Способ хирургического лечения глубоких дефектов роговицы

 

Изобретение относится к медицине, офтальмологии, а именно к способам хирургического лечения глубоких дефектов роговицы, в том числе ожоговой болезни роговицы с угрозой перфорации. Глубокий дефект роговицы заполняют коллагеновым гелем с включенными в него культивированными аллогенными постнатальными или эмбриональными фибробластами. Затем дефект закрывают мягкой контактной линзой с нанесенными на внутреннюю поверхность ее аллогенными постнатальными или эмбриональными эпителиальными клетками. Способ обеспечивает восстановление стромы и эпителия роговицы с небольшим количеством рубцовой ткани. 3 з.п. ф-лы.

Изобретение относится к области медицины - офтальмологии - и предназначено для лечения больных с глубокими дефектами роговицы, в том числе послеожоговыми язвами роговицы с угрозой перфорации.

Хирургическое лечение больных с дефектами конъюнктивы и роговицы ожоговой этиологии остается актуальной проблемой в офтальмотравматологии. Нередко применение даже самых современных методов консервативного и хирургического лечения не спасает больного от функциональной и анатомической гибели пораженного глаза. Неблагоприятные исходы свидетельствуют как о тяжести повреждения, не совместимого с жизненными функциями глаза, так и об относительной неадекватности применяемых консервативных и хирургических методов лечения.

Известны способы закрытия дефектов роговицы кадаверной роговицей (Killingsworth D.W. et all. Results of therapeutic penetrating keratoplasty. //Ophthalmology. , 1993 Apr. , 100(4) P. 534-41), собственной конъюнктивой (Гундорова Р. А. и др. Аутоконъюнктивальная пластика роговицы - операция выбора для герметизации неинфекционных дефектов роговицы. //Тезисы научно- практической конференции "Теоретические и клинические исследования как основа медикаментозного и хирургического лечения травм органа зрения". Москва, 2000 г. , стр.45-47.), аллоплантами (Мулдашев Э.Р. Аллопланты в офтальмохирургии. // Уфа, 1987 г., стр. -80).

Однако получение кадаверной роговицы связано с определенными трудностями: дополнительное обследование трупа донора на наличие у него различных инфекций, получение согласия родственников умершего на взятие материала и др. Также нередки случаи отторжения и некроза трансплантата вследствие глубокого нарушения микроциркуляции собственной поврежденной ткани, развития механизмов иммунологического конфликта в организме реципиента с донорской тканью (Тазетдинова Н. Р. Клинико-иммунологическое обоснование патогенетически ориентированного медикаментозного и хирургического лечения ожоговой болезни глаз. //Дисс. канд. мед. наук. М., -1989. Стр. 26.; Легеза Г.В. и др. Ошибки в тактике лечения тяжелых ожогов глаз на ранних стадиях и их причины. // Ожоги глаз и их последствия, материалы научно-практич. Конф. Москва. -1997. -Стр. 23-24.; Kuckelkorn R. et al, Retrospektive Betrachtung von schweren Alkaliveratzungen der Augen. // Klin. Мbl. Augenheilkd. - 1993. -Bd. 203, H. 6. -S. 397-402.). При приживлении трансплантатов формируется грубое помутнение роговицы со значительным снижением остроты зрения травмированного глаза.

Наиболее близким способом того же назначения является способ, при котором осуществляют заполнение глубокого дефекта роговицы коллагеновым гелем (US 5522888A, 18.05.95). Раствор содержит измельченное вещество ткани природного геля, введенное в трехмерную полимерную сетку гидрогеля, и служит для стимулирования роста клеток эпителия и восстановления стромы роговицы глаза. Данный материал способен в процессе заживления покрываться эпителием роговицы. Коллагеновый гель играет роль матрикса для собственных фибробластов, которые, мигрируя в гель, постепенно закрывают дефект. Однако при этом способе коллагеновый гель не оказывает специфического стимулирующего воздействия на репаративные процессы, глубокое угнетение которых происходит при послеожоговых и трофических глубоких дефектах роговицы.

