакции, как правило, удается в присутствии дегидратизирующего средства, например карбодиимида, как то: DCCl или EDCl, затем ангидрида пропанфосфоновой кислоты (cp. Angew. Chem. 92, 129 (1980)), дифенилфосфорилазида или 2-этокси-N-этоксикарбонил-1,2-дигидрохинолина, в инертном растворителе, например галогенированном углеводороде, как то: дихлорметан, эфире, как то: тетрагидрофуран или диоксан, амиде, как то: диметилформамид или диметилацетамид, нитриле, как то: ацетонитрил, или в смесях этих растворителей, при температурах между прибл. -10 и 40^oC, преимущественно между 0 и 30^oC. Чтобы внутримолекулярная циклизация проходила раньше межмолекулярного образования пептида, целесообразно работать в разбавленных растворах (принцип разбавления).

Вместо соединения формулы II могут быть использованы в реакции также подходящие реакционноспособные производные этих веществ, например такие, в которых реактивные группы промежуточно блокированы защитными группами. Аминокислотные производные соединений формулы II могут быть, например, применены в виде их активированных сложных эфиров, целесообразно получаемых in situ, например добавкой HOBt или N-гидроксисукцинимида.

Исходные вещества формулы II, как правило, новые. Они могут быть получены известными методами, например вышеуказанными методами пептидного синтеза и отщепления защитных групп.

Как правило, сначала синтезируют защищенные пентапептидные сложные эфиры формулы R'-Z-OR'', например, BOC-Z-OMe или BOC-Z-OEt, которые затем омыляют в кислоты формулы R'-Z-OH, например BOC-Z-OH; из последних отщепляют защитную группу R', получая в результате свободные пептиды формулы H-Z-OH (II).

Дериватизация циклопептида, который соответствует соединению формулы I, происходит также известными методами, например, методом алкилирования аминов, этерификации карбоновых кислот или нуклеофильного замещения алифатических C-атомов и описанных в любом учебнике органической химии, например J. March, Adv. Org. Chem., John Wiley & Sons, N.Y. (1985).

Основание формулы I может быть переведено кислотой в соответствующую соль присоединения кислоты. Для этой реакции обменного разложения особенно подходят кислоты, которые дают физиологически не вызывающие сомнения соли. Так, могут применяться неорганические кислоты, например серная кислота, азотная кислота, галогенводородные кислоты, как то: хлорводородная кислота или бромводородная кислота, фосфорные кислоты, как то: ортофосфорная кислота, сульфаминовая кислота, далее органические кислоты, в частности алифатические, алициклические, аралифатические, ароматические или гетероциклические одно- или многоосновные карбоновые, сульфоновые или серные кислоты, например, муравьиная кислота, уксусная кислота, проционовая кислота, пивалиновая кислота, диэтилуксусная кислота, малоновая кислота, янтарная кислота, пимелиновая кислота, фумаровая кислота, малеиновая кислота, молочная кислота, винная кислота, яблочная кислота, бензойная кислота, салициловая кислота, 2- или 3-фенилпропионовая кислота, лимонная кислота, глюконовая кислота, аскорбиновая кислота, никотиновая кислота, изоникотиновая кислота, метан- или этансульфоновая кислота, этандисульфоновая кислота, 2-гидроксиэтансульфоновая кислота, бензолсульфоновая кислота, п-толуолсульфоновая кислота, нафталин-моно- и дисульфоновые кислоты, лауриловая кислота. Соли с физиологически небезупречными кислотами, например пикраты, могут применяться для выделения и/или очистки соединений формулы I.

С другой стороны, кислота формулы I взаимодействием с основанием может быть переведена в одну из ее физиологически переносимых металлических или аммонийных солей. В качестве солей при этом, в частности, рассматриваются соли натрия, калия, магния, кальция и аммония, далее, замещенные соли аммония, например, соли диметил-, диэтил-, или диизопропиламмония, соли моноэтанол-, диэтанол- или триэтаноламмония, соли циклогексил-, дициклогексиламмония, соли дибензилэтилендиаммония, далее, например, соли с N-метил-D-глюкамином или с аргинином или лизином.

