Композиция и способ стабилизации биологических материалов путем сушки без замораживания

 

Сухие, частично аморфные продукты содержат биологически активный материал и стабилизирующие смеси веществ, включающие, по меньшей мере, два компонента. Одно вещество стабилизирующей смеси выбирают из группы, включающей моносахариды, дисахариды и цвиттерион с полярным остатком. Указанный цвиттерион представляет собой аргинин, аспарагиновую кислоту, цитруллин, глутаминовую кислоту, орнитин, гистидин, лизин. Второе вещество стабилизирующей смеси является цвиттерионом с неполярным остатком и представляет собой сложный эфир ацетилфенилаланина, аланин, цистеин, глицин, лейцин, метионин, триптофан, валин, саркозин. Биологически активный материал представляет собой пептиды, протеины, гликопротеины, антитела, вирусы, вакцины, клетки и другие вещества. Согласно способу получения аморфных продуктов готовят раствор биологически активного материала и указанных стабилизирующих веществ, затем раствор высушивают без его замораживания. Стабилизированные биологические материалы обладают устойчивостью при хранении при комнатной температуре и используются для диагностических и терапевтических целей. 2 с. и 18 з.п. ф-лы, 3 ил., 29 табл.

Изобретение относится к композициям и способу стабилизации биологических материалов путем сушки без замораживания. При этом описываются целенаправленно выбранные смеси сахаров и аминокислот и их производных, а также различных аминокислот и их производных, с помощью которых, после получения сухих, частично аморфных продуктов путем сушки без замораживания, можно достигать особенно предпочтительной стабилизации пептидов, протеинов, гликопротеинов, антител и других веществ.

Получение устойчивых при хранении (в особенности, при комнатной температуре) композиций биологически активных и терапевтических веществ, как пептиды, протеины, гликопротеины, нуклеотиды, плазмиды, фрагменты клеток, вирусы и т.д., для диагностических и терапевтических целей в настоящее время имеет большое, постоянное возрастающее значение.

Описаны различные способы и композиции для получения сухого биологически или терапевтически активного материала. Под сухим материалом понимают вещества и смеси веществ, которые имеют остаточную влажность самое большее 8 мас. %, предпочтительно самое большее 4 мас.%, особенно предпочтительно самое большее 2 мас. %. Широко распространены способы сушки вымораживанием [F. Franks, Cryo Lett. , 11, 93-110 (1990); M.J.Pikal, Biopharm., 3 (9), 26-30 (1990); M.Hora, Pharm. Research, 8 (3), 285-291 (1992); F.Franks, Jap.Freezing Drying, 38, 15-16 (1992)], однако им присущи недостатки. При их реализации расходуются большие количества энергии, требуется использование отчасти вредных хладагентов (фреоны), а также они длительны по времени. Для множества веществ, в особенности протеинов, необходимая для сушки вымораживанием стадия замораживания является вредной, то есть дестабилизирующей. Поэтому этот способ совершенно неприменим для некоторых биологических материалов.

Альтернативами сушке вымораживанием при получении сухих протеиновых композиций являются способы, при которых материал высушивают за счет использования тепла и/или вакуума [F.Franks, R.M.H.Hatley: "Стабильность и стабилизация ферментов", изд. W.J.J. van den Teel, A.Harder, R.M. Butlaar, Elsevier Sci. Publ, 1993, с.45-54; B. Roser, Biopharm., 4 (9), 47-53 (1991); J.F. Carpenter, J.H.Crowe, Cryobiol., 25, 459-470 (1988)]. Здесь, например, нужно назвать вакуумную сушку с использованием или без использования повышенной температуры, способ распылительной сушки в различных модификациях, включая комбинированное использование вакуума и техники распыления, а также вальцовую сушку и другие способы высушивания в тонком слое.

В работах J.F.Carpenter, J.H.Crowe, Biochemistry, 28, 3916-3922 (1989); K. Tanaka, T.Taluda, K.Miyajima, Chem.Pharm.Bull., 39 (50, 1091-1094 (1991); патенте ДЕ-С-3520228, патенте ЕР-В-0229810, международной заявке 91/18091, патенте ЕР-В-0383569, патенте США 5 290 765 описываются композиции, которые содержат сахара или сахароподобные вещества. При получении сухих композиций на основе сахаров в случае описанных в уровне техники способов установлены следующие недостатки и проблемы: действительно, в достаточной степени сухие композиции на основе сахаров невозможно получить без значительной затраты энергии. Это относится особенно к композициям в конечной емкости. При этом учитывают применение тепла/нагрева, которое, однако, нужно оценивать крайне критически относительно стабильности используемых биологических материалов. Для достижения достаточной степени высушивания при незначительном подводе тепла альтернативно используют очень продолжительные времена процесса или крайне незначительной толщины слой. Оба варианта способа не приводят к цели. Длительное время крайне неблагоприятно с экономической точки зрения, кроме того, длительное время пребывания биологически активного вещества в матрице, только медленно обедняемой водой, является дестабилизирующим и таким образом также критическим. Высушивание тонкого слоя во многих случаях не приводит к экономически рациональному выходу продукта, то есть в единицу времени и/или в расчете на поверхность высушивания получают только минимальные количества продукта. Кроме того, обработка биологических материалов на очень больших открытых поверхностях высушивания едва реализуема для стерильности, часто требующейся в целях фармацевтического и диагностического применения.

Способы сушки, которые протекают с помощью вакуума при низкой температуре или температуре, незначительно повышенной по отношению к комнатной, являются более щадящими. Однако получение сухих, устойчивых при хранении композиций на основе сахаров во многих случаях практически едва осуществимо. При высыхании растворов сахаров образуются в возрастающей степени вязкие массы. Остающееся в этих массах количество остаточной воды или остаточную влажность нельзя удалить за время, рациональное с экономической точки зрения, во многих случаях высушивание останавливается на непригодном для стабилизации, высоком уровне. Деградация проявляется, например, в уменьшении активности хранящегося материала, в образовании продуктов агрегации или в появлении продуктов деструкции с меньшей молекулярной массой. Пригодное для стабилизации протеинов и т.д., низкое содержание остаточной воды можно определять с помощью физических измеряемых параметров. Из вышецитированной литературы следует, что пригодные для стабилизации протеинов и т.д. композиции должны иметь стекловидную, то есть аморфную структуру, температура стеклования которой находится выше целевой температуры хранения. Температурой стеклования является такая температура, при которой аморфное твердое тело из стеклообразного состояния переходит в вязкое состояние и наоборот. При этом происходят резкие изменения вязкости и связанные с этим изменения коэффициента диффузии и кинетической мобильности протеинов и других молекул. Физические параметры, как твердость и модуль, изменяются точно также, как и термодинамические параметры: объем, энтальпия и энтропия. Температура стеклования, например, содержащей сахар массы и содержание в ней остаточной воды связаны физически друг с другом таким образом, что увеличение количества остаточной воды приводит к понижению температуры стеклования и наоборот. Таким образом, из определения температуры стеклования, например, путем дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК), можно сделать вывод, обладает ли композиция пригодным для стабилизации содержанием остаточной воды, соответственно, как указано выше, успешным или нет является способ сушки. Наряду с определением температуры стеклования с помощью ДСК также можно подтверждать наличие аморфных структур с помощью исследований дифракции рентгеновских лучей (рентгеноструктурный анализ), визуальных и электрономикроскопических наблюдений.

Поэтому желательно приготовление стабилизирующей матрицы для биологически или фармацевтически активных материалов с температурой стеклования выше температуры хранения, которая имеет незначительную остаточную влажность, и желателен недорогостоящий способ приготовления такой стабилизирующей матрицы.

Неожиданно найдено, что путем добавления цвиттерионов с неполярными остатками к массам, содержащим углеводы, их поведение при высушивании можно изменять в положительную сторону таким образом, что прежде плохо высыхающие материалы, которые, соответственно, не обладают никакими в достаточной степени стабилизирующими свойствами, теперь могут очень быстро высыхать и придавать отличную стабильность находящимся в них биологически, в особенности терапевтически, активным материалам.

Далее неожиданно найдено, что также препаративные формы, не содержащие углеводов, состоящие из смесей определенных цвиттерионов могут очень быстро высыхать и обладают очень хорошими стабилизирующими свойствами. При этом цвиттерион с полярным остатком нужно применять вместе с цвиттерионом с неполярным остатком. Такими цвиттерионами являются предпочтительно аминокарбоновые кислоты и их производные, особенно предпочтительно фармацевтически приемлемые аминокислоты. Под цвиттерионами понимают низкомолекулярные соединения, молекулярная масса которых ниже 10 кДа, предпочтительно ниже 5 кДа. Описываются способы, которые без использования повышенной температуры, то есть при комнатной температуре, позволяют высушивать предлагаемые согласно изобретению композиции так, что в случае композиций для стабилизации биологически активных, в особенности терапевтически активных, веществ достигают пригодных температур стеклования. Биологически активными веществами, наряду с терапевтически активными веществами, являются также вещества, используемые в биотехнологических способах, как, например, ферментация, а также такие вещества, которые используют, например, для защиты растения или в качестве инсектицидов. Такие биологически, в особенности терапевтически, активные материалы можно выбирать, например, из одного или нескольких веществ следующих групп: протеины, пептиды, гликопротеины, липопротеины, ферменты, коферменты, биологические мембраны, антитела, фрагменты антител, клетки, составные части клеток, вирусы, составные части вирусов, вакцины, ДНК, РНК, агглютинины (PNA), плазмиды, векторы, феромоны, биологически активные терапевтические и диагностические средства и их производные. Под биологически активными веществами не подразумевают никаких пищевых продуктов как таковых.