Предлагаемый способ основан на применении выращенных в культуре аллогенных фибробластов, включенных в трехмерный коллагеновый гель, представляющий собой эквивалент дермы и культивированных аллогенных (постнатальных или эмбриональных) или ксеногенных эпителиальных клеток, нанесенных на внутреннюю поверхность мягкой контактной линзы в виде многослойного пласта. Основным преимуществом предлагаемого способа является его многофакторное воздействие на деструктивный процесс: 1 - коллагеновый гель, обладая неспецифическим стимулирующим действием на регенерацию роговичной ткани, играет роль трехмерного каркаса для миграции собственных фибробластов и эпителиальных клеток в дефект стромы и эпителия, выполняет протекторную функцию в защите подлежащих собственных тканей от негативного воздействия факторов внешней среды; 2- внесенные в коллагеновый гель культивированные аллогенные фибробласты оказывают специфическое стимулирующее воздействие на регенерацию роговичной ткани посредством секреции факторов роста, цитокинов и др. во внешнюю среду, принимают активное участие в синтезе собственной базальной мембраны эпителия; 3-нанесенные на внутреннюю поверхность фиксирующей мягкой контактной линзы в виде многослойного пласта культивированные аллогенные эпителиальные клетки оказывают специфическое стимулирующее воздействие на эпителизацию роговичного дефекта посредством секреции биологически активных веществ (факторов роста, цитокинов и др.) во внешнюю среду, принимают активное участие в синтезе собственной базальной мембраны эпителия.

Способ трансплантации культивированных аллогенных фибробластов и эпителиальных клеток успешно применяется в клинической комбустиологии, лечении хронических трофических язв и свищей (Сергиенко Н.Ф. и др. Лечение мочевых свищей с применением культуры аллогенных фибробластов. // Урология, 1999 г., N 1, стр. 44-46.; Методические рекомендации: "Восстановление кожных покровов у тяжелообожженных больных с помощью пересадки выращенных эпидермальных пластов". Главное военно-медицинское управление МО РФ, Москва, 1997 г., стр. -10.).

По данным различных авторов, приживление трансплантата аллогенных клеток наступает в 50-90% случаев. Пересаженные клетки оказывают многофункциональное влияние на процессы заживления раны, предотвращая негативное воздействие факторов внешней среды на глубжележащие ткани, выделяя различные клеточные медиаторы стимуляции регенерации, участвуют в синтезе базальных мембран. В результате происходит восстановление типичного для данной ткани эпителия (по пути физиологической эпителизации). Этот процесс носит гистотипический характер. Эпителизация сопровождается постепенным вытеснением или лизисом трансплантата (Smirnov S.V. et all. Seven-years experience in the treatment of burn patients with allogenic cultured keratinicytes. // Annals of burns and fire dis- asters. Vol. XII, N 4, dec. 1998, p. 212-216.).

Однако восстановление дефектов роговицы принципиально отличается от закрытия дефектов кожи и других тканей, при лечении которых использовали трансплантацию аллогенных фибробластов. Если в случае глубоких дефектов кожи, мочевых свищей, эрозий шейки матки восстановление дефекта происходит в основном за счет контракции, то при глубоких дефектах роговицы закрытие дефекта происходит исключительно в результате миграции собственных фибробластов в дефект без элементов контракции, что послужило предпосылкой для использования аллогенных фибробластов и эпителиальных клеток при лечении ожогов роговицы. Условия культивирования эпителиальных клеток вне организма (in vitro) в среде DMEM: F12 при добавлении эпидермального фактора роста (10 нг/мл), инсулина (5 мкг/мл), изопротеринола (10М) позволяют получать в культуре многослойные эпителиальные пласты клеток, гистотипически подобные эпителию в организме. Такие многослойные выращенные эпителиальные клетки способны пролиферировать, дифференцироваться и стратифицироваться в условиях in vitro (Терских В.В. и др. Эпидермальные кератиноциты человека и животных. Проблемы культивирования и трансплантации. // Москва. Наука. 1995, 1, стр. 4, 82). Именно это свойство было использовано при восстановлении эпителия роговицы трансплантацией выращенных на контактных линзах многослойных культур эпителиальных клеток. При этом возможно как культивирование эпителия на контактных линзах в течение 2-7 суток, так и выращивание на иных субстратах с последующим перенесением (пассированием) клеток на внутреннюю поверхность контактных линз и инкубированием их в течение 1 - 3 суток. Кроме того, в работе использовались эпителиальные клетки взрослых доноров (прижизненное донорство), что показало высокую эффективность лечения при значительном упрощении процедуры забора материала (биопсии) для выращивания, строгого тестирования как материала, так и собственно донора. Такой подход, кроме того, лишен морально-этических и социальных ограничений, появляющихся при использовании эмбрионального материала.

В офтальмологии предлагаемый способ был впервые применен нами на экспериментальных животных. Эксперимент проведен на стандартной модели тяжелого щелочного ожога роговицы. Экспериментальный ожог глаз 10 кроликов наносили под кеталаровым наркозом путем накладывания на роговицу пропитанного 10%-ным раствором NaOH круга фильтровальной бумаги диаметром 7 мм, время экспозиции 40 секунд.

