Штамм bacillus subtilis иб-22-продуцент цитокининов

 

Изобретение относится к области микробиологии и растениеводства и может быть использовано для получения рост стимулирующих препаратов путем микробиологического синтеза. Предложен генетически неизмененный штамм почвенных бактерий Bacillus subtilis ИБ-22, превосходящий по уровню накопления цитокининов известные штаммы. Штамм выделен из образца почвы типичного чернозема, отобранного на территории республики Башкортостан и поддерживается в коллекции микроорганизмов лаборатории прикладной микробиологии Института биологии Уфимского научного центра РАН под номером 0022 (ИБ-22). Штамм образует при росте на среде, содержащей, мас. %: крахмал 1; пептон 0,5; дрожжевой экстракт 0,3; кукурузный экстракт 0,3; К₂НРО₄ 0,2; (NH₄)₂SO₄ 0,2; вода водопроводная до 100, цитокинины в количестве 600-640 нг-экв. зеатина на 1 мл среды. 1 ил. , 1 табл.

Изобретение относится к области микробиологии и сельского хозяйства и может быть использовано для получения рост стимулирующих препаратов для растениеводства путем микробиологического синтеза.

Цитокинины представляют собой природные соединения, участвующие в гормональной регуляции онтогенеза растений и характеризующиеся способностью индуцировать деление растительных клеток. По химическому строению они представляют собой производные аденина или аденозина, у которых аминогруппа в положении N⁶ связана с диметилаллилом, что приводит к образованию соответственно изопентениладенина и изопентениладенозина. Боковая цепь может содержать гидроксильную группу, что соответствует фитогормонам зеатину и зеатинрибозиду. Если боковая цепь содержит насыщенную связь, то это соответственно дигидрозеатин и дигидрозеатинрибозид. Названные шесть соединений составляют основную группу природных цитокининов, синтезируемых растениями.

Несмотря на тот факт, что цитокинины являются наиболее активными среди открытых рост регулирующих веществ, они еще не нашли широкого применения ни в сельском хозяйстве, ни в садоводстве [1] , [2] . Это связано с тем, что природные фитогормоны, отличающиеся морфогенетическим эффектом, труднодоступны, дороги [3] , а эффективность их синтетических аналогов невысока, и применение последних не окупает затрат на их производство [4] . Тем не менее, в связи со способностью цитокининов влиять на активность процессов, повышающих устойчивость и урожайность растений, их применение в практике растениеводства представляется перспективным.

Способность синтезировать цитокинины, помимо растений, присуща и некоторым микроорганизмам [4] , [5] , [6] . Это в первую очередь клубеньковые бактерии, микоризообразующие грибы и некоторые фитопатогенные микроорганизмы. Отдельные микроорганизмы, обитающие в ризосфере растений, также способны синтезировать цитокинины. К ним относятся представители родов Azotobacter [6] , [7] , [8] , Arthrobacter [9] , [10] , Pseudomonas [4] , Streptomyces [11] , Frankia species [12] .

На основе штамма Pseudomonas stutzeri 136 был создан препарат "Микроцит", действующим началом которого являются цитокинины и смесь биологически активных соединений. Названный препарат может быть использован в биотехнологии при культивировании культур клеток и тканей растений; при вегетативном размножении растений; реверсии пола и прорастании семян [13] .

Использование фитогормонов микробного происхождения в растениеводстве может быть перспективно при наличии штамма продуцента, обеспечивающего достаточно высокий уровень секреции внеклеточных цитокининов.

Известен штамм Pseudomonas stutzeri 136, продуцент цитокининов [14] , способность которого продуцировать цитокинины оценивалась путем определения биологической активности очищенного экстракта из культуральной жидкости в биотестах: по стимуляции накопления амарантина в три раза и увеличению массы семядолей огурца на 182%. Однако уровень продукции цитокининов (содержание в культуральной среде) не известен и их конкретные формы не установлены. По этой причине заявленный штамм не может быть использован для получения индивидуальных цитокининов и целенаправленного применения в растениеводстве.

Наиболее близки к заявляемому штамму по продуцирующей способности штаммы Esherihia coli АТСС 53437, 53438, 53439, содержащие рекомбинантные плазмиды, полученные введением генов tmr tzs из плазмид Agrobacterium tumefaciens или фрагментов ДНК плазмид Pseudomonas syringae pv. savastanoj [15] . К недостаткам упомянутых рекомбинантных штаммов следует отнести относительно невысокий уровень накопления цитокининов, в частности зеатина (не превышает 110 нг/мл среды), а также законодательные ограничения на применение генетически модифицированных микроорганизмов в природных условиях, существующие в большинстве развитых стран.

Цель настоящего изобретения - получение природного, генетически неизмененного штамма почвенных бактерий, превосходящего по уровню накопления цитокининов известные штаммы.