Особые преимущества описанных в данном случае композиций и способа состоят в том, что - избегают замораживания во время сушки; - высушивание можно осуществлять с помощью уже имеющихся в химико-фармацевтической промышленности установок для сушки вымораживанием без всякого переоснащения; - можно сохранять неизменной особенно предпочтительную для асептического приготовления расфасовку в стандартных сосудах, например в стеклянных пузырьках; - времена процесса сопоставимо со способами сушки вымораживанием и намного меньше; - можно использовать токсикологически безопасные вспомогательные вещества; - можно сберегать всю необходимую для замораживания энергию, резко снижать расход вредных для окружающей среды хладагентов; - полученные продукты представляют собой хорошо различимые, быстро снова растворяющиеся "лепешки"; - за счет быстрого достижения частично аморфного состояния биологический материал меньше деградирует, чем в описанных в уровне техники способах.

Установлено, что особые преимущества представленных в данном случае рецептур из определенных смесей сахаров и аминокислот, а также определенных смесей по меньшей мере из двух аминокислот также действительны, когда используют их в рамках других способов сушки, в которых избегают замораживания. Также при распылительной сушке, вальцовой сушке и т.д. известно действие добавок, ускоряющее высыхание, а также свойство композиций образовывать аморфные или частично аморфные системы.

Существенным является то, что имеются обнаруживаемые с помощью ДСК и/или рентгеноструктурного анализа или других пригодных способов значительные аморфные фракции и композиция не носит полностью кристаллического характера. Кристаллические композиции непригодны для достижения достаточной стабильности в случае чувствительных биологических веществ. Полностью аморфные композиции пригодны для стабилизации и таким образом предлагаемые согласно изобретению, особенно частично аморфные, композиции.

Описание фигур Фиг.1а: температуры стеклования отдельных смесей мальтоза-L-фенилаланин;
Фиг.1б: остаточная влажность отдельных смесей мальтоза-L-фенилаланин;
Фиг.2: дифрактограмма порошка высушенных в вакууме
(а) фенилаланина (содержание кристаллизационной воды 1,2%);
(б) мальтозы (содержание воды 4,0%; Тg [температура стеклования] = 50^oС) и
(в) фенилаланина и мальтозы, приготовленных согласно изобретению (содержание воды 0,7; Tg=88^oC).

Дифрактограммы сняты с помощью обычного прибора (Phillips 1730 X-ray) и относящегося к нему математического обеспечения; температура измерения составляет 25^oС; угол разрешения (2Θ) составляет 0,05^oС.

Условия измерения: 1 с. На угол при приложенном к трубке напряжении 40 киловольт и силе тока 40 миллиампер;
Фиг.3: временная зависимость
(а) остаточной влажности и
(б) температуры стеклования
композиции мальтоза/фенилаланин согласно изобретению.

Изобретение представлено в 13 примерах и 10 сравнительных примерах и поясняется ниже. При этом найдены готовые формы и способы, которые резко улучшают и ускоряют высыхание масс, содержащих сахар, с помощью вакуумной сушки и пригодны для стабилизации биологических материалов, имеющих значение для терапии и диагностики. Далее, указываются совершенно нового рода композиции, которые удовлетворяют цели стабилизации при сохранении оптимизированной характеристики сушки.

Композиции содержат предпочтительно либо по крайней мере один цвиттерион с неполярным остатком (например, аминокислота, как фенилаланин) и сахар, причем температура стеклования сахара за счет этой добавки цвиттериона значительно повышается. Альтернативно, также можно использовать смеси различных, специально подобранных аминокислот или их производных. Эти смеси составляют из цвиттериона с неполярным остатком и цвиттериона с полярным остатком. К этим смесям можно добавлять также еще сахар.

В качестве рабочей гипотезы найдено, что желательный согласно изобретению результат достигают особенно смесями сахара или полярного цвиттерионного вещества (как, например, аргинин, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота, гистидин, цитруллин, лизин) и неполярного цвиттерионного вещества (как, например, фенилаланин, изолейцин, метионин, валин, аланин, глицин, триптофан, цистеин) или их производных (как, например, этиловый эфир ацетилфенилаланина). Можно легко как изменять способ, так и расширять описанный в примерах список веществ.

Особенно предпочтительными биологически или терапевтически активными материалами являются антитела (моноклональные или поликлональные), ферменты и человеческие протеины, соответственно, человеческие пептиды, как, например, рекомбинантный человеческий эритропоэтин (rh-EPO), рекомбинантный человеческий фактор стимуляции колоний гранулоцитов (rh-G-CSF) или рекомбинантный плазминогенный активатор (rPA), nGF, PTH, уларитиды, плазмиды, вирусы, GUP, BP-5.

На композициях, не содержащих биологически активного вещества, определяют, каким образом добавление аминокислот изменяет высыхание матрицы из сахаров. В пример 1 показано, что добавление фенилаланина и аргинина к мальтозе изменяет ее поведение при высушивании в зависимости от введенного количества этих добавок. Температуру стеклования за счет целевой добавки этих вспомогательных веществ при одинаковых условиях высушивания можно повышать на величину выше 65^oС, остаточную влажность можно легко снижать до величины менее 1%. Из примера 1 следует, что используемый при этом способ приводит к желательному результату в течение 48 часов без всякого воздействия тепла. Мальтоза, без добавляемых согласно изобретению вспомогательных веществ, при этих условиях имеет остаточную влажность 7-8%, температура стеклования находится ниже комнатной температуры и, таким образом, эта система непригодна для стабилизации протеинов.

Получение предлагаемых согласно изобретению композиций из сахарозы и аминокислоты из группы аминокислот, пригодных согласно изобретению для получения стабилизирующих, частично аморфных продуктов позволяет избегать определенных недостатков при приготовлении препаративной формы с сахарозой, в то время как можно полностью сохранять присущие сахарозе преимущества. По сравнению с другими сахарами, упомянутыми в литературе, сахароза имеет относительно низкую температуру стеклования при соответственно нормированных содержаниях воды. Поэтому при приготовлении содержащих сахарозу, сухих композиций особенно трудно достигать высоких температур стеклования, которые отчетливо выше целевых температур хранения. Далее, путем сушки испарением вообще затруднительно переводить сахарозу в аморфную форму, сахар легко кристаллизуется и таким образом легко образует неблагоприятную для стабилизации биологически активных веществ кристаллическую структуру. Кроме того, можно наблюдать, что аморфные массы сахарозы в процессе хранения сравнительно быстро образуют в большом объеме кристаллы и по истечение определенных сроков хранения могут полностью кристаллизоваться. Также при этом процессе такого рода композиция теряет свои стабилизирующие свойства. Все эти связанные с применением сахарозы проблемы, опасности и недостатки можно устранять путем добавления согласно изобретению аминокислот соответствующей группы. При этом особенно предпочтительно использование фенилаланина и аргинина (пример 2). В сравнительном примере А показано, что также при использовании более длительных времен сушки и повышенных температур массы (утфельные массы), состоящие из одних сахаров, не могут эффективно высыхать. Улучшающего высыхание воздействия аминокислот и сахаров можно достигать как с помощью отдельных аминокислот, так и также с помощью смесей аминокислот. В примерах 3 и 4 на этот счет приводятся соответствующие результаты, полученные на системах мальтозы и сахарозы. Также обнаружены аминокислоты, которые не оказывают никаких улучшающих высыхание воздействий, например гистидин (сравнительный пример 1). В примере 5 показано, что наряду с аминокислотами улучшающими высыхание эффектами могут обладать также их структурно-родственные производные. Выбор аминокислот подробно, хотя и не исчерпывающе, описывается в примере 6. Установлено, что далеко не всякая аминокислота приводит к желательному эффекту, а только определенные аминокислоты. Также величина эффектов различная, так что можно указать особенно предпочтительные комбинации или композиции. Такими аминокислотами являются прежде всего фенилаланин, триптофан, лейцин и изолейцин. Из примеров 1 и 6, далее, можно сделать вывод, что возможна смесь аминокислот при сохранении улучшающего высыхание эффекта. Аргинин, используемый индивидуально, не оказывает никакого положительного воздействия, однако может оказывать в смеси с фенилаланином.

Исследовали поведение аминокислот при вакуумной сушке, чтобы установить, можно ли также без матрицы из сахара получать с помощью аминокислот композиции, которые имеют температуру стеклования выше комнатной. Неожиданно обнаружено, что используемая индивидуально чистая аминокислота образует только кристаллическую структуру, в то время как определенные соли аминокислот и смеси аминокислот образуют стекловидную матрицу (сравнительный, пример С и пример 7). Для получения аморфных структур необходимо целенаправленно выбирать различные аминокислоты. Неожиданно найдено, что аминокислоты можно разделять на две группы, которые очевидно обладают различными свойствами. Необходимо выбирать из каждой группы по крайней мере одну аминокислоту, приготовлять соответствующую смесь и высушивать ее. Как и при составлении смесей сахар-аминокислота, также в данном случае необходимо иметь определенное соотношение компонентов смеси, чтобы получить предлагаемые согласно изобретению композиции (пример 7). Тогда получают матрицу с аморфными фракциями, которая пригодна для стабилизации биологически активных веществ.