Новые соединения формулы I и их физиологически не вызывающие сомнений соли могут применяться для получения фармацевтических препаратов путем перевода их вместе с по меньшей мере, одним носителем или вспомогательным веществом и, если необходимо, вместе с одним или несколькими другими активными веществами в подходящую дозировочную форму. Полученные таким образом комбинации могут применяться как лекарственные средства в медицине или ветеринарии. Веществами-носителями служат органические или неорганические вещества, пригодные для энтерального (например, орального или ректального), парентерального (например, внутривенные инъекции) или местного (например, локального, дермального, офтальмического или назального) применения или для применения в форме ингаляционных аэрозолей и не реагирующие с новыми соединениями, например вода или водный изотонический раствор поваренной соли, низшие спирты, растительные масла, бензиловые спирты, полиэтиленгликоли, глицеринтриацетат и другие жирнокислотные глицериды, желатин, соевый лецитин, углеводы, как то: лактоза или крахмал, стеарат магния, тальк, целлюлоза, вазелин. Для орального применения служат в частности таблетки, драже, капсулы, сиропы, соки или капли; интерес представляют специальные лаковые таблетки и капсулы с покрытиями или, соответственно, с оболочками, стойкими к желудочному соку. Для ректаального применения служат суппозитории, для парэнтерального применения - растворы, главным образом масляные или водные растворы, затем суспензии, эмульсии или имплантаты. Для местного применения годятся, например, растворы, которые могут применяться в форме глазных капель, далее, например, суспензии, эмульсии, кремы, мази или комприматы. Для применения в качестве ингаляционных аэрозолей могут применяться распыляемые растворы, содержащие действующее начало либо в растворенном состоянии либо во взвешенном в рабочем газе или смеси газов (например, CO₂ или вещества-заменители фторхлоруглеводородов) состоянии. Целесообразно применять при этом действующее начало в микронизированной форме, причем могут присутствовать один или несколько физиологически переносимых растворителей, например этанол. Ингаляционные растворы могут вводиться пациенту с помощью обычных ингаляторов. Новые соединения могут также быть лиофилизированы, и полученные лиофилизаты, например, применяться для получения инъекционных растворов. Инъекции могут при этом делаться в виде уколов или в виде непрерывного вливания (например, внутривенно, внутримышечно, подкожно или подоболочечно). Указанные композиции могут быть стерилизованы и/или содержать вспомогательные вещества, как то: консерванты, стабилизаторы и/или смачивающие агенты, эмульгаторы, соли для регулирования осмотического давления, буфферные вещества, красящие и/или ароматизирующие вещества. Они могут, при желании, содержать также одно или несколько других активных веществ, например один или несколько витаминов.

Вещества согласно изобретению могут вводиться пациенту, как правило, аналогично другим известным, имеющимся на рынке пептидам, в особенности же аналогично описанным в US A 4472305 соединениям, предпочтительно в дозировках от прибл. 0,05 до 500, в частности от 0,5 до 100 мг на дозиметрическую единицу. Ежедневная дозировка предпочтительно находится между прибл. 0,01 и 2 мг на кг веса тела. Специальная доза для каждого определенного пациента зависит, однако, от различных факторов, например от действенности применяемого специального соединения, возраста, веса тела, общего состояния здоровья, пола, питания, момента и пути приема лекарственного средства, от скорости выведения, комбинации лекарственных веществ и тяжести соответствующего заболевания. Предпочтительна парентеральная форма введения лекарства.

Одно соединение из настоящего изобретения, в котором Arg или DArg заменен на Orn или DOrn, может использоваться как предшественник для синтеза пептидов, составляющий предмет настоящего изобретения, так как Orn может быть превращен в Arg посредством гуанидирования. Этот метод особенно пригоден для получения Arg-содержащих пептидов, меченных изотопами ¹¹C или ¹⁴C.

Далее, новые соединения формулы I могут применяться в качестве интегринлигандов для получения колонок для аффинной хроматографии с целью получения интегринов в чистом виде.

Лиганд, т. е. производное пептида формулы I, при этом ковалентно присоединяется к полимерному носителю через якорные функции.

В качестве носителей пригодны известные в химии пептидов полимерные твердые фазы с преимущественно гидрофильными свойствами, например поперечно-сшитые полисахара, как то: целлюлоза, сефароза или Sephadex®, акриламиды, полимеры на полиэтиленгликолевой основе или Tentakelpolymere®.

