Способ моделирования внутриутробного инфицирования на фоне инфекции мочевыводящих путей

 

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано в акушерстве, гинекологии, педиатрии, неонатологии, фармакологии, микробиологии, физиологии, лабораторной диагностике. Способ позволяет разработать модель внутриутробного инфицирования, развивающуюся на фоне инфекционно-воспалительного процесса мочевыводящих путей и максимально приближенную к аналогии подобного процесса в человеческом организме. Проводят трехразовое введение взвеси микроорганизмов Escherichia coli штамма О₆ в мочевой пузырь беременной крысы в количестве 0,1 мл в концентрации 1•10⁷ КОЕ/мл на каждые 100 г массы животного. 6 табл.

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано в акушерстве, гинекологии, педиатрии, неонатологии, фармакологии, микробиологии, физиологии, лабораторной диагностике.

В зарубежной и отечественной справочно-информационной литературе аналогов заявляемому способу моделирования внутриутробного инфицирования нет.

Задача изобретения - разработать модель внутриутробного инфирования, развивающуюся на фоне инфекционно-воспалительного процесса мочевыводящих путей и максимально приближенную к аналогии подобного процесса в человеческом организме.

Выполнение поставленной задачи осуществляют путем трехразового введения взвеси микроорганизмов Escherichia coli штамма О₆ в мочевой пузырь беременной крысы.

Способ осуществляют следующим образом.

В качестве подопытных животных используют белых беспородных крыс, потому что крысы обладают максимально близким к человеческому типом взаимоотношений материнского и фетального кровообращения, гемохориальным характером плацентации и дискоидальным типом плаценты одновременно [2, 3], то есть морфофункциональное строение плаценты и плацентарного барьера при внешне несопоставимой разнице между организмами крысы и человека очень близко к идентичности. Следовательно, использование белых крыс в качестве лабораторных животных позволяет проводить экстраполяцию результатов эксперимента.

Для моделирования инфекционно-воспалительного процесса в качестве инфекционного агента используют кишечную палочку -Escherichia coli (Е. coli) на следующем основании. Во-первых, сочетание беременности и урогенитальной инфекции приводит к возникновению одной из наиболее частых патологий беременности - гестационному пиелонефриту, т.е. пиелонефриту, возникающему или проявляющемуся во время беременности. Ведущая этиологическая роль в возникновении гестационного пиелонефрита принадлежит Е. coli [8]. Во-вторых, она является наиболее частой этиологическим причиной формирования осложненной инфекции мочевыводящих путей вообще. Среди большой разновидности эшерихий по О-антигену выбор был остановлен на сероваре кишечной палочки О₆, потому что этот серотип Е. coli наблюдается при обструктивных и необструктивных формах урогенитальной инфекции и занимает при этом второе место по высеваемости [5] . Занимающий первое место по высеваемости серотип кишечной палочки О₉ использовать нецелесообразно в связи с тем, что Е. coli О₉, как возбудитель урогенитальной инфекции, свои патогенные качества реализует только в условиях обструкции мочевыводящих путей [4]. Следовательно, использование кишечной палочки серотипа О₆ с точки зрения вероятности воспроизведения инфекционно-воспалительного процесса в мочевыводящих путях представляется наиболее оправданным.

С этой целью штамм Е. coli О₆, производимый Государственным НИИ стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов имени Л.А. Тарасевича, культивируют на питательных средах в условиях термостата. Стерильным физиологическим раствором готовят смыв колоний Е. coli О₆ суточного возраста. Для заражения животных используют взвесь Е. coli О₆ в концентрации микробных тел 1*10⁷ КОЕ/мл, приготовленную методом последовательных серийных десятикратных разведений.

Соблюдая правила асептики и антисептики, катетер через уретру вводят в мочевой пузырь, а затем через катетер с помощью шприца в мочевой пузырь вводят взвесь микроорганизмов. На каждые 100 г массы животного вводят 0,1 мл взвеси микроорганизмов в концентрации 1•10⁷ КОЕ/1 мл.