Эффективность улучшенного высыхания в отношении преследуемой цели, то есть стабилизации биологически активного материала, показанная на примере протеинов, подробно представлена в примерах 8-12 и сравнительных примерах D-J. В примерах 8 и 9 вместе со сравнительными примерами D-G описывается стабилизация rh-G-CSF, в примере 10 и сравнительном примере Н описывается стабилизация эритропоэтина и в примерах 11 и 12, а также в сравнительных примерах I и J описывается стабилизация лактатдегидрогеназы. Руководствуясь временами хранения протеина (rh-G-CSF, примеры 8 и 9 соответственно, сравнительные примеры D, Е и F, G), гликопротеина (rh-EPO, пример 10 и сравнительный пример Н) и фермента (лактатдегидрогеназа, примеры 11, 12 и сравнительные примеры I и J) показана, например, неожиданно сильно улучшенная стабильность при хранении предлагаемых согласно изобретению композиций по сравнению с подвергнутыми вакуумной сушке композициями без вспомогательных веществ и другими композициями. В примерах представлены изменения в различных композициях с rh-G-CSF в условиях хранения при различных температурах. Только предлагаемые согласно изобретению, то есть частично аморфные, стекловидные композиции спустя 6 месяцев не проявляют никакой деградации в диапазоне температур хранения от менее градуса Цельсия (холодильник) вплоть до 40^oС (примеры 8 и 9). Соответствующие композиции, не содержащие вспомогательного вещества и подвергнутые вакуумной сушке, (сравнительный пример D) при комнатной температуре и повышенной температуре хранения (40^oС) показывают отчетливое уменьшение содержания мономера вплоть до 20%. Не аморфные, но вязкие композиции, которые хранятся при температуре выше температуры стеклования, уже при комнатной температуре спустя 5 недель показывают значительное снижение концентрации мономеров (сравнительные примеры D+E). Кристаллические композиции (сравнительные примеры G и J) точно также имеют более короткие времена хранения. Из сравнения данных примера 8 и сравнительного примера Е видно, что при повышенной температуре хранения (40^oС) добавление аминокислот к мальтозе в качестве стабилизаторов более чем в 10 раз увеличивает время хранения, за которое агрегируются менее чем 10% мономеров G-CSF. Сравнение данных примера 9 с таковыми сравнительного примера G показывает, что также выбор аминокислот является решающим для значительно увеличенного времени хранения. Сравнение мономерной доли в случае гликопротеина ЕРО (пример 10, сравнительный пример Н) показывает, что предлагаемые согласно изобретению композиции в случае хранения при комнатной температуре и повышенной температуре отчетливо превосходят высушенный в вакууме ЕРО без вспомогательных веществ. При хранении в течение 5 недель чувствительного фермента лактатдегирогеназы в виде предлагаемых согласно изобретению композиций (примеры 11 и 12) по сравнению с высушенной в вакууме лактатдегидрогеназой без вспомогательных веществ (сравнительный пример I) и кристаллической композицией (сравнительный пример J) оказывается, что только предлагаемые согласно изобретению композиции могут храниться при комнатной температуре или при повышенной температуре (30^oС) без резкой потери активности. При этом интерес представляет также дополнительная стабилизация фермента за счет предлагаемой согласно изобретению композиции непосредственно после приготовления образцов (активность при 0 недель >80%, до 65% в случае не содержащей вспомогательных веществ композиции, соответственно, 10% в случае кристаллической композиции). Типичная зависимость от времени процесса сушки предлагаемой согласно изобретению смеси представлена в примере 13.

Для приготовления предлагаемых согласно изобретению смесей по крайней мере из двух аминокислот в целях получения быстровысыхающих, стекловидных композиций при необходимости по крайней мере одну аминокислоту и ее производные нужно выбирать из нижеуказанных двух групп:
группа 1: аргинин, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота, гистидин, цитрулин, лизин, орнитин;
группа 2: фенилаланин, изолейцин, лейцин, метионин, валин, аланин, глицин, триптофан, этиловый эфир ацетилфенилаланина, цистеин, саркозин.

Применение только одной аминокислоты или нескольких аминокислот только из одной из обеих групп не приводит к предпочтительным согласно изобретению композициям. Предлагаемые согласно изобретению смеси можно получать, как показано в примерах, тем, что к раствору стабилизатора биологически или терапевтически активных веществ примешивают цвиттерион с неполярным остатком, например фенилаланин или его производные, в различных количествах. Высушенные при комнатной температуре смеси затем исследуют с помощью ДСК для определения, обладают ли они повышенной за счет добавления цвиттериона температурой стеклования. При этом температура стеклования по сравнению с композициями без добавок согласно изобретению повышается на 10^oС, предпочтительно на 20^oС, особенно предпочтительно на 40^oС. Предлагаемые согласно изобретению предпочтительные композиции являются частично аморфными, имеют температуру стеклования выше 4^oС, предпочтительно выше 20^oС, особенно предпочтительно выше 40^oС, и обладают соответствующей остаточной влажностью менее чем 6%, предпочтительно менее чем 4%. Их кажущаяся плотность, соответственно, насыпной вес составляет величину по меньшей мере на 10%, предпочтительно на 50%, выше таковой соответствующих лиофилизатов. Они сохраняют свою хрупкую, стекловидную, компактную, частично аморфную структуру в течение по меньшей мере двух недель, предпочтительно двух месяцев, особенно предпочтительно в течение одного года. Кроме того, время их высыхания (то есть время, за которое достигают одинаковой остаточной влажности), по сравнению со смесями, которые содержат только углевод или цвиттерион с неполярным остатком, уменьшается предпочтительно на 25%, особенно предпочтительно в два раза или даже в четыре раза. Эти смеси веществ можно также размалывать или подвергать дальнейшей обработке, например использовать в терапевтических или диагностических средствах в комбинации с обычными вспомогательными веществами или носителями. Терапевтическими средствами являются лекарственные формы, которые содержат один или несколько терапевтически активных компонентов наряду с обычными вспомогательными веществами и добавками. Они могут находиться в форме таблеток, капсул с лекарством или твердых веществ, из которых путем добавления жидкости (например, стерильной воды или буфера) получают терапевтически активные растворы (например, растворы для внутривенного введения). Далее, они особенно пригодны для введения с помощью различных способов в виде твердых веществ, например, в виде спрея для носа, лекарственной формы для ингаляции или трансдермального порошка и т.д.

ПРИМЕР 1
Вакуумная сушка смесей мальтозы с L-аргинином и L-фенилаланином
Готовят раствор, содержащий 50 мг моногидрата мальтозы и 0,1 мг полисорбата 80 на мл. К нему затем добавляют возрастающие количества L-аргинина и L-фенилаланина в равных количествах (по массе). Таким образом, полученные растворы стерильно фильтруют (фильтр из нитрата целлюлозы; 0,22 мкм) и затем по 1 мл каждого раствора вносят в пузырьки емкостью 2 мл и затем закрывают пробками для сушки вымораживанием. Таким образом, подготовленные образцы подвергают вакуумной сушке одинаковым образом при температуре 20^oС в течение 48 часов при пониженном давлении. После высушивания определяют содержание воды в образцах по способу Карла Фишера и температуру стеклования с помощью дифференциального термического анализа (Перкин Эльмер DCS 7 - скорость нагревания образцов = 10^oС в минуту). Результаты измерения показывают, что поведение при высушивании мальтозы за счет добавления определенных количеств аминокислот отчетливо изменяется. Начиная с 7,5 г каждой аминокислоты содержание воды в образцах отчетливо снижается и температура стеклования соответственно этому повышается. При использовании 10 мг L-аргинина и 10 мг L-фенилаланина достигают значений, которые более не могут увеличиваться за счет дальнейшего повышения долей аминокислот в высушенном продукте. К раствору сахара, содержащему 50 мг моногидрата мальтозы и 0,1 мг полисорбата 80 на мл, добавляют возрастающие количества аминокислот. Полученные после высушивания продукты имеют указанные ниже содержания воды и температуры стеклования (см. табл.1).

ПРИМЕР 2
Вакуумная сушка смесей сахарозы с L-аргинином и L-фенилаланином
К раствору сахарозы, который содержит 50 мг сахарозы и 0,1 мг полисорбата 80 на мл, добавляют возрастающие количества L-аргинина и L-фенилаланина в равных количествах (по массе). Образцы готовят, высушивают и анализируют, как указано в примере 1. При использовании количеств аминокислот вплоть по 10 мг получают полностью кристаллические продукты. Лишь, начиная с 10 мг L-аргинина и 10 мг L-фенилаланина на мл можно идентифицировать частично аморфные продукты со стеклованием. В этом примере за счет добавления аминокислот улучшают не только поведение при высушивании раствора, но и с помощью этой добавки систему переводят в частично аморфное состояние. К раствору сахаров, содержащему 50 мг сахарозы и 0,1 мг полисорбата 80 на мл, добавляют возрастающие количества аминокислот. Полученные после высушивания продукты имеют нижеуказанные содержания воды и температуры стеклования (см. табл.2).

Сравнительный пример А
Вакуумная сушка чистых растворов сахаров
Готовят раствор моногидрата мальтозы и раствор сахарозы с концентрацией 50 мг/мл. Эти растворы сахаров затем фильтруют, расфасовывают и анализируют, как описано в примере 1. Обнаружено, что даже при высушивании в течение 72-х часов при температуре 50^oС при пониженном давлении невозможно высушить 50 мг сахара в пузырьке емкостью 2 мл до удовлетворительной остаточной влажности так, чтобы температура стеклования была выше 25^oС. Содержащий мальтозу продукт имеет вязкую консистенцию и остаточную влажность 6,4%. Стеклование происходит при 20^oС. В случае сахарозы имеются еще 6,0% остаточной воды, стеклование происходит при 14^oС. Для сравнения, чистые растворы сахаров также высушивают в течение 48 часов при температуре 20^oС и при пониженном давлении. Полученные продукты еще влажные и поэтому стеклование происходит при еще более низкой температуре, чем в случае высушенных при температуре 50^oС образцов. Этот опыт отчетливо показывает, что только за счет добавки определенных аминокислот можно высушивать слои сахаров в пузырьках для инъекции или подобных емкостях путем вакуумной сушки до незначительной остаточной влажности. Таким образом, налицо улучшенное поведение при высушивании за счет добавления аминокислот (см. табл.3).