В качестве якорных функций, связанных с полимерными носителями, преимущественно годятся линейные алкиленовые цепи с 2-12 C-атомами, присоединенные одним концом непосредственно к полимеру, а на другом конце имеющие функциональную группу, как, например, гидрокси, амино, меркапто, малеинимидо или COOH-группу, и к тому же способные соединяться с C- или N-концевым участком соответствующего пептида.

При этом возможно, чтобы пептид был непосредственно или также через вторую анкерную функцию соединен с анкером полимера. Далее возможно, чтобы пептиды, содержащие аминокислотные остатки с функционализированными боковыми цепями, были соединены через них с анкерной функцией полимера.

Кроме того, определенные аминокислотные остатки, входящие в состав пептидов формулы I, могут быть так модифицированы в их боковых цепях, что они могут соединяться через группы SH-, OH-, NH₂- или COOH с якорем полимера.

Возможны при этом необычные аминокислоты, как, например, производные фенилаланина, несущие в 4-й позиции фенильного кольца меркапто-, гидрокси-, амино- или карбоксицепь, причем функциональная группа находится в конце цепи.

Примеры аминокислотных остатков, боковые цепи которых могут непосредственно служить в качестве анкерной функции, - это, например, Lys, Orn, Arg, Dab, Dap, Asp, Asn, Glu, Gln, Ser, Thr, Cys, Cit или Tyr.

Примерами N-концевых анкеров являются остатки, как то: -CO-C_nH₂-NH₂, -CO-C_nH_2n-OH, -CO-C_nH_2n-SH или -CO-C_nH_2n-COOH с n = 2-12, причем длина алкиленовой цепи не имеет критически важного значения и она может при необходимости быть заменена также, например, соответствующими арильными или алкиларильными остатками.

C-терминальные анкеры могут быть например -O-C_nH_2n-SH-, -O-C_nH_2n-OH, -O-C_nH_2n-NH₂, -O-C_nH_2n-COOH, -NH-C_nH_2n-SH, -NH-C_nH_2n-OH, -NH-C_nH_2n-NH₂ или -NH-C_nH_2n-COO, причем для n, а также для алкиленовой цепи справедливо уже сказанное в предыдущем абзаце.

N- и C-терминальные анкеры могут также служить в качестве якорного звена для уже функционализированной боковой цепи аминокислотного остатка. Особенно годятся, например, аминокислотные остатки, как то: Lys(CO-C₅H₁₀-NH₂), Asp(NH-C₃H₆-COOH) или Cys(C₃H₆-NH₂), причем анкер всегда соединен с функциональной группой боковой цепи.

Получение материалов для аффинной хроматографии для очистки интегринов осуществляется в условиях, обычных для конденсации аминокислот и известных сами по себе и уже обсужденных в разделе о получении соединений формулы I.

Наряду с применением циклопептидов для иммобилизации на полимерных материалах для получения колонок аффинной хроматографии возможно использовать соединения с их функционализированными боковыми цепями для дальнейшей дериватизации диагностическими вспомогательными реагентами, например флуоресцирующими заместителями.

Далее возможно дополнительное введение в боковые цепи остатков D и E функциональных групп, таких как амино-, меркапто- или карбоксигруппы, через которые затем могут быть получены конъюгаты с протеинами или другими высокомолекулярными веществами, как, например, для целей иммунизации и/или производства антител.

Все температуры указаны в ^oC. В нижеследующих примерах "Обычная обработка" обозначает: добавляют, при необходимости, воду, нейтрализуют, экстрагируют эфиром или дихлорэтаном, отделяют, сушат органическую фазу над сульфатом натрия, фильтруют, упаривают и очищают с помощью хроматографии на кизельгеле и/или кристаллизации. RZ = время удерживания (минуты). Аналитическое исследование проводилось посредством жидкостной хроматографии высокого давления на Lichrosorb ® select B (7 мкм) - 250 х 4 мм-колонке, элюент A: 0,3% TFA в воде; элюент B: 0,3% TFA в 2-пропанол/воде (8:2) градиент 1-99% B за 50 мин при потоке 1 мл/мин и определении при 215 нм. M⁺ = молекулярный пик в массовом спектре, полученном по методу бомбардировки быстрыми атомами (FAB).