Трехмерный коллагеновый гель с фибробластами получали следующим способом. Стерильный раствор NaOH 0.34 М соединяли с концентрированной питательной средой Игла (x10) или средой 199 в соотношении 1:2, добавляли 100 мг глутамина и 9.0 мл. 7.5%-ного раствора бикарбоната натрия на каждые 100 мл среды. Полученную смесь соединяли с охлажденным раствором коллагена 1 типа в уксусной кислоте в соотношении 1:4, одновременно в раствор вносили выращенные культивированные фибробласты в среде 199 или среде Игла (Сергиенко Н. Ф. и др. Лечение мочевых свищей с применением культуры аллогенных фибробластов. // Урология, 1999 г., N 1, стр. 44-46). В отличие от стандартного способа концентрация фибробластов составляла 100-300 тыс клеток в 1 мл конечного коллагенового геля. Данная концентрация фибробластов в коллагеновом геле (в 2-3 раза выше, чем в известном способе) была разработана нами специально для лечения глубоких дефектов роговицы. Это связано с тем, что механизм регенерации роговицы отличается от такового в коже и для полноценной регенерации роговицы требуется большая стимуляция со стороны фибробластов.

Мягкую контактную линзу с нанесенными на внутреннюю ее поверхность культивированными аллогенными эпителиальными клетками получали следующим способом. Культивирование аллогенных эпителиальных клеток кератиноцитов производили стандартным способом в среде DMEM:F12 при добавлении эпидермального фактора роста (10 нг/мл), инсулина (5 мкг/мл), изопротеринола (10М) при температуре 37 ^oС в атмосфере 5% CO₂ и насыщающей влажности в течение 7-23 суток (Терских В.В. и др. Эпидермальные кератиноциты человека и животных. Проблемы культивирования и трансплантации. // Москва. Наука. 1995, 1, стр. 4, 82). Культуру эпителиальных клеток в концентрации 500 тыс клеток в 1 мл наносили на внутреннюю поверхность мягкой контактной линзы в 2 мл среды DMEM-F12 (1: 1). Эпителиальные клетки на контактной линзе культивировали в течение 2-7 суток в среде DMEM-F12, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, эпидермальный фактор роста (10 нг/мл) инсулин (5 мкг/мл) и изопротеринол (10 М). За сутки до трансплантации среду меняли на среду без сыворотки. Непосредственно перед трансплантацией контактные линзы с многослойным пластом эпителиальных клеток промывали стерильным физиологическим раствором.

На 2 сутки после нанесения экспериментального ожога культивированные фибробласты в коллагеновом геле после предварительной некрэктомии были уложены в дефект роговицы. Сверху на трансплантат и роговицу укладывали мягкую контактную линзу с нанесенным на ее внутреннюю поверхность многослойным пластом эпителиальных клеток.

Гисто-морфологические исследования, проведенные на 2, 7, 14, 30 сутки свидетельствуют о временном приживлении трансплантата и постепенном замещении коллагенового геля и аллогенных фибробластов собственными кератоцитами. Восстановление эпителия происходит за счет эпителизации по поверхности трансплантата с сохранением эпителиального покрова в процессе замещения трансплантата. В итоге происходит закрытие роговичного дефекта и предупреждение грозного осложнения ожога роговицы-перфорации. Обнадеживающие результаты позволили нам применить способ в клинической практике.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является полноценное восстановление дефекта как стромы, так и эпителиального дефекта с получением наиболее приближенной к нормальной структуре ткани роговицы.

Технический результат достигается тем, что осуществляется одновременная стимуляция регенерации как стромы, так и эпителия роговицы с помощью аллогенных фибробластов в коллагеновом геле и эпителиальных клеток на мягкой контактной линзе.

Способ осуществляется следующим образом. Трансплантаты фибробластов и эпителиальных клеток на контактной линзе готовят предварительно по вышеизложенной методике. После местной анестезии лезвием и скарификатором производится удаление некротически измененной роговичной ткани. В дефект роговицы укладывается соответствующий по объему дефекта роговицы трансплантат культивированных фибробластов в трехмерном коллагеновом геле, трансплантат фиксируется в ложе мягкой контактной линзой с предварительно нанесенным на внутреннюю поверхность многослойным пластом аллогенных (кератиноцитов) или ксеногенных эпителиальных клеток.