ПРИМЕР 3
Вакуумная сушка смесей мальтозы с L-фенилаланином и мальтозы с L-изолейцином
В этом опыте готовят теперь бинарные смеси аминокислот с моногидратом мальтозы. Опыт проводят с целью проверки, обладают ли используемые здесь аминокислоты улучшающими высушивание свойствами и какова количественная зависимость улучшающего высушивание эффекта в случае отдельных аминокислот. К раствору, содержащему 50 мг моногидрата мальтозы на мл, добавляют возрастающие количества L-фенилаланина и L-изолейцина. Таким образом, приготовленные растворы стерильно фильтруют (фильтр из нитрата целлюлозы; 0,22 мкм) и затем по 1 мл каждого раствора вносят в пузырьки емкостью 2 мл и закрывают пробками для сушки вымораживанием. Таким образом, подготовленные образцы подвергают вакуумной сушке при температуре 20^oС и при пониженном давлении в течение 48 часов. После высушивания определяют содержание воды в образцах по способу Карла Фишера, в каждом случае четырехкратно и измеряют температуру стеклования с помощью дифференциального термического анализа (Перкин Эльмер DSC 7 - скорость нагрева образцов = 10^oС в минуту), используя по две пробы на смесь.

а) Результат в случае смесей мальтозы с L-фенилаланином
Результаты измерения отчетливо показывают положительное влияние L-фенилаланина на поведение мальтозы при высушивании. Уже незначительных количеств L-фенилаланина достаточно для того, чтобы повысить температуру стеклования сахара в стекловидном состоянии при сохранении условий высушивания примерно на 50^oС (фиг.1а и 1б). При содержании 10 мг/мл L-фенилаланина улучшающий высушивание эффект достигает максимума. Путем добавления больших количеств L-фенилаланина более невозможно достигать никакого улучшения. Таким образом, за счет добавления L-фенилаланина температура стеклования по сравнению с таковой чистой мальтозы повышается примерно на 80^oС. В случае больших количеств L-фенилаланина (10-20 мг/мл) в этом опыте нельзя обнаружить никакого различия в поведении при высушивании. Однако оно изменяется при более коротких временах высушивания. В этом случае при использовании возрастающих количеств L-фенилаланина можно наблюдать повышение температуры стеклования также в области 10-20 мг L-фенилаланина. В таблице 4 представлены количество L-аланина в растворе сахара, достигаемая в результате высушивания полученных растворов остаточная влажность и температура стеклования Тg.

Кроме того, снимают дифрактограммы порошка повергнутых вакуумной сушке фенилаланина, мальтозы и предлагаемой согласно изобретению смеси фенилаланина с мальтозой (фиг.2а, 2б, 2в). Чистый фенилаланин дает типичную дифрактограмму кристаллического вещества (фиг.2а), в то время как мальтоза имеет дифрактограмму аморфного вещества (фиг. 2а). Только в случае предлагаемой согласно изобретению смеси приходят к образованию частично аморфных структур, обнаруживаемому по дискретным максимумам дифракции на широком фоновом сигнале (фиг.2в).

6) Результат в случае смесей мальтозы с L-изолейцином
К концентрированному запасному раствору, содержащему 50 мг моногидрата мальтозы на мл, добавляют различные количества L-изолейцина и отдельные смеси высушивают при температуре 20^oС. С увеличивающимся количеством аминокислоты становится отчетливым улучшающий высушивание эффект. При добавлении 20 мг/мл L-изолейцина (соотношение компонентов смеси 5:2 по массе) Тg содержащего мальтозу продукта можно повышать примерно на 20^oС. В таблице 5 представлены количество L-изолейцина в растворе сахара, достигаемая в результате высушивания полученных растворов остаточная влажность и температура стеклования Тg.

ПРИМЕР 4. Вакуумная сушка смесей сахарозы с L-лейцином
В нижеследующих опытах готовят бинарные смеси сахарозы с различными аминокислотами. Эти опыты проводят с целью проверки, оказывают ли используемые аминокислоты на сахарозу воздействие, улучшающее высушивание. К раствору, содержащему 50 мг сахарозы на мл, добавляют возрастающие количества L-лейцина. Растворы обрабатывают, как описано в примере 3.

Результат случае смесей сахарозы с L-лейцином
С небольшими количествами L-лейцина сахароза образует кристаллический продукт. Это образование кристаллических продуктов можно было также наблюдать в примере 2 при использовании L-аргинина и L-фенилаланина. Следовательно, при смешении с определенными аминокислотами сахароза образует кристаллические продукты. Чистый сахар и смеси с большими количествами L-лейцина образуют системы, способные стекловаться. Это означает, что имеется частично аморфная структура. Так, обнаружено, что лишь концентрации L-лейцина начиная с 15 мг/мл улучшают характеристику высыхания чистой сахарозы и за счет добавления этой аминокислоты температуру стеклования можно повышать примерно на 18^oС. Таким образом, L-лейцин представляет собой аминокислоту с улучшающим высушивание эффектом. В табл.6 представлены количество L-лейцина в растворе сахара, достигаемая в результате высушивания полученных растворов остаточная влажность и температура стеклования Тg конечных продуктов.

Сравнительный пример В
Вакуумная сушка смесей сахарозы с L-гистидином
Опыты проводят, как указано в примере 4. Вместо L-лейцина используют L-гистидин. Смесь сахарозы с L-гистидином при вакуумной сушке образует аморфные продукты, в случае которых нельзя наблюдать никакого улучшающего высушивание эффекта. Независимо от соотношения компонентов смеси структуры высыхают плохо и остаточная влажность и температуры стеклования смесей имеют значения того же порядка, как и в случае результатов, получаемых при использовании чистого сахара. Следовательно, L-гистидин не обладает никаким улучшающим высушивание эффектом. В табл. 7 представлены количество L-гистидина в растворе сахара, достигаемая в результате высушивания этих растворов остаточная влажность и температура стеклования Тg конечных продуктов.

ПРИМЕР 5
Вакуумная сушка смесей сахарозы с L-триптофаном и сахарозы со сложным этиловым эфиром N-ацетил-L-фенилаланина (АРЕ)
В этом опыте готовят раствор с 10 мг L-триптофана на мл и раствор с 3 мг АРЕ на мл (АРЕ имеет только ограниченную растворимость в воде). К обоим растворам добавляют в возрастающих количествах сахарозу. Таким образом, полученные растворы обрабатывают и высушивают, как описано в примере 3. Для сравнения в этом опыте при таких же условиях сушки высушивают раствор сахарозы (концентрация 50 мг/мл). В получаемом из этого раствора конечном продукте остаточная влажность составляет 9,98% и температура стеклования составляет -6,25^oС.

а) В табл.8 представлены количество сахарозы в растворе L-триптофана (10 мг/мл), достигаемая в результате высушивания полученных растворов остаточная влажность и температура стеклования конечных продуктов.

б) В табл. 9 представлены количество сахарозы в растворе АРЕ (3 мг/мл), достигаемая в результате высушивания полученных растворов остаточная влажность и температура стеклования конечных продуктов.

Результаты показывают, что оба исследованных вещества, L-триптофан и АРЕ, обладают улучшающим высушивание эффектом. С помощью L-триптофана температура стеклования частично аморфного продукта при остающихся неизмененными условиях сушки может повышаться примерно на 45^oС. С помощью АРЕ возможно повышение температуры стеклования на 20^oС при остающихся неизмененных условиях сушки.

ПРИМЕР 6
Вакуумная сушка других смесей сахаров с аминокислотами
В этом опыте готовят бинарные смеси моногидрата мальтозы или сахарозы с L-аминокислотой. При этом к раствору сахара добавляют аминокислоты в количественных соотношениях сахар: аминокислота от 5:2 до 1:1. Опыт проводят с целью проверки, обладает ли соответствующая аминокислота в случае соответствующих сахаров улучшающим высушивание эффектом. Приготовление, обработку и высушивание растворов осуществляют, как описано в примере 4. В частности, речь идет о следующих смесях:
а) Смеси с моногидратом мальтозы (см. табл. 10).

б) Смеси с сахарозой (см. табл. 11).

Результаты высушивания показывают, что L-гистидин не оказывает никакого положительного влияния на поведение при высушивании сахаров (табл.10). L-серин ухудшает высыхание сахаров даже в еще большей степени (табл.11). L-лейцин, L-изолейцин и L-метионин обладают улучшающим высушивание эффектом (табл. 10). Это отчетливо видно, когда повышающиеся количества этих аминокислот добавляют к раствору сахара. В случае L-валина и L-аланина обнаруживают улучшение высыхания только при больших количествах аминокислоты в продукте. L-аргинин и L-глицин оказывают слабое положительное влияние. Очень хорошее действие L-фенилаланина на поведение при высушивании также отчетливо проявляется в случае бинарной смеси с сахарозой (табл.11). Продукт хорошо высыхает и имеет очень высокую температуру стеклования.