Пример 1
Раствор 0,6 г H-NMe-Arg(Mtr)-Gly-Asp(OBut)-D-Phe-Val-ONa /например, полученного из Fmoc-NMe-Arg(Mtr)-Gly-Asp(OBut)-D-Phe-O-Wang, причем o-Wang обозначает применяемый в модифицированных методах Меррифилда остаток 4-оксиметил-феноксиметилполистирольной смолы, отщеплением Fmoc-группы с помощью пиперидин/диметилформамида и отщеплением смолы с помощью TFA/CH₂Cl₂ (1:1)/ в 15 мл диметилформамида разбавляют 85 мл дихлорметана и смешивают с 50 мг NaHCO₂. После охлаждения в смеси сухого льда с ацетоном добавляют 40 мкл дифенилфосфорилазида. Через 16 часов стояния при комнатной температуре раствор концентрируют. Концентрат фильтруют (колонка Sephadex G 10 в изопропанол/воде 8:2) и затем, как обычно, очищают посредством жидкостной хроматографии высокого давления. Получают после обработки посредством TFA/H₂O (98:2) цикло-(NMe-Arg-Gly-Asp-D-Phe-Val); RZ = 18,1; FAB-MS (M + H): 589.

Аналогично получают циклизацией соответствующих линейных пептидов и отщеплением защитных групп. (См. в конце описания.

Пример 2
Раствор 0,28 г цикло-(Arg(Mtr)-Gly-Asp-NMePhe-DVal) /получаемый путем циклизации согласно примеру 1/ в 8,4 мл TFA, 1,7 мл дихлорметана и 0,9 мл тиофенола оставляют стоять на 4 часа при комнатной температуре, затем концентрируют и после разбавления водой сушат вымораживанием. С помощью гельфильтрации на Sephadex G 10 (уксусная кислота/вода 1:1) и последующей очистки посредством препаративной жидкостной хроматографии высокого давления при указанных условиях получают цикло-(Arg-Gly-Asp-NMePhe-DVal); FAB-MS (M + H): 589.

Аналогично получают:
из цикло-(Arg(Mtr)-Gly-NMeAsp-DPhe-Ile): цикло-(Arg-Gly-NMeAsp-DPhe-Ile); FAB-MS (M + H): 603;
из цикло-(D-Arg(Mtr)-NMeGly-Asp(OBut)-DPhe-Nle): цикло-(D-Arg-NMeGly-Asp-DPhe-Nle);
из цикло-(NMeArg(Mtr)-Gly-D-Asp(OEt)-DPhe-Ile): цикло (NMeArq-Gly-D-Asp-DPhe-Ile);
из цикло-(NMeArg(Mtr)-Gly-Asp-Phe-DIle): цикло-(NMeArg-Gly-Asp-Phe-DIle);
из цикло-(Arg(Mtr)-Gly-NMeAsp-Phe-DLeu): цикло-(Arg-Gly-NMeAsp-Phe-DLeu);
из цикло-(Arg(Mtr)-NMeGly-Asp-Phe-DSer): цикло-(Arg-NMeGly-Asp-Phe-DSer);
из цикло-(Arg(Mtr)-NMeGly-Asp-DNal-Leu): цикло-(Arg-NMeGly-Asp-DNal-Leu);
из цикло-(NMeArg(Mtr)-Gly-Asp-Hal-DIle): цикло-(NMeArg-Gly-Asp-Nal-DIle);
из цикло-(Arg(Mtr)-Gly-Asp-NMePhg-DVal): цикло-(Arg-Gly-Asp-NMePhg-DVal);
из цикло-(Arg(Mtr)-Gly-NMeAsp-Trp-DVal): цикло-(Arg-Gly-NMeAsp-Trp-DVal).

Пример 3
80 мг цикло-(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal) пять-шесть раз растворяют в 0,01 М HCl и после каждого растворения сушат вымораживанием. Последующая очистка с помощью жидкостной хроматографии высокого давления позволяет получать цикло-(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal)·HCl; FAB-MS (M + H): 589.

