Средство для угнетения активности тромбоцитов

 

Изобретение относится к медицине. Предложено использовать N-хлор-2-аминоэтансульфоновую или N, N-дихлор-2-аминоэтансульфоновую кислоту для угнетения функциональной активности тромбоцитов. Средство угнетает агрегацию тромбоцитов и секрецию содержимого гранул. 2 с.п. ф-лы, 4 табл., 3 ил.

Изобретение относится к медицине, к веществам, которые действуют на агрегатное состояние крови, а именно к веществам, угнетающим активность тромбоцитов.

В медицине существует потребность в веществах, подавляющих внутрисосудистый тромбогенез, связанный с тромбоцитами. Известна противотромбоцитная активность ацетилсалициловой кислоты - аспирина. Это вещество применяется для предотвращения образования тромбов, зависящих от повышенной активности тромбоцитов. Ацетилсалициловая кислота ингибирует тромбоциты путем химической модификации синтетазы простагландина H₂. Противотромбоцитное действие ацетилсалициловой кислоты проявляется, если тромбоциты активируются с участием указанного фермента.

Известно противотромбоцитное вещество, представляющее собой водный раствор хлораминового производного аминокислот или хлориминового производного иминокислот. Это вещество описано в патенте СССР N 1834659. Его активность обусловлена химической модификацией плазматической мембраны тромбоцитов под действием активной хлораминовой или хлориминовой группы. Это вещество выбрано прототипом. Его недостатком является небольшой срок хранения, составляющий несколько часов, невозможность получения активного агента в сухом виде. Вещество-прототип не получается в твердом состоянии, распадается при высушивании.

Задача изобретения состоит в разработке вещества, эффективно угнетающего активность тромбоцитов независимо от природы активации, существующего в растворенном и твердом состоянии, характеризующегося повышенным сроком хранения.

Задача изобретения в одном случае решается тем, что в качестве противотромбоцитного средства используются хлораминовые производные 2-аминоэтансульфоновой кислоты, представляющей собой продукт окисления аминокислоты цистеина: N-хлор-2-аминоэтансульфоновая кислота, или N-хлортаурин N,N-дихлор-2-аминоэтансульфоновая кислота, или N,N-дихлортаурин В отличие от прототипа в заявленных соединениях отсутствует карбоксильная группа. Заявленные соединения в растворенном состоянии сохраняются до нескольких дней против нескольких часов в случае прототипа.

Задача изобретения решается в другом случае тем, что N,N-дихлор-2-аминоэтансульфоновую кислоту получают в твердом состоянии.

Изобретение иллюстрируется следующими чертежами: фиг. 1 - спектры поглощения раствора N-хлор-2-аминоэтансульфоновой кислоты до и после его хранения; фиг. 2 - спектры поглощения раствора N,N-дихлор-2-аминоэтансульфоновой кислоты до и после его хранения; фиг. 3 - спектры поглощения N,N-дихлор-2-аминоэтансульфоновой кислоты после растворения ее твердого образца.

Создание заявленного вещества для угнетения активности тромбоцитов подтверждается следующими примерами.

Пример 1 Получили N, N-дихлор-2-аминоэтансульфоновую кислоту и N-хлор-2-аминоэтансульфоновую кислоту путем смешивания раствора 2-аминоэтансульфоновой кислоты и раствора гипохлорита натрия в соответствии с известной методикой (Thomas E. L. , Jefferson M.M., Grisham M.B. Myeloperoxidase-catalyzed incorporation of amines into proteins: Role of hypochlorous acid and dichloramines. - Biochemistry. 1982, vol. 21, p. 6299-6308).

Кровь человека или кролика, стабилизированную 3,8%-ным раствором цитрата натрия (9:1 по объему), центрифугировали при 210 g в течение 20 мин. Супернатант, представляющий собой богатую тромбоцитами плазму, применяли для исследования агрегации тромбоцитов. Для этого использовали турбидиметрический агрегометр Chrono-Log или турбидиметрический агрегометр, собранный на базе фотоэлектроколориметра КФК-2МП. В последнем случае толщина кюветы для образца тромбоцитов составляла 1 см, прибор записывает кинетическую кривую коэффициента светопропускания при 670 нм. Количественным индексом агрегационной способности тромбоцитов служило изменение светопропускания образца, измеряемое через 5-10 мин после введения аденозиндифосфорной кислоты в конечной концентрации 10 мкмоль на 1 л; это соединение служило агонистом (активатором тромбоцитов). Противоагрегационное действие заявленных веществ характеризовали отношением ΔT/ΔT_k, где ΔT_k и ΔT - изменение коэффициента светопропускания соответственно образца без вещества (контроль) и образца с добавкой исследуемого вещества.