Сравнительный пример С
Вакуумная сушка растворов аминокислот или растворов солей аминокислот
Из отдельных аминокислот или солей отдельных аминокислот готовят растворы и стерильно фильтруют их (фильтр из нитрата целлюлозы; 0,22 мкм). В каждом случае 1 мл раствора помещают в пузырек емкостью 2 мл и закрывают пробкой для сушки вымораживанием. Таким образом, подготовленные образцы подвергают вакуумной сушке при температуре 20^oС и при пониженном давлении в течение 48 часов. После высушивания определяют содержание воды в образцах по способу Карла Фишера и измеряют температуру стеклования с помощью дифференциального термического анализа (Перкин Эльмер DSC 7 - скорость нагревания образца = 10^oС в минуту). В частности, высушивают следующие растворы и в результате получают нижеуказанные величины остаточной влажности и результаты измерения ДСК.

а) Аминокислоты (см. табл. 12).

б) Соли аминокислот (см. табл. 13).

Полученный результат показывает, что аминокислоты после вакуумной сушки находятся в кристаллическом состоянии. Только соли основных и кислых аминокислот во время этих условий высушивания образуют аморфные структуры, которые, однако, очень плохо высыхают и температура стеклования которых при выбранных условиях ниже комнатной температуры.

ПРИМЕР 7
Вакуумная сушка смесей L-аргинина с L-фенилаланином и смеси L-аргинина с L-изолейцином
В этом опыте готовят, обрабатывают, высушивают и исследуют различные смеси L-аргинина с L-фенилаланином, как описано в сравнительном примере С. В частности, готовят и высушивают следующие бинарные смеси (см. табл.14).

Этот опыт показывает, что путем смешения двух аминокислот, которые при индивидуальном высушивании дают кристаллические продукты, можно получать частично аморфные структуры. При выбранных соотношениях компонентов смеси они высыхают настолько хорошо, что в результате получают частично аморфные структуры с высокой температурой стеклования и низкой остаточной влажностью.

Представляет интерес тот факт, что при оптимальном соотношении компонентов смеси имеется высокая температура стеклования. В процессе этого опыта готовят еще раствор, содержащий по 0,15 моль L-аргинина и L-изолейцина (см. табл.15).

В этом случае получают продукт с температурой стеклования 53,27^oС и остаточной влажностью 1,05%. Путем смешения обеих кислот таким образом можно получать хорошо высушиваемую, частично аморфную структуру; по сравнению с солями аргинина неорганических кислот (сравнительный пример С) температура стеклования в данном случае повышается примерно на 50^oС.

ПРИМЕР 8
rh-G-CSF, высушенный в вакууме в рецептуре на основе мальтозы, содержащей L-аргинин и L-фенилаланин
Готовят раствор с содержанием 50 мг мальтозы, 10 мл L-фенилаланина и 10 мг L-аргинина на мл. Кроме того, этот раствор содержит 0,1 мг полисорбата 80 и 0,35 мг rh-G-CSF на мл. Значение рН рецептуры устанавливают равным 7,4 с помощью соляной кислоты. Содержащий протеин раствор готовят в асептических условиях и стерильно фильтруют (фильтр из поливинилиден-дифторида; 0,22 мкм). Затем по 1 мл каждого раствора вносят в пузырьки емкостью 2 мл. Заполненные и снабженные пробками для сушки вымораживанием пузырьки затем высушивают в течение 48 часов при температуре 20^oС в изотермических условиях при пониженном давлении. Получают сухой продукт с остаточной влажностью 1,16% и температурой стеклования 75^oС. Таким образом, полученные образцы хранят при различных температурах и спустя различные сроки хранения оценивают стабильность протеина.

В случае rh-G-CSF доля образовавшегося димера в полученном продукте служит хорошим критерием для оценки стабилизации продукта. Поэтому определенные с помощью эксклюзионной хроматографии (с условием 4-х одинарных измерений) количества мономеров и димеров служат мерой стабилизирующего действия композиций, приготовленных авторами настоящей заявки путем высушивания. При эксклюзионной хроматографии молекулы протеина из-за величины частиц отделяются в растворенном состоянии, то есть высокомолекулярные компоненты (димеры) отделяются от rh-G-CSF-мономеров. Исследование (селективная эксклюзионная хроматография высокого разрешения; HP-SEC) проводят на приборе для высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) фирмы Шимадзу при использовании автоматического пробоотборника (фирмы Вотерс ТМ 717). В качестве колонки для разделения используют колонку TSK-Gel G2000 SW (7,5•300 мм) фирмы Тозо-Haas. Детектирование отделенных компонентов осуществляют фотометрически при длине волны 214 нм (фотометр фирмы Шимадзу LG-GA). В качестве элюирующего средства используют 0,1 М натрий-калийфосфатный буфер, рН 6,2; объемная скорость потока составляет 0,6 мл/мин при комнатной температуре. Исследуемые образцы растворяют в бидистиллированной воде таким образом, чтобы снова получить исходную концентрацию (добавление 1 мл). Эти растворенные образцы затем хранят в охлажденном до температуры 6^oС автоматическом пробоотборнике вплоть до исследования. Впрыскиваемое количество пробы составляет 20 мкл (=7 мкг G-CSF), время прохождения пробы составляет 32 минуты. Оценку результатов осуществляют при использовании рабочего стандарта G-CSF. Для того чтобы можно было дополнительно провести количественную оценку продуктов, кроме того, при каждом определении содержания осуществляют гель-электрофорез в присутствии додецилсульфата натрия с окрашиванием красителем на основе серебра. Результаты гель-электрофореза в присутствии додецилсульфата натрия представлены в примере 8б, фиг.9. В водных растворах протеин полностью денатурируется при температурах от 45 до 47^oС в течение нескольких часов. С помощью этой рецептуры достигают стабилизации протеина даже при температуре хранения 50^oС в течение недели.

а) Стабильность rh-G-CSF в высушенной в вакууме рецептуре на основе мальтозы с L-аргинином и L-фенилаланином (см. табл.16).

Результаты эксклюзионной хроматографии четко показывают, что с помощью этой рецептуры можно стабилизировать протеин rh-G-CSF в такой высушенной в вакууме композиции в течение более продолжительного периода времени. Опыт показывает, что можно стабилизировать в течение длительного времени при температуре ниже температуры стеклования rh-G-CSF в высушенной в вакууме, частично аморфной, содержащей L-аргинин и L-фенил-аланин рецептуре на основе мальтозы.

б) Обзор результатов гель-электрофореза в присутствии додецилсульфата натрия всех рецептур, которые содержат биологически активное вещество rh-G-CSF
Сначала готовят содержащие додецилсульфат натрия полиакриламидные гели, из которых разделяющий гель содержит 15% акриламида и аккумулирующий гель содержит 3% акриламида и 1% додецилсульфата натрия. Подготовку образцов (проб) осуществляют таким образом, что готовят один смешанный образец из трех склянок для инъекции. Затем этот раствор образца разбавляют с помощью буфера, содержащего дитиотреитол (ДТТ) и бром-феноловый синий, так что получают концентрацию rh-G-CSF 150 мкг/мл. Образцы денатурируют в течение 5 минут при температуре 95^oС в предварительно нагретом нагревательном блоке. В качестве эталонных протеинов используют "набор эталонных протеинов для хроматографии с молекулярной массой 18 000-300 000" фирмы Берингер Маннхайм. Их подготавливают и обрабатывают точно также, как и образцы rh-G-CSF. Кроме того, готовят рабочий стандарт rh-G-CSF, который используют в качестве сравнения. Гель-электрофорез осуществляют с помощью миниатюрной установки для гель-электрофореза (фирма Фармация-ЛКБ 2050) и прилагаемого к ней прибора для (регулирования) напряжения. После того как налит буфер для электрофореза, в каждый гелевый "кармашек" вводят 20 мкл пробы (то есть, 3 мкг rh-G-CSF). После закрытия камеры для электрофореза и установления водяного охлаждения прикладывают напряжение 80 вольт, которое после того как пройден аккумулирующий гель, повышают до 130 вольт. Незадолго до того, как полоса бромфенолового синего достигает конца геля, электрофорез заканчивают. Гели удаляют из камеры и в течение короткого времени промывают бидистиллированной водой. После этого осуществляют окрашивание красителем на основе серебра с помощью набора "Daiichi 2D-silver-stain II" согласно содержащейся в нем инструкции. По окончании окрашивания проводят визуальную оценку гелей (см. табл.17).

При этом исследовании рецептуры примеров 8 и 9 показывают наличие только мономеров. В случае сравнительных примеров D и F наряду с мономером можно обнаружить еще диамеры, в случае примера Е, кроме того, дополнительно можно еще обнаружить тримеры. В кристаллической композиции на основе L-валина и L-глицина согласно сравнительному примеру G, кроме того, наблюдают присутствие еще двух продуктов деструкции, молекулярная масса которых меньше таковой мономера и двух слабых полос продуктов деструкции, молекулярная масса которых составляет величину между молекулярной массой мономера и таковой димера.

С помощью этих чувствительных методов очень хорошо можно наблюдать продукты деструкции и агрегации мономера, которые имеются в количествах >1%.

Сравнительный пример D
Вакуумная сушка rh-G-CSF без добавления вспомогательных веществ
В случае этого опыта готовят раствор, который содержит только протеин rh-G-CSF в концентрации 0,35 мг/мл в разбавленном фосфатном буфере (примерно 0,1 М). Этот протеиновый раствор готовят, обрабатывают и анализируют, как описано в примере 8. В случае этой композиции по техническим причинам было невозможно определить остаточную влажность и температуру стеклования конечных продуктов. Данные о стабильности rh-G-CSF, высушенного в вакууме без вспомогательных веществ, показаны в табл.18.