Аналогично получают:
из цикло-(NMeArg-Gly-Asp-DPhe-Val): цикло-(NMeArg-Gly-Asp-DPhe-Val)·HCl;
из цикло-(Arg-NMeGly-Asp-DPhe-Val): цикло-(Arg-NMeGly-Asp-DPhe-Val)·HCl; FAB-MS (M + H): 589;
из цикло-(Arg-Gly-NMeAsp-DPhe-Val): цикло-(Arg-Gly-NMeAsp-DPhe-Val)·HCl;
из цикло-(Arg-Gly-Asp-NMeDPhe-Val): цикло-(Arg-Gly-Asp-NMeDPhe-Val)·HCl;
из цикло-(Arg-Gly-Asp-Phe-DNMe-Val): цикло-(Arg-Gly-Asp-Phe-DNMe-Val)·HCl; RZ = 18,2; FAB-MS (M + H): 589.

Аналогично получают обработкой уксусной кислотой (AcOH): из цикло-(Arg-Gly-NMeAsp-DPhe-Val): цикло-(Arg-Gly-NMeAsp-DPhe-Val)·AcOH; RZ = 15,4; FAB-MS (M + H): 589.

Аналогично получают обработкой метансульфоновой кислотой (MeSO₃H):
из цикло-(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal): цикло-(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal)·MeSO₃H; RZ = 17,8; FAB-MS (M + H): 589.

Пример 4
Для получения фаз сродства суспендируют 0,9 г N-малеинимидо-(CH₂)₅-CO-NH-(CH₂)₃-полимера (получаемого конденсацией N-малеинимидо-(CH₂)₅-COOH с H₂N-(CH₂)₃-полимером / в 10 мл 0,1 М натрийфосфатного буфера при pH 7 и добавляют при 4^oC один эквивалент цикло-(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeLys(CO(CH₂)₂SH). Перемешивают 4 часа при одновременном нагревании реакционной смеси до комнатной температуры, отфильтровывают твердый остаток и дважды промывают каждый раз 10 мл буферного раствора (pH 7) и затем трижды водой по 10 мл каждый раз. Получают цикло-(Arg-Gly-Asp-DPhe- NMeLys(CO(CH₂)₂S-3-(N-малеинимидо-(CH₂)₅- CONH-(CH₂)₃-полимер)).

Пример 5
Аналогично примеру 4 получают конденсацией полимер-O-(CH₂)₃-NH₂ /имеется на рынке/ и цикло-(Arg-Gly-Asp-NMe-DPhe-Lys(CO(CH₂)₄COOH) /получаемого конденсацией адипиновой кислоты с цикло-(Arg-Gly-Asp-NMe-DPhe-Lys) в указанных условиях/ следующую полимерную фазу: цикло-(Arg-Gly-Asp-NMe-DPhe-Lys-(CO(CH₂)₄- CO-NH-(CH₂)₃-O-полимер).

Аналогично получают конденсацией цикло-(NMe-Arg-Gly-Asp-DPhe-Lys-(CO-(CH₂)₅-NH₂)) с HOOC-CH₂-O-полимером: цикло-(NMe-Arg-Gly-Asp-DPhe-Lys-(CO-(CH₂)₅-NH-CO-CH₂-O-полимер)).

Нижеследующие примеры касаются фармацевтических композиций.

Пример A: Инъекционные склянки
Раствор 100 г циклопептида формулы I и 5 г вторичного фосфата натрия в 3 л дважды дистиллированной воды доводят 2 н. соляной кислотой до pH 6,5, стерильно фильтруют, разливают в инъекционные склянки, лиофилизируют в стерильных условиях и стерильно закрывают. Каждая инъекционная склянка содержит 5 мг активного вещества.

Пример B: Суппозитории
Расплавляют смесь 20 г активного вещества формулы I со 100 г соевого лецитина и 1400 г какао-масла, разливают в формы и дают остыть. Каждый суппозиторий содержит 20 мг активного вещества.

Пример C: Раствор
Готовят раствор из 1 г активного вещества формулы I, 9,38 г NaH₂PO₄·2H₂O, 28,48 г Na₂HPO₄·12H₂O и 0,1 г бензальконийхлорида в 940 мл дважды дистиллированной воды. Доводят pH до 6,8, доливают до 1 л и стерилизуют облучением. Этот раствор может применяться в форме глазных капель.

Пример D: Мазь
Смешивают 500 мг активного вещества формулы I с 99,6 г вазелина при асептических условиях.