Для осуществления катетеризации мочевого пузыря крысу под легким эфирным наркозом иммобилизируют на спине. Процесс иммобилизации крысы на спине с окончанием действия эфирного наркоза всегда сопровождался актом мочеиспускания. Этот факт свидетельствует о том, что мочевой пузырь опорожнен и позволяет ввести в него определенный объем жидкости. Во избежание инициации повторного рефлекторного мочеиспускания у крысы за счет раздражения терморецепторов стенки мочевого пузыря температура шприца, его содержимого и катетера с помощью термостата поддерживают на уровне температуры внутренних органов крысы - 37,0^oС. Кроме того, во избежание раздражения механорецепторов стенки мочевого пузыря с инициацией повторного рефлекторного мочеиспускания используют малый объем жидкости - 0,1 мл на 100 г массы тела крысы. Это связано с тем, что объем внутрипузырной жидкости 0,1 мл и объем мочевого пузыря при массе тела крысы 100 г соотносятся между собой как 1/7-1/5. Следовательно, заполнение пустого мочевого пузыря на 1/7-1/5 его объема жидкостью, имеющей температуру, равную температуре внутренних органов крысы, не будет инициировать рефлекторное мочеиспускание. Это предположение было подтверждено собственными наблюдениями: катетеризация мочевого пузыря у иммобилизованного на спине животного с введением жидкости в мочевой пузырь при соблюдении вышеописанных условий ни разу не сопровождалась рефлекторным актом мочеиспускания.

Сразу после введения через катетер стерильного физиологического раствора или взвеси микроорганизмов в полость мочевого пузыря катетер извлекают из уретры, а животное освобождают от иммобилизации.

Все подопытные животные по объему воздействия были разделены на 4 группы (табл.1).

I группа животных - это контрольная группа животных. Животным этой группы иммобилизацию и катетеризацию не проводят. II, III и IV группы животных - это опытные группы. Каждому животному из этих групп один раз в сутки и три дня подряд производят катетеризацию мочевого пузыря. Животным второй группы в мочевой пузырь вводят стерильный физиологический раствор в расчете 0,1 мл физиологического раствора/100 г массы животного. Животным третьей и четвертой групп вводят взвесь Е. coli О₆ в концентрации 1•10⁷ КОЕ/1 мл стерильного физиологического раствора в расчете 0,1 мл взвеси/100 г массы крысы. Катетеризацию мочевого пузыря с введением в его полость взвеси микроорганизмов осуществляют для животных III группы - на 2-4-й дни беременности, для животных IV группы - на 11-13-й дни беременности.

Такая структура эксперимента позволяет на примере второй группы выявить негативное влияние иммобилизации и катетеризации на процессы гестации; на примере третьей и четвертой групп животных установить наличие инфекционно-воспалительного процесса в мочевыводящих путях и внутриутробного инфицирования.

Для оценки условий течения и исхода беременности, протекающей у крыс в среднем 21-22 дня, животных всех четырех групп накануне родов - на 20-й день беременности - подвергают эвтаназии. При этом проводят ряд гравиметрических, гематологических, биохимических и микробиологических исследований.

В табл. 2 приведены объективные данные хода беременности на 20-й день беременности.

Наличие одинаковых показателей выживаемости животных и вынашиваемости беременности в группах I и II свидетельствует об отсутствии негативного влияния наркотизации животного с целью иммобилизации и самой иммобилизации на гестационные процессы. Примерное совпадение среднего количества плодов в абсолютных и относительных цифрах у животных этих групп отражает отсутствие эмбриотоксического эффекта трехразовой эфирной наркотизации легкой степени и стрессового влияния трехразовой иммобилизации беременной самки на спине.

Выживаемость самок в группах III и IV по сравнению с группой I указывает, что введение взвеси Е. coli О₆ не приводит к развитию септических состояний. Примерно одинаковый результат по сравнению с контролем наблюдается и по вынашиваемости беременности (90,9% и 81,8% против 90,9%). В то же время, при отсутствии статистической достоверности различий между абсолютными значениями среднего количества плодов в группах III и IV, отмечается тенденция к их снижению в относительных величинах. Так, если принять среднее значение плодов в группе I за 100%, то значение среднего числа плодов в группе III составит 84,25%, в группе IV - 91,95%.

Таким образом, по данным табл. 2 можно утверждать, что использование инфекционного агента не оказывает решающего влияния на объективные параметры условий протекания беременности, то есть на выживаемость беременной крысы-самки и вынашиваемость беременности. В то же время, инфицирование мочевыводящих путей во время беременности имеет тенденцию негативного влияния инфекционного агента на гестационные процессы в виде снижения вынашиваемости беременности и снижения среднего количества плодов, определяемых в полости матки.

В табл. 3 приведены данные гравиметрических измерений. Значения учитываемых признаков между группами I и II практически совпадают. Следовательно, различия между группами I и III, I и IV будут связаны с инфицированием мочевыводящей системы.