Поставленная цель достигается предлагаемым штаммом Bacillus subtilis IB-22, выделенным из образца почвы типичного чернозема, отобранного на территории республики Башкортостан. Штамм поддерживается в коллекции микроорганизмов лаборатории прикладной микробиологии Института биологии Уфимского научного центра РАН. Номер штамма в коллекции 0022 (ИБ-22).

Культурально-морфологические признаки. Клетки палочковидные, 0,6-0,8 х 2,0-3,0 мкм, подвижные, граммположительные. Споры эллиптические, расположены терминально, спорангий не раздувают.

На мясопептонном агаре (МПА) образуют мелкие колонии овальной формы диаметром до 4 мм. Поверхность колоний складчатая, профиль выпуклый с возвышенным центром, цвет желтовато-бежевый с приглушенным блеском. Структура колоний однородная, консистенция пастообразная, края колоний зубчатые.

Физиологические признаки. В анаэробных условиях не растет, реакция Фогес-Проскауэра (образование ацетилметилкарбинола) положительная. При сбраживании глюкозы газ не образует. Разлагает казеин, гидролизует крахмал, усваивает цитрат, индол не образует. Фенилаланин не дезаминирует, тирозин не разлагает. Растет в присутствии 7% NaCl и при pH 9,0.

По совокупности физиолого-биохимических признаков штамм принадлежит к семейству Bacillaceae и относится к роду Bacillus, виду subtilis [16] .

Состав среды для культивирования, мас. %: крахмал 1; пептон 0,5; дрожжевой экстракт 0,3; кукурузный экстракт 0,3; K₂HPO₄ 0,2; (NH₄)₂SO₄ 0,2; вода водопроводная до 100.

Образование заявляемым штаммом цитокининов характеризуется следующими примерами.

Пример 1. Почвенные бактерии, принадлежащие к виду Bacillus subtilis, выращивают на среде вышеупомянутого состава путем культивирования на установке УВМТ 12-250 при 160 мин^-1 и температуре 37^oC. На поздней логарифмической фазе роста или в начале стационарной фазы (обычно на третий день) биомассу отделяют от культуральной жидкости центрифугированием при 10000 об/мин и супернатант анализируют на содержание цитокининов методом непрямого конкурентного иммуноферментного анализа [17] . Результаты анализа представлены в таблице.

Культуральная жидкость штаммов B. subtilis ИБ-15, B. subtilis ИБ-22 достоверно и в значительной степени ингибирует реакцию антиген-антитело, что свидетельствует о наличии в культуральной среде цитокининов, эквивалентно 199,0 и 647 нг-экв. зеатина/мл культуральной среды соответственно.

Пример 2. Дополнительное подтверждение наличия цитокининовой активности в культуральной жидкости получают с помощью биотеста на проростках щирицы Amaranthus caudatus L. по накоплению амарантина [18] . Для этого семена Amaranthus caudatus L. раскладывают на смоченную водой фильтровальную бумагу в чашки Петри, проращивают в течение 72 часов в темноте при температуре 24^oC. Затем на рассеянном свету у каждого из проростков отделяют корешок и раскладывают их по 10 штук на фильтровальную бумагу в чашки Петри. Предварительно в чашки Петри вносят по 1 мл 0,01М фосфатного буфера (pH 6,3), содержащего 2 мг тирозина. Далее, в четыре из них приливают по 1 мл дистиллированной воды (контроль), в три по 1 мл стандартного раствора зеатинрибозида концентрацией 500 нг/мл, в следующие три по 1 мл стандартного раствора ЗР концентрацией 50 нг/мл и в последние три по 1 мл образца исследуемой культуральной жидкости. Растворы стандарта готовят на 0,01М фосфатном буфере.

Чашки инкубируют в темноте при 24^oC в течение 18 часов. Для извлечения образовавшегося амарантина все проростки щирицы из одной чашки Петри помещают в 2 мл 0,1 н. HCl и трижды замораживают и оттаивают.

Концентрацию амарантина определяют с помощью фотоколориметра. КФК-2 при длине волны 540 нм. Количество веществ с цитокининовой активностью в исследуемом образце определяют по концентрационной кривой, построенной на основе определения количества амарантина в проростках из чашек Петри со стандартными растворами зеатинрибозида.

Полученные данные (чертеж) свидетельствуют, что культуральная жидкость B. subtilis ИБ-22 проявляет цитокининовую активность, соответствующую примерно 600 нг зеатинрибозида на 1 мл, B. subtilis ИБ-15 - порядка 250 нг/мл.