Пример E: Таблетки
Смесь 100 г циклопептида формулы I, 1 кг лактозы, 600 г микрокристаллической целлюлозы, 600 г кукурузного крахмала, 100 г поливинилпирролидона, 80 г талька и 10 г стеарата магния спрессовывают обычным способом в таблетки, так что каждая таблетка содержит 10 мг активного вещества.

Пример F: Драже
Таблетки прессуют, как указано в примере E, и покрывают затем обычным способом покрытием из сахарозы, кукурузного крахмала, талька, траганта и красителя.

Пример G: Капсулы
Обычным образом капсулы из твердого желатина заполняют активным веществом формулы I, так что каждая капсула содержит 5 мг активного вещества.

Пример H: Ингаляционный аэрозоль
Растворяют 14 г активного вещества формулы I в 10 л изотонического раствора NaCl и раствор заливают с помощью насосного механизма в обычные для торговли аэрозольные сосуды. Раствор можно распылять в рот или нос. Каждая порция распыляемого раствора (прибл. 0,1 мл) соответствует дозе прибл. 0,14 мг.

Формула изобретения

1. Циклопептиды формулы I
цикло-(nArg - nGly - nAsp - nD - nE),
где D обозначает D-Phe, Phe, D-Trp, Trp, D-Tyr, Tyr, D-гомоPhe, гомоPhe, D-Nal, Nal, D-Phg или 4-Hal-Phe (D- или L-форма);
Е обозначает Val, Gly, Ala, Leu, Ile или Nle;
Hal обозначает F, Cl, Br или J,
n незамещенный или обозначает алкильный остаток с 1 - 18 С-атомами, бензил или аралкильный остаток с 7 - 18 С-атомами в альфааминофункции соответствующего аминокислотного остатка, с условием, что, по меньшей мере, один аминокислотный остаток имеет один заместитель n, а также их оптически активные D- и L-формы,
и физиологически переносимые соли.

2. Энантиомер или диастереомер циклопептида формулы I по п.1.

3. Циклопептиды формулы I по п. 1, представляющие собой: а) цикло-(NMeArg-Gly-Asp-DPhe-Val), б) цикло-(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal), в) цикло-(Arg-NMeGly-Asp-DPhe-Val), г) цикло-(Arg-Gly-NMeAsp-DPhe-Val), д) цикло-(Arg-Gly-Asp-NMeDPhe-Val), е) цикло-(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeGly),
а также их физиологически переносимые соли.

4. Циклопептиды формулы I по п.1 или их физиологически приемлемые соли для получения лекарственного средства.

5. Циклопептиды формулы I по п.1 и их физиологически приемлемые соли для лечения и профилактики опухолей и/или их метастаза.

6. Циклопептиды формулы I по п.1 и их физиологически приемлемые соли для получения иммобилизованных лигандов для колоночной аффинной хроматографии.

7. Циклопептиды формулы I по п.1 и их физиологически приемлемые соли для очистки интегринов посредством аффинной хроматографии.

8. Способ получения циклопептида формулы I по п.1 или одной из его солей, отличающийся тем, что пептид формулы II
H - z OH,
где z обозначает -nArg-nGly-nAsp-nD-nE, -nGly-nAsp-nD-nE-nArg-, -nAsp-nD-nE-nAgr-nGly-, -nD-nE-nArg-nGly-nAsp- -nE-nArg-nGly-nAsp-nD-,
или его реакционноспособные производные, обрабатывают циклизующим средством и, при необходимости, циклопептид формулы I обработкой кислотой или основанием переводят в одну из его солей.

9. Способ получения фармацевтической композиции, обладающей ингибирующей активностью в отношении α_vβ₃- и/или α_vβ₅- интегринов, отличающийся тем, что эффективное количество соединения формулы I согласно п.1 и/или одну из его фармацевтически переносимых солей совместно с, по меньшей мере, одним твердым, жидким или полужидким носителем или вспомогательным веществом переводят в подходящую дозированную форму.

10. Фармацевтическая композиция, обладающая ингибирующей активностью в отношении α_vβ₃- и/или α_vβ₅- интегринов, отличающаяся тем, что в качестве активного вещества она содержит, по меньшей мере, одно соединение формулы I по п.1 и/или одну из его физиологически переносимых солей в эффективном количестве.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5