Данные о стабильности чистого протеина очень отчетливо показывают стабилизирующее действие вспомогательных веществ описанной в примере 8 рецептуры. Также в случае этой рецептуры при каждом исследовании проводят гель-электрофорез в присутствии додецилсульфата натрия с окрашиванием красителем на основе серебра.

Сравнительный пример Е
rh-G-CSF, высушенный в вакууме в рецептуре на основе чистой мальтозы
Готовят раствор, содержащий 50 мг моногидрата мальтозы, 0,1 мг полисорбата 80 и 0,35 мг rh-G-CSF на мл устанавливают рН-значение рецептуры равным 7,4 с помощью раствора гидроксида натрия. Исходный раствор и конечные продукты получают, обрабатывают и анализируют, как описано в примере 8. Как уже показано в примере 1, трудно высушить мальтозу без добавки аминокислот в течение 48 часов до незначительной остаточной влажности. Поэтому получают продукты с остаточной влажностью 10,43% и температурой стеклования - 2^oС. При температурах хранения, следовательно, выше температуры стеклования, нет никакого аморфного хрупкого стекла, а имеется высоковязкая, вязкоэластичная масса. Стабильность rh-G-CSF в высушенной в вакууме композиции на основе мальтозы без аминокислот показана в табл.19.

По поводу результатов гель-электрофореза в присутствии додецилсульфата натрия (см.пример 8б). Результат показывает, что невыгодно хранить rh-G-CSF в сахарной массе без аминокислот, стабильность отчетливо меньше, чем в случае высушенной в вакууме основной массы (сравнительный пример D) и оптимизированной, высушенной в вакууме рецептуры (пример 8).

Этот опыт ясно показывает необходимость добавления аминокислот к сахарам при вакуумной сушке, чтобы получать продукты с высокими температурами стеклования, в которых протеин стабилизируется за счет аморфной структуры вспомогательного вещества. Хранение продуктов ниже температуры стеклования является необходимостью для стабилизации биологически активного вещества. Еще нужно заметить, что в образцах, которые хранятся при температуре 40^oС и 50^oС, уже спустя 4 недели мальтоза полностью выкристаллизовывается. Таких физических изменений в образцах во время хранения нужно избегать; они ускоряют уменьшение содержания мономера.

ПРИМЕР 9
rh-G-CSF, высушенный в вакууме в рецептуре на основе L-аргинина с L-фенилаланином без сахара
Готовят раствор, содержащий 20 мг L-аргинина и 20 мг L-фенилаланина, 0,1 мг полисорбата 80 и 0,35 мг rh-G-CSF на мл. После установления рН-значения равным 7,4 с помощью соляной кислоты раствор обрабатывают, высушивают и анализируют, как описано в примере 8. По окончании высушивания получают однородный продукт с температурой стеклования 77,0^oС и остаточной влажностью 1,30%. Стабильность rh-G-CSF в высушенной в вакууме рецептуре на основе аргинина и фенилаланина показана в табл.20.

Результаты исследования стабильности четко показывают, что с помощью этой рецептуры можно в течение более продолжительного периода времени стабилизировать протеин rh-G-CSF в частично аморфной, высушенной в вакууме композиции на основе аминокислот, пока температуры хранения отчетливо ниже температур стеклования (см. также сравнительный пример С). Хранение при температуре 80^oС по сравнению с хранением при температуре 60^oС показывает этот феномен перехода в стекловидное состояние при температуре 77^oС.

Для того чтобы продукты можно было дополнительно оценить количественно, кроме того, при каждом определении содержания осуществляют гель-электрофорез в присутствии додецилсульфата натрия с окрашиванием красителем на основе серебра. Результаты этого гель-электрофореза в присутствии додецил-сульфата натрия представлены в примере 8б. Та же самая рецептура хранилась также при различных температурах в течение 1 года. Результаты представлены в таблице 20а:
Опыт показывает, что rh-G-CSF можно стабилизировать в высушенной в вакууме, частично аморфной рецептуре на основе L-аргинина с L-фенилаланином при температуре ниже температуры стеклования.

Сравнительный пример F
rh-G-CSF в высушенной в вакууме рецептуре на основе L-аргинина с фосфорной кислотой
Готовят раствор с 40 мг L-аргинина, 0,1 мг полисорбата 80 и 0,35 мг rh-G-CSF на мл. После установления значения рН равным 7,4 с помощью фосфорной кислоты раствор обрабатывают, высушивают и анализируют, как описано в примере 8. Высушенный конечный продукт имеет остаточную влажность 3,59% и температуру стеклования 8,6^oС. Следовательно, этот продукт по окончании высушивания при комнатной температуре не находится в виде хрупкого, аморфного стекла, а представляет собой высоковязкую, вязкопластичную массу. Стабильность rh-G-CSF в высушенной в вакууме рецептуре на основе L-аргинина показана в табл. 21.

Не достигают стабилизирующего эффекта, который получают в сухом, частично аморфном стекле (примеры 8 и 17). Это показывает значение подобранной смеси вспомогательных веществ, чтобы улучшить ее поведение при высушивании во время вакуумной сушки и, таким образом, иметь при комнатной температуре частично аморфные стекла. Это прежде всего выявляется при повышенных температурах (30^oС и 40^oС). По сравнению с высушенным в вакууме биологически активным веществом без вспомогательных веществ стабильность в этой массе повышена (см. сравнительный пример D). Для того чтобы можно было дополнительно количественно оценить продукты, при каждом определении содержания осуществляют гель-электрофорез в присутствии додецил-сульфата натрия с окрашиванием красителем на основе серебра. Результаты этого гель-электрофореза в присутствии додецил-сульфата натрия представлены в примере 8б.

Сравнительный пример G
rh-G-GSF, высушенный в вакууме в кристаллической рецептуре на основе L-валина с глицином
В раствор, который содержит по 20 мг L-валина и глицина и 0,1 мг полисорбата 80 на мл и рН-значение которого установлено равным 7,4 с помощью раствора гидроксида натрия, добавляют 0,35 мг rh-G-CSF. Приготовленный раствор обрабатывают, высушивают и анализируют, как описано в примере 8. Проведенное по окончании высушивания исследование показывает, что в случае готовых образцов речь идет о кристаллическом продукте с остаточной влажностью 0,82%. Стабильность rh-G-CSF в высушенной в вакууме кристаллической рецептуре на основе L-валина с глицином показана в табл. 22.

Этот результат четко показывает, что кристаллическая рецептура аминокислот даже при низких содержаниях влажности не может стабилизировать rh-G-CSF. По сравнению с высушенным в вакууме без вспомогательных веществ rh-G-CSF отчетливо проявляется дестабилизирующий эффект такой композиции (см. сравнительный пример D).

Для того чтобы можно было дополнительно количественно оценить продукты, при каждом определении содержания осуществляют гель-электрофорез в присутствии додецилсульфата натрия с окрашиванием красителем на основе серебра. Результаты этого гель-электрофореза в присутствии додецилсульфата натрия представлены в примере 8б.

ПРИМЕР 10
Вакуумная сушка эритропоэтина в содержащей L-аргинин и L-фенилаланин рецептуре на основе сахарозы
Готовят раствор с 50 мг сахарозы, 10 мг L-аргинина, 10 мг L-фенилаланина и 0,1 мг полисорбата 20 на мл. В этот раствор добавляют 5000 Ед эритропоэтина (ЕРО) на мл и устанавливают рН-значение равным 7,2 с помощью фосфорной кислоты. Раствор обрабатывают и высушивают, как описано в примере 8. Получают сухой, частично аморфный продукт с остаточной влажностью 0,56% и температурой стеклования 86,6^oС. В случае ЕРО доля образовавшегося димера в полученном продукте служит хорошим критерием для оценки стабилизации продукта. Поэтому определенные с помощью эксклюзионной хроматографии (с условием 3-х одинарных измерений) количества мономеров и димеров являются мерой стабилизирующего действия композиций, получаемых авторами настоящей заявки путем высушивания.

При эксклюзионной хроматографии протеиновые молекулы из-за своей величины частиц отделяются в растворенном состоянии, то есть высокомолекулярные компоненты (димеры) отделяются от ЕРО-мономера. Исследование (HP-SEC) проводят на ВЭЖХ-установке фирмы Шимадзу при использовании автоматического пробоотборника (Gilson Abimed 231). В качестве колонки для разделения используют колонку TSK-Gel G3000 SWXL (7,9х300 мм) фирмы TosoHaas. Детектирование отделенных компонентов осуществляют фотометрически при длине волны 280 нм (фирма Мерк; флуоресцентный спектрометр 820 FP). В качестве элюирующего средства применяют 0,4 М натрий-калий-фосфатный буфер с хлоридом натрия, рН 7,3 при объемной скорости потока 0,6 мл/мин при комнатной температуре. Исследуемые образцы растворяют в бидистиллированной воде таким образом, чтобы снова получить исходную концентрацию (добавление 1 мл). Эти растворенные образцы затем хранят в автоматическом пробоотборнике вплоть до исследования. Впрыскиваемое количество образца составляет 100 мкл (=2 мкг ЕРО), время прохождения пробы составляет 25 минут. Оценку результатов проводят при использовании рабочего стандарта ЕРО.

Стабильность ЕРО в высушенной в вакууме, содержащей L-аргинин и L-фенилаланин рецептуре на основе сахарозы показана в табл. 23.