Конкретные примеры выполнения способа: Пример N 1. Кролик N1. Модель тяжелого химического ожога роговицы обоих глаз щелочью по стандартной методике. На 2 сутки после ожога под кеталаровым наркозом произведена некрэктомия на обоих глазах. На опытном глазу дефект роговицы заполнен коллагенновым гелем с включенными в него культивированными человеческими фибробластами, а трансплантат фиксирован мягкой контактной линзой с предварительно нанесенным на внутреннюю поверхность многослойным пластом аллогенных кератиноцитов. На контрольном глазу роговица закрыта мягкой контактной линзой диаметром 18 мм без аллогенных кератиноцитов. На обоих глазах произведена некровавая блефарорафия. На 7 сутки при осмотре на обоих глазах отмечено формирование десцеметоцеле, однако на опытном глазу диаметр десцеметоцеле в 2 раза меньше, чем на контрольном. Произведена повторная трансплантация фибробластов в геле и кератиноцитов на контактной линзе на опытном глазу. На контрольном глазу оставлена мягкая контактная линза. На 18 сутки после начала лечения на опытном глазу отмечено полное восстановление дефекта стромы и полная эпителизация роговицы. На контрольном глазу до последнего дня наблюдения (30 сутки) имела место персистирующая эрозия и сохранялся дефект стромы.

Пример N 2. Больная Б. 10 дней назад перенесла химический щелочной ожог роговицы 3-4 степени. Консервативное лечение по месту жительства неэффективно. При поступлении роговица матового цвета с глубоким дефектом в центре диаметром до 6 мм. Конъюнктива гиперемирована, васкуляризирована. Произведена операция на травмированном глазу по предлагаемому способу: некрэктомия, трансплантация аллогенных культивированных фибробластов в трехмерном коллагеновом геле с концентрацией 100 тыс клеток в 1 мл геля с фиксацией трансплантата мягкой контактной линзой диаметром 14 мм с многослойным пластом культивированных аллогенных кератиноцитов на внутренней поверхности. На 5 сутки после операции отмечено уменьшение диаметра дефекта роговицы до 3 мм. Произведена повторная трансплантация фибробластов в геле и кератиноцитов на контактной линзе. В послеоперационном периоде к 12 суткам после начала лечения наступило закрытие дефекта стромы и полная эпителизация роговицы. Выписана с остротой зрения 0.2 на травмированном глазу.

Пример N 3. Больной Т. 22 дня назад перенес термо-химический ожог роговицы 3 степени. Консервативное лечение по месту жительства без положительного эффекта. При поступлении определяется глубокий дефект роговицы диаметром 3 мм, роговица отечная, по периферии отек эпителия. Глубжележащие структуры не видны. Произведена операция по предлагаемому способу. На 10 сутки после начала лечения отмечено полное закрытие дефекта стромы и полная эпителизация роговицы.

Всего предлагаемым способом оперировано 10 кроликов и 4 больных с тяжелыми ожогами роговицы. Во всех случаях получена активизация репаративных процессов, быстрое закрытие дефектов стромы и эпителия роговицы с формированием бельма 2-3 категории.

Основным преимуществом предлагаемого способа является его многофункциональное действие на деструктивный процесс: стимуляция аллогенными фибробластами регенерации посредством секреции факторов роста, цитокинов и др. во внешнюю среду, активное участие их в синтезе собственной базальной мембраны, формирование коллагеновым гелем каркаса для миграции собственных фибробластов в дефект стромы, защита коллагеновым гелем подлежащих собственных тканей от негативного воздействия факторов внешней среды, многослойный пласт аллогенных эпителиальных клеток, обладая гистотипическими свойствами, стимулируют регенерацию собственного эпителия роговицы с быстрым закрытием эпителиального дефекта. В качестве эпителиальных клеток могут быть использованы также ксеногенные клетки, так как стимуляция собственного эпителия реципиента происходит независимо от источника эпителиального донорского трансплантата. Преимуществом способа является формирование помутнения роговицы меньшей интенсивности, чем при использовании других способов лечения.

Формула изобретения

1. Способ лечения глубоких дефектов роговицы, включающий заполнение дефекта трехмерным коллагеновым гелем, отличающийся тем, что используют гель с включенными в него фибробластами и фиксируют контактной линзой, на внутреннюю поверхность которой помещают многослойный пласт эпителиальных клеток.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве эпителиальных клеток используют кератиноциты.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве эпителиальных клеток используют ксеногенные клетки.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве эпителиальных клеток используют аллогенные клетки.