N, N-Дихлор-2-аминоэтансульфоновая кислота в конечной концентрации 0,25-1,0 ммоль/л подавляла способность тромбоцитов к агрегации в составе богатой тромбоцитами плазмы человека и кролика (табл. 1).

Ввели в кровь человека или кролика N,N-дихлор-2-аминоэтансульфоновую кислоту. Через 10 мин из такого образца крови получили богатую тромбоцитами плазму, измерили агрегационную активность тромбоцитов, вызываемую аденозиндифосфорной кислотой в конечной концентрации 10 мкмоль/л (табл. 2). N, N-Дихлор-2-аминоэтансульфоновая кислота при ее введении в цельную кровь проявляла выраженное противоагрегационное действие на тромбоциты (табл. 2).

Пример 2
Получили описанным в примере 1 способом N-хлор-2-аминоэтансульфоновую кислоту и N,N-дихлор-2-аминоэтансульфоновую кислоту. Получили богатую тромбоцитами плазму крови кролика и измерили агрегационную активность тромбоцитов при действии N,N-дихлор-2-аминоэтансульфоновой кислоты в сравнении с активностью в контроле. Агрегацию вызывали коллагеном в конечной концентрации 5 мкг/мл или адреналином в конечной концентрации 10 мкмоль/л.

Получили изолированные тромбоциты кролика из богатой тромбоцитами плазмы путем центрифугирования. Для анализа агрегационной активности тромбоцитов использовали их суспензию в среде, содержащей NaCl 134 мМ, KCl 5 мМ, MgSO₄ 1 мМ, Na₂HPO₄ 0,5 мМ, HEPES 10 мМ, глюкоза 5 мМ (pH = 7,4). Агрегацию вызывали тромбином в конечной концентрации 0,1 Ед/мл или адреналином в конечной концентрации 10 мкмоль/л.

N, N-Дихлор-2-аминоэтансульфоновая кислота угнетала агрегационную активность тромбоцитов при их активации коллагеном или адреналином (табл. 3). N-Хлор-2-аминоэтансульфоновая кислота ингибировала агрегацию тромбоцитов, активированных тромбином или адреналином (табл. 3).

Таким образом, заявленные вещества способны угнетать агрегационную активность тромбоцитов независимо от природы активации.

Пример 3
Получили богатую тромбоцитами плазму крови кролика, ввели в этот образец акридиновый оранжевый в конечной концентрации 10 мкмоль/л и инкубировали смесь 5 мин при комнатной температуре для накопления красителя-зонда во внутриклеточных гранулах. Затем клетки отделили от плазмы центрифугированием, суспендировали в среде, описанной в примере 2. В эту суспензию тромбоцитов ввели хлористый кальций в конечной концентрации 1 ммоль/л и затем тромбин в конечной концентрации 0,1 Ед/мл. Измерили зависимость от времени интенсивности флуоресценции образца тромбоцитов, проходящей через светофильтр ЖС-17 и возбуждаемой светом при 450 нм. Интенсивность этой флуоресценции вначале увеличивалась во времени в результате процесса секреции и выхода акридинового оранжевого вo внешнюю среду и по завершении этого процесса достигала плато. Максимальное изменение интенсивности флуоресценции было количественным показателем эффективности секреции. Ввели в суспензию изолированных тромбоцитов до введения тромбина N,N-дихлор-2-аминоэтансульфоновую кислоту в конечной концентрации 0,14 и 0,25 ммоль/л. Эффективность секреции составила соответственно 43 и 29% от эффективности в исходном образце тромбоцитов. Таким образом, заявленное вещество угнетает также другой важнейший вид функциональной активности тромбоцитов - секрецию содержимого гранул.

Пример 4
Через краевую вену уха ввели в кровяное русло кролика N,N-дихлор-2-аминоэтансульфоновую кислоту, растворенную в физиологическом растворе, из расчета примерно 0,4 ммоль на 1 л крови. Взяли кровь у кролика до введения заявленного вещества и через 1 и 24 ч после его введения. Из всех образцов крови получили богатую тромбоцитами плазму и измерили агрегационную активность тромбоцитов, активированных аденозиндифосфорной кислотой, адреналином в конечной концентрации 10 мкмоль/л или коллагеном в конечной концентрации 5 мкг/мл (табл. 4). Заявленное вещество, введенное в кровяное русло, сильно подавляло агрегационную активность тромбоцитов через 1 ч. Эффект угнетения сохранялся 24 ч (табл. 4).