Результат показывает, что ЕРО можно стабилизировать путем вакуумной сушки с выбранной согласно данному случаю комбинацией вспомогательных веществ. Для того чтобы можно было дополнительно количественно оценить продукты, кроме того, при каждом определении содержания осуществляют гель-электрофорез в присутствии додецилсульфата натрия с окрашиванием красителем на основе серебра. Приготовление гелей, осуществление электрофореза и окрашивание гелей осуществляют, как описано в примере 8б. Подготовку образцов осуществляют так, что из трех склянок для инъекции получают один смешанный образец. Затем этот раствор образца разбавляют буфером, содержащим бромфеноловый синий, таким образом, что концентрация ЕРО составляет 20 мкг/мл. Образцы денатурируют в предварительно нагретом нагревательном блоке в течение 5 минут при температуре 95^oС. В качестве эталонных протеинов используют набор "Bio-Rad Standard Low". Эти протеины подготавливают и обрабатывают точно также, как и образцы ЕРО. Кроме того, готовят рабочий стандарт ЕРО, который используют в качестве сравнения. Гель-электрофорез осуществляют с помощью миниатюрной установки для гель-электрофореза (фирмы Фармация - ЛКБ 2050) и прилагаемого к ней прибора для (регулирования) напряжения. После того как налит буфер для электрофореза, в каждый гелевый "кармашек" вносят по 20 мкл образца (то есть 400 нг ЕРО). По окончании окрашивания проводят визуальную оценку гелей и гели фотографируют. С помощью этого чувствительного метода могут очень хорошо проявляться продукты деструкции и агрегации мономера, которые находятся в количествах >1%.

Результат электрофореза
В случае описанной здесь рецептуры во всех образцах спустя 9 недель в геле можно обнаруживать только полосы мономера соответственно рабочему стандарту. Это подтверждает стабильность протеина в этой композиции.

Сравнительный пример Н
Вакуумная сушка эритропоэтина без добавления вспомогательных веществ
В этом опыте готовят исходный раствор, который содержит только биологически активное вещество ЕРО (50 000 Ед/мл) в разбавленном фосфатном буфере (концентрации примерно 5 мМ). Раствор готовят, обрабатывают и высушивают, как описано в примере 8.

В случае этой композиции по техническим причинам было невозможно определить остаточную влажность и температуру стеклования в конечных продуктах, так как имеющиеся количества в пузырьке были слишком незначительны (примерно 0,2 мг). Стабильность протеина оценивают с помощью эксклюзивной хроматографии, как описано в примере 10.

Стабильность ЕРО, высушенного в вакууме без вспомогательных веществ.

Также при каждом определении содержания осуществляют гель-электрофорез в присутствии додецилсульфата натрия с окрашиванием красителем на основе серебра. Приготовление гелей, подготовку образцов, проведение электрофореза и окрашивание гелей осуществляют, как описано в примере 10. После окрашивания гелей в образцах каждой температуры хранения наряду с относящейся к мономеру полосой, соответственно полосе рабочего стандарта, можно отчетливо обнаружить относящуюся к димеру полосу. Этот опыт наглядно поясняет стабилизирующее действие используемой в примере 10 комбинации вспомогательных веществ. Стабильность чистого биологически активного вещества в этом примере по сравнению со стабильностью биологически активного вещества в рецептуре примера 10 отчетливо снижена; можно наблюдать образование димера. Чем выше температура хранения, тем отчетливее становится защитное действие выбранной комбинации вспомогательных веществ в опыте 10.

ПРИМЕР 11
Лактатдегидрогеназа, высушенная в вакууме в рецептуре на основе мальтозы с L-аргинином и L-фекилаланином
Готовят раствор с 50 мг моногидрата мальтозы, 10 мг L-аргинина и 10 мл L-фенилаланина на мл. К этому раствору добавляют лактатдегидрогеназу (LDH) так, чтобы достигалась активность протеина 165 Ед/мл. рН-значение раствора устанавливают равным 7,0 с помощью фосфорной кислоты. Раствор готовят, обрабатывают и высушивают, как описано в примере 8. После высушивания получают однородный продукт с температурой стеклования 96^oС и остаточной влажностью 0,82%. Готовые образцы хранят при различных температурах и спустя различные сроки хранения оценивают активность протеина. В случае LDH определяют ферментативную активность в качестве меры стабильности протеина. Это определение проводят фотометрически. В растворе образца с помощью никотинамид-адениндинуклеотид-фосфата (NADH) при каталитическом воздействии LDH пируват восстанавливается до лактата и никотинамид-аденин-динуклеотида (NAD). За уменьшением содержания NADH в растворе можно следить фотометрически (λ=365 нм; ε= 3,3 см²/мкмоль). Активность определяют в разбавленных в 100 или 200 раз исходных растворах в пластмассовой кювете (толщина слоя = 1 см) (спектрофотометр UV/VIS 552 фирмы Перкин Эльмер). Из уменьшения в единицу времени можно рассчитать активность протеина LDH. Активность исходного раствора соответствует значению 100%.

Стабильность LDH в высушенной в вакууме, содержащей аргинин и фенилаланин рецептуре на основе мальтозы показана в табл. 25.

Опыт отчетливо показывает стабилизирующее действие рецептуры для очень чувствительного протеина LDH.

Сравнительный пример I
Вакуумная сушка лактатдегидрогеназы без добавления вспомогательных веществ
В этом опыте готовят раствор чистого биологически активного вещества лактатдегидрогеназы (LDH) с активностью 136 Ед/мл в разбавленном фосфатном буфере (концентрация 8 мМ). Раствор готовят, обрабатывают и высушивают, как описано в примере 8. В случае этой композиции по техническим причинам невозможно было определить остаточную влажность и температуру стеклования конечных продуктов, так как имеющиеся количества в пузырьке были слишком незначительны (примерно 0,2 мг). Стабильность протеина оценивают, как описано в примере 11. Активность исходного раствора соответствует значению 100%. Стабильность высушенной в вакууме без вспомогательных веществ LDH показана в табл. 26.

Этот опыт наглядно показывает стабилизирующее действие используемой в примере 11 комбинации вспомогательных веществ. Стабильность чистого биологически активного вещества в этом примере отчетливо снижена по сравнению со стабильностью биологически активного вещества в рецептуре примера 11. Чем выше температура хранения, тем отчетливее защитное действие выбранной комбинации вспомогательных веществ в опыте 11. Различие между стабильностью чистого протеина и протеина, высушенного в комбинации вспомогательных веществ, отчетливее всего в случае лактатдегидрогеназы.

ПРИМЕР 12
Лактатдегидрогеназа в высушенной в вакууме рецептуре на основе L-аргинина с L-фенилаланином, не содержащей сахара
Готовят концентрированный запасной раствор с 20 мг L-аргинина и 20 мг L-фенилаланина на мл. К этому раствору после установления значения рН 7,0 с помощью фосфорной кислоты добавляют лактатдегидрогеназу (LDH) таким образом, что получают исходный раствор с активностью протеина 168 Ед/мл. Раствор готовят, обрабатывают и высушивают, как описано в примере 8. После высушивания получают однородный продукт с температурой стеклования 103,9^oС и остаточной влажностью 1,18%. Готовые образцы хранят при различных температурах и спустя различные сроки хранения оценивают активность протеина. Аналитические исследования в отношении протеина осуществляют, как описано в примере 11. Активность исходного раствора до высушивания соответствует значению 100%.

Стабильность лактатдегидрогеназы в высушенной в вакууме, не содержащей сахара композиции на основе L-аргинина с L-фенилаланином показана в табл. 27.

Опыт отчетливо показывает стабилизирующее действие этой композиции на основе аминокислот во всем исследованном температурном интервале. Стабильность LDH четко повышена по сравнению с высушиванием чистого биологически активного вещества (сравнительный пример I).

Сравнительный пример J
Лактатдегидрогеназа, высушенная в вакууме в кристаллической рецептуре на основе L-валина с глицином
Готовят концентрированный запасной раствор с 20 мг L-валина и 20 мг глицина на мл. К этому раствору после установления значения рН 7,0 с помощью раствора гидроксида натрия добавляют лактатдегидрогеназу (LDH) таким образом, что получают исходный раствор с активностью протеина 147 Ед/мл. Раствор готовят, обрабатывают и высушивают, как описано в примере 8. После высушивания получают однородный, полностью кристаллический продукт с остаточной влажностью 1,12%. Готовые образцы хранят при различных температурах и после определенных сроков хранения определяют активность протеина, как описано в примере 11. Активность исходного раствора до высушивания соответствует значению 100%.

Стабильность лактатдегидрогеназы в высушенной в вакууме полностью кристаллической рецептуре на основе L-валина с глицином показана в табл. 28.

Этот опыт четко показывает, что кристаллическая рецептура на основе аминокислот во время вакуумной сушки оказывает очень отрицательное влияние на фермент. Уже во время высушивания, то есть во время образования кристаллической структуры, теряются 90% активности. Также при хранении при различных температурах нельзя сохранить еще имеющуюся активность. Спустя 5 недель исходные значения для образцов еще более ухудшаются. Следовательно, кристаллическая рецептура на основе аминокислот совершенно непригодна для стабилизации лактатдегидрогеназы.