На первый день беременности средняя масса животных во всех группах практически совпадает. Средняя масса самок к 20-му дню беременности увеличивается, а средний прирост массы тела самки в группах III и IV имеют наибольшие значения (35,22 г и 30,78 г соответственно против 22,40 г в контроле). Следовательно, процесс протекания беременности в группах III и IV имеет особенности по сравнению с контрольной группой. В группе IV средние массы плода, плаценты, средняя масса плодов и плацент в вынашиваемом помете имеют тенденцию к росту выше контрольных значений, а в группе III - ниже контрольных. Это следует оценивать как срыв адаптационных процессов материнского организма в метаболическом обеспечении фетоплацентарного комплекса у животных группы III в декомпенсированной, а у животных группы IV в компенсированной форме.

Следовательно, можно утверждать, что создание у беременной крысы-самки инфекции мочевыводящей системы в обе половины беременности приводит к нарушению нормального хода беременности.

В табл. 4 приведены данные гематологических исследовании.

Гематологические данные групп I и II практически совпадают. Характер изменения гематологических величин в группах III и IV по сравнению с контролем имеет особенности. Для этих экспериментальных групп характерна тенденция: снижение количества эритроцитов, уровня гемоглобина и увеличение числа лейкоцитов. Изменение лейкоцитарной формулы в этих группах характеризуется тенденцией к нейтрофилии, моноцитозу, лимфопении. Выявляемые изменения лейкоцитарной формулы отражают наличие воспалительной реакции у беременных крыс. Увеличение индекса интоксикации в группах III и IV также подтверждает наличие отягощенного протекания беременности. Таким образом, введение инфекционного агента беременным крысам отражается в гематологических параметрах в виде воспалительной реакции с интоксикационным синдромом.

Для выявления внутриутробной инфекции в качестве биоматериала используют стенку матки, плаценту, околоплодные воды, плодовую печень.

Посев стенки матки, плаценты, печени плода и материнской почки производят методом отпечатков с последующим распределением бактериологической петлей по поверхности питательной среды. Посев околоплодных вод осуществляют путем втирания в поверхность питательной среды. Посев с соблюдением всех правил асептики производят в течение ближайших минут с момента эвтаназии животного. Культивирование, идентификацию выделенных культур осуществляют согласно Приказу 535 МЗ СССР от 22 апреля 1985 года [6].

Посев материнской почки производили для подтверждения существования первичного очага инфекционного процесса в организме, локализующегося в мочевыводящих путях. С целью выявления любого возможного инфекционного агента посевы проводили на неселективные среды - отдельно для выделения аэробов, отдельно для анаэробов. Роста колоний на анаэробных средах не наблюдали ни в одном случае. На аэробных средах наблюдали рост колоний только одного вида микроорганизмов, которые были подвергнуты дальнейший идентификации на питательных средах [6].

В табл. 5 приведены результаты идентификации и частоты высеваемости. Они свидетельствуют, что вводимая в мочевыводящие пути во время беременности кишечная палочка высевалась в конце беременности из почки. С учетом способа инфицирования это свидетельствует о локализации первичного инфекционного очага в мочевыводящих путях. Высеваемость кишечной палочки из фетоплацентарной системы (плаценты, околоплодных вод, плодовой печени) к окончанию беременности отражает реализацию процесса внутриутробного инфицирования. Совпадение серотипа кишечной палочки, вводимой в мочевой пузырь, высеваемой из почки и фетоплацентарного комплекса, доказывает материальную взаимосвязь этих процессов.

Таким образом, введение инфекционно-воспалительного агента E. coli О₆ в мочевыводящие пути в различные сроки беременности приводит к возникновению внутриутробного инфицирования.

Выбор концентрации микроорганизмов для введения в мочевой пузырь беременной крысы связан с тем, что истинная бактериурия при инфекции мочевыводящих путей составляет 1•10⁵ КОЕ/1 мл мочи [1, 7]. Поэтому использование взвеси микробных тел в концентрации 1•10⁷ КОЕ/1 мл с введением этой взвеси из расчета 0,1 мл взвеси на 100 г веса животного при массе животных в 150-200 г предполагает введение дозы микробов в количестве (1,5-2)(10⁶ КОЕ. Таким образом, концентрация микробных тел 1•10⁷ КОЕ/мл позволяет одновременно: 1) осуществить введение дозы микроорганизмов на 1 порядок выше истинной бактериурии, то есть дозы 1•10⁶ КОЕ/100 г массы, с целью создания инфекционно-воспалительного процесса мочевыводящих путей, 2) осуществить количественное введение инфекционного агента пропорционально массе тела, а следовательно, и полостям мочевыводящей системы.