Пример 5
Приготовили раствор N-хлор-2-аминоэтансульфоновой кислоты в соответствии с примером 1. Его хранили 24 ч при комнатной температуре. С помощью спектрофотометра СФ-46 измерили его спектр поглощения как зависимость оптической плотности (D) от длины волны (нм). После хранения в спектре поглощения раствора проявлялась характерная полоса монохлораминовой химической группы в диапазоне длин волн 230-300 нм с максимумом при 250 нм (фиг. 1, сплошная кривая 1), практически совпадающая с полосой спектра свежеприготовленного раствора (фиг. 1, штриховая кривая 2). За время указанного хранения оптическая плотность раствора в максимуме при 250 нм, пропорциональная концентрации N-хлор-2-аминоэтансульфоновой кислоты, практически не изменилась. Таким образом, N-хлор-2-аминоэтансульфоновая кислота в водном растворе сохраняется 1 сутки.

Приготовили раствор N, N-дихлор-2-аминоэтансульфоновой кислоты в соответствии с примером 1. Его хранили 5 месяцев в замороженном состоянии при температуре от -1 до -3^oC. С помощью спектрофотометра СФ-46 измерили спектры поглощения раствора N, N-дихлор-2-аминоэтансульфоновой кислоты до (фиг. 2, штриховая кривая 2) и после такого хранения (фиг. 2, сплошная кривая 1). В спектрах обоих растворов имелась характерная для дихлораминовой химической группы полоса поглощения в интервале длин волн 270-320 нм с максимумом около 290 нм, т.е. раствор, хранившийся 5 месяцев, содержал N,N-дихлор-2-аминоэтансульфоновую кислоту. Ее количество составило 80% от количества в исходном растворе.

Пример 6
Получение заявленного вещества в твердом состоянии, угнетающего активность тромбоцитов, подтверждается следующим примером.

Получили описанным в примере 1 способом раствор N,N-дихлор-2-аминоэтансульфоновой кислоты. Концентрация N, N-дихлор-2-аминоэтансульфоновой кислоты составляла 11 ммоль/л. Заморозили 5 мл этого раствора в стеклянном флаконе, с помощью вакуумного шланга присоединили флакон к вакуумной установке "Иней 3-2", над замороженным образцом установили пониженное давление газа 2 Па, выдержали образец при этом давлении 7 ч, взяли твердый остаток. Его хранили 10 месяцев в холодильнике при температуре 4^oC. Это хранившееся твердое вещество смешали с 5 мл воды; оно растворилось за несколько секунд без остатка. Измерили спектр поглощения полученного раствора на спектрофотометре СФ-46. Измеренный спектр поглощения имел характерную полосу поглощения (фиг. 3, сплошная кривая 1), которая практически совпадала с соответствующей полосой в спектре поглощения свежеприготовленного раствора N,N-дихлор-2-аминоэтансульфоновой кислоты (фиг. 3, штриховая кривая 2). Свежеприготовленный раствор был приготовлен с таким расчетом, чтобы концентрация активного хлора дихлораминовой группы была равна его концентрации в растворе, полученном из твердого вещества. Таким образом, заявленное твердое вещество через 10 месяцев хранения содержало активную дихлораминовую группу.

Приготовили водный раствор из твердого остатка, хранившегося 10 месяцев. Добавили к 2 мл этого раствора 50 мг иодида калия. Происходило быстрое выделение молекулярного иода, который обнаруживали по его способности окрашивать растворимый крахмал в синий цвет. Это свидетельствует о том, что заявленное твердое вещество проявляло характерное свойство хлораминовой химической группы окислять иодид-анион с образованием молекулярного иода.

Иодометрическое титрование с использованием тиосульфата натрия показало, что содержание N, N-дихлор-2-аминоэтансульфоновой кислоты в заявленном твердом веществе после 10 месяцев хранения составило 11,4%. Приготовили водный раствор из заявленного твердого вещества, содержавшего N,N-дихлор-2-аминоэтансульфоновую кислоту и хранившегося 14 дней. Ввели в кровяное русло кролика через краевую вену уха этот раствор из расчета примерно 0,1 ммоль на 1 л крови. Измерили агрегационную активность тромбоцитов, как это описано в примере 4. Активность тромбоцитов, вызываемая адреналином, через 1 и 24 ч после введения кролику указанного раствора составила соответственно 33 и 56% от контроля. Таким образом, заявленный способ позволяет получать твердое вещество, которое длительно хранится и после хранения оказывает противотромбоцитарное действие.

Формула изобретения

1. Применение N-хлор-2-аминоэтансульфоновой кислоты или N,N-дихлор-2-аминоэтансульфоновой кислоты в качестве средства для угнетения функциональной активности тромбоцитов.

2. Средство для угнетения функциональной активности тромбоцитов, отличающееся тем, что представляет собой N,N-дихлор-2-аминоэтансульфоновую кислоту в твердом состоянии.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7