Пример 3. Бактерии B. subtilis ИБ-22 выращивают, как в примере 1. Количественный и качественный состав цитокининов в культуральной жидкости определяют с помощью иммуноанализа в сочетании с афинной и тонкослойной хроматографией. Пробу наносят на аффинную колонку, заполненную широкопористым мелкодисперсным стеклом, конъюгированным через аминопропильные группы с антителами к рибозиду зеатина. Наличие цитокининов анализируют в тест-системах для определения зеатина. Цитокининсодержащую фракцию прогревают 15 мин при 80^oC и подвергают тонкослойной хроматографии на пластинах (60 F-254) производства фирмы "Merck" в системе н-бутанол: аммиак: вода (6: 1: 2). Материал разделенных зон элюируют 0,1М фосфатным буфером (pH 7,4) в течение 16 ч и вносят в лунки микропланшета в нескольких разведениях для иммуноанализа.

Количество цитокининов во фракциях определяют с помощью ИФА. Иммунологически определяется около 640 нг-экв. /мл зеатина (в пересчете на культуральную жидкость).

Источники информации 1. Thomas Н. , Blakesley D. Practical and potential uses of cytokinin in Agriculture and Horticulture // Plant Hormones in Search of a role. Monograph 14 (R. Horgan and B. Jeffecoat, eds. ). - Bristol: British Plant Growth Regulator Group, 1987. -P. 69-81.

2. Кефели В. И. Проблема регуляторов роста и устойчивости - ее возможности и перспективы //Мат-лы II Всесоюзн. конф. по регуляторам роста и разв. раст. , Киев, 25-27 мая, 1988. - Киев, 1988. - С. 3-11.

3. Чернядьев И. И. Фотосинтез и цитокинины // Прикл. биохимия и микробиология. - 1993. - Т. 29, вып. 5. - С. 644-673.

4. Мишке И. В. Микробные фитогормоны в растениеводстве. - Рига: Зинатне, 1988. -151 с.

5. Green E. Cytokinine production by microorganisms //Bot. Rev. - 1980. - V. 46, N 1. - P. 25-74.

6. Arshad M. , Frankenberger W. Microbial production of plant hormones //Plant and Soil. -1991. - V. 133. -P. 1-8.

7. Barea J. M. , Brown M. E. Effects of plant growth produced by Azotobacter paspali related to synthesis of plant growth regulating substances //J. Appl. Bacteriol. - 1974. -V. 40. - P. 583-599.

8. Azcon R. , Barea J. Synthesis of auxins, gibberellins and cytokinins by Azotobacter vinelandii and Azotobacter bijerinkii related to effects produced on tomato plants //Planta Soil. - 1975. - V. 43. - P. 609.

9. Blondeau R. Nature d'une cytokinine presente dans les cultures de certains Arthrobacter //C. R. Acad. Sci. - 1974. - V. D. 297. -P. 1571 - 1574.

10. Blondeau R. Contribution a l'etude au niveau de la rhisosphere //These doct. sci. nat. Lill. - Univ. Soet. Techn. - 1985. - P. 212-215.

11. Coppolla S. , Giannattasio H. Activita citockinica in un actimicete rizosherico //Boll. Sci. Ital. Biol. Sper. - 1968. - V. 44. - P. 1913-1915.

12. Stevens G. A. , Berry F. M. Cytokinin secretion by Frankia sp. HFPAr13 in defined medium //Plant Physiol. - 1988. - V. 87. - P. 15-16.

13. Мишке И. В. , Тевелева М. К. , Озолиня. Р. К. , Гривиня П. Сфера применения микробных цитокининов //Микроорганизмы в с. х. : Тез. Докл. 4 Всес. Науч. Конф. , Пущино, 20-24 янв. , 1992. - Пущино, 1992. - С. 139.

14. А. С. 1096279 СССР, МКИ С 12 N 1/00. Штамм бактерий Pseudomonas stutzeneri 136 N 1686 продуцент цитокининов /И. В. Мишке, М. К. Тевелева (СССР), Бюл. N 21, опубл. 07.06.84.

15. Заявка ЕР 00248984 А2, Int. Cl. С 12 N 15/00, С 12 N 1/20. Production of cytokiknins by microorganisms /Moris R. O. , Ragier D. A. Bullatin 87/51 16.12.87.

16. Bergey's manual of systematic bacteriology/ -Baltimore: Williams & Wilkins Co. , 1986, -2, -P. 1104-1141.

17. Кудоярова Г. Р. , Веселов С. Ю. , Каравайко Н. Н. , Гюли-Заде В. 3. , Чередова Е. П. , Мустафина А. Р. , Мошков И. Е. , Кулаева О. Н. Иммуноферментная система для определения цитокининов //Физиология растений. - 1990. - Т. 37, вып. 1. -С. 193-199.

18. Biddington N. L. , Thomas Т. Н. A modified Amaranthus betacyanin bioassay for the rapid idetermination of cytokinins in plant extracts //Planta. - 1973. - V. 111, N 1. -P. 183-186.

Формула изобретения

Штамм бактерий Bacillus subtilis ИБ УНЦ РАН 0022 - продуцент цитокининов.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2