Выбор трехразового введения микроорганизмов сделан на основе экспериментального подбора (табл.6) и объясним тем, что одноразовое введение даже более высокой дозы микроорганизмов не приводит к развитию урогенитальной инфекции и внутриутробного инфицирования, а увеличение числа введений приводит к резкому снижению вынашиваемости беременности.

Это подтверждает известные данные о том, что вероятность развития инфекции мочевыводящих путей определяется гормональным фоном беременности и нарушением уродинамики во время беременности [5,8]. Поэтому использование трехразового введения взвеси микроорганизмов в мочевой пузырь является обязательным условием воспроизведения внутриутробного инфицирования.

На основании полученных результатов объективного наблюдения, гравиметрических, гематологических и микробиологических исследований можно утверждать, что введение в мочевыводящие пути беременной крысы взвеси микроорганизмов Escherichia coli О₆ в различные сроки беременности приводит к возникновению внутриутробного инфицирования.

Из достоинств предлагаемого способа моделирования внутриутробного инфицирования можно выделить следующие моменты: 1) способ реализован на животных, имеющих максимально близкое с человеческим сходство гистоморфологических параметров плацентарного барьера, что позволяет с достаточной уверенностью экстраполировать результаты опыта на человеческой организм, 2) протяженность беременности крыс в 21-22 дня позволяет проводить эксперименты в относительно непродолжительные сроки, 3) воспроизведение первичного источника инфекционно-воспалительного процесса в мочевыводящих путях материнского организма имеет реальную сопоставимость с проблемой внутриутробного инфицирования для человека, 4) развитие процесса внутриутробного инфицирования в эксперименте протекает без очевидных признаков нарушенного хода беременности, что характерно для протекания подобного процесса и у человека, 5) проведение эксперимента на крысах имеет низкую себестоимость исследований, особенно при сравнении стоимости подобного эксперимента на приматах.

Таким образом, упоминаемые достоинства предлагаемого способа позволяют считать его адекватной моделью процесса внутриутробного инфицирования, имеющего место у человека. Экспериментальное исследование патогенеза внутриутробного инфицирования по предлагаемому способу позволит определять направления коррекции и профилактики формирующейся патологии беременности с целью предупреждения рождения неполноценного потомства.

Источники информации 1. Арбулиев М.Г., Арбулиев К.М., Османов Г.М. К вопросу лечения гнойного пиелонефрита // Урология и нефрология. - 1997. - 6.-С.14-17.

2. Говорка Э. Плацента человека. - Варшава: Пол. гос. мед. изд-во, 1970. -471с.

3. Брусиловский А. И. Функциональная морфология плацентарного барьера человека. - Киев: Здоров'я, 1976.-136 с.

4. Идентификация возбудителей инфекций мочевыводящих путей у детей / В. И. Кириллов, Л.Т. Теблоева, Е.Б. Алексеев и соавт. // Педиатрия. - 1997.- 6. -С.8-13.

5. Лопаткин Н. А., Деревянко И.И. Неосложненные и осложненные инфекции мочеполовых путей. Принципы антибактериальной терапии // Русский медицинский журнал. - 1997, Т.5.- 24.-С.1579-1588.

6. Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях, лечебно-профилактических учреждениях /Приказ 535 МЗ СССР от 22 апреля 1985 г. - М., 1985. -127 с.

7. Особенности сочетанного течения беременности и пиелонефрита в современных условиях / С.С. Заяц, И.А. Логинов, Г.М. Перцева, И.В. Смирнова / Мат 4-й межобластной научно-практ. конф. "Актуальные проблемы акушерства и гинекологии", 8-9 октября 1998 г., Волгоград. - Волгоград, 1998.-С.125-127.

8. Шехтман М.М. Экстрагенитальная патология и беременность. -Л.: Медицина. 1987.-С.174-181.

Формула изобретения

Способ моделирования внутриутробного инфицирования на фоне инфекции мочевыводящих путей, включающий трехразовое введение взвеси микроорганизмов Escherichia coli штамма О₆ в мочевой пузырь беременной крысы в количестве 0,1 мл в концентрации 1•10⁷ КОЕ/мл на каждые 100 г массы животного.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3