ПРИМЕР 13
В этом опыте высушивают в вакууме раствор из одной мальтозы (50 мг/мл) и раствор, содержащий мальтозу и фенилаланин (40 мг/мл мальтозы и 10 мг/мл фенилаланина). Параллельно получают такого рода композиции с добавлением 10 мкг/мл rh-ngf или 100 мкг/мл РТН (1-37) или 500 мкг/мл уларитидов. Растворы после приготовления стерильно фильтруют и вносят в пузырьки емкостью 2 мл. Образцы высушивают в вакууме при температуре 20^oС и спустя заданное количество времени из обеих рецептур отбирают пробы. В отобранных образцах определяют остаточное количество загрузки, содержание воды по способу Карла Фишера и температуру стеклования. В течение всего времени высушивания температуру пластин поддерживают при 20^oС. Давление в камере постепенно снижают вплоть до примерно 10^-3 мбар. Масса содержимого пузырьков в случае обеих рецептур за 7 часов уменьшается примерно до 6%, то есть растворы очень быстро концентрируются. В случае рецептуры с одной мальтозой сначала образуется пересыщенный раствор, который затем переходит в смолообразное состояние. При дальнейшем процессе высушивания незначительное преимущество обнаруживают в уменьшении массы в случае содержащей фенилаланин композиции по сравнению с раствором одного сахара. По окончании высушивания в случае образцов с мальтозой в пузырьках находится еще примерно 5,5% первоначальной массы содержимого, в то время как в случае смеси мальтозы с фенилаланином в пузырьках находится еще примерно 4,9% количества исходного содержимого.

Этот результат становится еще более отчетливым, когда вместо изменения массы содержимого пузырька рассматривают изменение содержания воды в образцах. В начале высушивания раствор состоит на 95,08% из воды, то есть на пузырек приходится примерно 965 мг воды. Целью является сухой продукт с остаточной влажностью 1-2%. При количестве твердого вещества 50 мг, соответственно, эти 1-2% в таком случае составляют 0,5-1 мг воды на пузырек. Соответственно этому, во время высушивания из образца сублимировать примерно 99,95% имеющейся воды, чтобы получить сухой продукт. В прогрессирующей стадии высушивания содержание воды в образцах определяют по способу Карла Фишера. В содержащих фенилаланин образцах это осуществляют путем прямого внесения образцов в метанольный раствор. Очень липкий сахар нельзя вводить непосредственно в метанольный раствор. Его сначала растворяют в диметилформамиде. Затем определяют содержание воды в этом растворе. На фиг. 3а представлены результаты таким образом проведенного определения остаточной воды. Очень отчетливо видно преимущество композиции, содержащей аминокислоту. Уже после 17 часов высушивания содержание остаточной воды снижается до 2,7%, в то время как в рецептуре на основе мальтозы оно еще составляет 13,59%. Этот результат показывает преимущество раствора, содержащего фенилаланин. При этих условиях способа в течение 48 часов невозможно высушить мальтозу. По окончании высушивания при комнатной температуре всегда еще имеется "каучук" со значительным содержанием остаточной воды. Наряду с содержаниями остаточной воды также определяют температуры стеклования отдельных образцов с помощью дифференциальной сканирующей калориметрии. Так как температуры стеклования находятся в прямом соответствии с содержанием воды в образцах, отчетливо более высокие значения имеет смесь мальтозы с фенилаланином. Результат показывает, что температура стеклования смесей аминокислот с сахарами уже спустя примерно 10 часов находится в области температуры пластин. Соответствующие измеренные значения представлены на фиг.3б. Так как в этой стадии высушивания испаряется только еще немного воды, то температура продукта также находится в области температуры пластин. Таким образом, уже спустя 10 часов протекания процесса высушивания в пузырьках при комнатной температуре имеется стекло. В случае стабилизации протеинов с помощью такой рецептуры это означает, что протеин уже спустя 10 часов погружается в стабилизирующее стекло. Время, в течение которого протеин пребывает в концентрированном растворе или в "каучуке", очень короткое, что имеет большое преимущество для стабильности биологически активного вещества. Чистый сахар, напротив, даже по окончании высушивания при комнатной температуре находится еще в виде "каучука" и таким образом в случае продукта, содержащего протеин, не наблюдается никакого стабилизирующего воздействия на биологически активное вещество.

Различные содержащие протеин композиции по физическим остаточным значениям не отличаются от базисных рецептур, не содержащих биологически активное вещество.

Формула изобретения

1. Способ получения сухих, частично аморфных продуктов, которые наряду с одним или несколькими веществами из групп протеинов, человеческих пептидов, гликопротеинов, липопротеинов, ферментов, коферментов, антител, фрагментов антител, вирусов, составных частей вирусов, клеток и составных частей клеток, вакцин, ДНК, РНК, агглютининов (PNA) и их производных содержат стабилизирующие смеси веществ, для которых, по меньшей мере, по одному веществу выбирают из группы: (i) моносахариды, дисахариды или цвиттерион с полярным остатком, представляющий собой аргинин, аспарагиновую кислоту, цитруллин, глутаминовую кислоту, орнитин, гистидин, лизин, и их производные и (ii) цвиттерион с неполярным остатком, представляющий собой сложный эфир ацетилфенилаланина, аланин, цистеин, глицин, изолейцин, лейцин, метионин, фенилаланин, триптофан, валин, саркозин и их производные, заключающийся в том, что готовят раствор одного или нескольких веществ из групп протеинов, человеческих пептидов, гликопротеинов, липопротеинов, ферментов, коферментов, антител, фрагментов антител, вирусов, составных частей вирусов, клеток и составных частей клеток, вакцин, ДНК, РНК, агглютининов и их производных и указанных веществ из групп (i) и (ii) и раствор высушивают без его замораживания.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что раствор дополнительно содержит вспомогательные вещества из групп буферов, поверхностно-активных веществ, антиоксидантов, изотонических средств, консервантов.

3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что высушивание осуществляют путем вакуумной сушки.

4. Способ по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что вакуумную сушку осуществляют непрерывным способом высушивания.

5. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что высушивание осуществляют путем распылительной сушки.

6. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что высушивание осуществляют путем вальцовой сушки.

7. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что высушивание осуществляют путем инфракрасного излучения, микроволнового излучения или других способов сушки инфракрасными лучами.

8. Способ по любому из пп.1-7, отличающийся тем, что указанный цвиттерион с неполярным остатком выбирают таким образом, что высушенный продукт имеет повышенную температуру стеклования по сравнению с температурой стеклования продукта в отсутствии указанного цвиттериона с неполярным остатком.

9. Способ по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что высушивание осуществляют в установке для сушки вымораживанием без предварительного замораживания.

10. Способ по любому из пп.1-4, 8 или 9, отличающийся тем, что высушивание продуктов осуществляют в сосудах, предназначенных для одноразовой дозы.

11. Способ по любому из пп.1-9, отличающийся тем, что полученный продукт затем размалывают до порошка.

12. Сухие, частично аморфные продукты, содержащие наряду с одним или несколькими веществами из групп протеинов, человеческих пептидов, гликопротеинов, липопротеинов, ферментов, коферментов, антител, фрагментов антител, вирусов, составных частей вирусов, клеток и составных частей клеток, вакцин, ДНК, РНК, агглютининов и их производных, стабилизирующие смеси веществ, для которых, по меньшей мере, по одному веществу выбирают из следующих групп: (i) моносахариды, дисахариды или цвиттерион с полярным остатком, представляющий собой аргинин, аспарагиновую кислоту, цитруллин, глутаминовую кислоту, ортитин, гистидин, лизин, и их производные и (ii) цвиттерион с неполярным остатком, представляющий собой сложный эфир ацетилфенилаланина, аланин, цистеин, глицин, изолейцин, лейцин, метионин, фенилаланин, триптофан, валин, саркозин и их производные, характеризующиеся тем, что продукты за счет добавки одного или нескольких веществ из группы цвиттерионов с неполярным остатком (ii) обладают повышенной температурой стеклования по сравнению с продуктами, содержащими вещества из группы (i) без добавки указанного цвиттериона с неполярным остатком, причем полученные продукты не являются лиофилизатами.

13. Продукты по п.12, отличающиеся тем, что они получены согласно способу по любому из пп.1-11.

14. Продукты по п.12 или 13, отличающиеся тем, что температура стеклования находится выше 4^oС, предпочтительно выше 20^oС и остаточная влажность составляет менее 6 мас.%, предпочтительно менее 4 мас.%.

15. Продукты по любому из пп.12-14, отличающиеся тем, что они имеют, по меньшей мере, на 10% более высокую кажущуюся плотность, чем лиофилизаты.

16. Продукты по любому из пп.12-15, отличающиеся тем, что они имеют хрупкую, частично аморфную, стекловидную, компактную структуру.

17. Продукты по любому из пп.12-16, отличающиеся тем, что они сохраняют частично аморфную структуру в течение сроков хранения, по меньшей мере, 2 недели.

18. Продукты по любому из пп.12-17, отличающиеся тем, что времена их высушивания сокращены, по меньшей мере, вдвое по сравнению с продуктами, содержащими вещества из группы (i).

19. Продукты по любому из пп.12-18, отличающиеся тем, что пригодны для получения диагностических средств.

20. Продукты по любому из пп.12-18, отличающиеся тем, что пригодны для получения терапевтических композиций.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9, Рисунок 10, Рисунок 11, Рисунок 12, Рисунок 13, Рисунок 14, Рисунок 15, Рисунок 16, Рисунок 17, Рисунок 18, Рисунок 19, Рисунок 20, Рисунок 21, Рисунок 22, Рисунок 23, Рисунок 24, Рисунок 25, Рисунок 26, Рисунок 27, Рисунок 28, Рисунок 29, Рисунок 30, Рисунок 31, Рисунок 32, Рисунок 33, Рисунок 34, Рисунок 35