Способ получения иммунотропных веществ из кожи свиньи
Изобретение относится к иммунологии, иммунофармакологии, медицинской биотехнологии и фармацевтической промышленности, а именно к способу получения иммунотропных веществ из кожи свиньи. Способ включает измельчение, гомогенизацию кожи, центрифугирование, термоденатурацию супернатанта, центрифугирование денатурированного материала, обработку супернатанта охлажденным ацетоном, отмывку осадка охлажденным ацетоном, высушивание, растворение осадка и центрифугирование, с последующей хроматографией на колонке с Сефадексом G-50 и сбором фракции целевого продукта с молекулярной массой 1400-15000 Д, обессоливанием и лиофилизацией, где центрифугирование растворенного осадка проводят при 8000-10000 g в течение 10-20 мин при 4-6oС, к супернатанту прикапывают насыщенный раствор сульфата аммония в соотношении 2:1-3:1, центрифугируют при 8000-10000 g в течение 40-50 мин при 4-6oС, доводят рН полученного супернатанта до 3,5-4,5 прикапыванием 8-10%-ного раствора уксусной кислоты, добавляют сухой сульфат аммония из расчета 14-15 г - на 100 мл супернатанта, центрифугируют при 10000-12000 g в течение 20-30 мин при 4-6oС, гомогенизируют осадок в 0,01-0,02 М трис-HCl рН 7,5-8,5, прикапывают к гомогенату насыщенный раствор сульфата аммония в соотношении 1:1-1,5:1, центрифугируют при 16000-18000 g в течение 20-30 мин при 4-6oС, осадок гомогенизируют в 30-50 мл 0,01-0,02 М трис-HCl + 0,14-0,15 М NaCl рН 7,5-8,5, центрифугируют при 16000-18000 g в течение 20-30 мин при 4-6oС, а при хроматографии на колонке с Сефадексом G-50 одновременно собирают фракцию с молекулярной массой выше 15000 Д. Технический результат: изобретение позволяет увеличить активность получаемых иммунотропных веществ и получить вещества, влияющие как на В-, так и на Т-систему иммунитета. 3 табл.
Изобретение относится к иммунологии, иммунофармакологии, медицинской биотехнологии и фармацевтической промышленности. Иммунотропные вещества из кожи после соответствующих испытаний могут найти применение как лекарственные средства для иммунокоррекции в качестве иммуномодуляторов.
Известен способ получения тимопоэтина из эмбриональной кожи крупного рогатого скота путем ее измельчения в растворе бикарбоната аммония, центрифугирования, ультрафильтрации, центрифугирования, гель-хроматографии, гидрофобной хроматографии, анионообменной хроматографии в системе высокоэффективной жидкостной хроматографии, обессоливания и лиофилизации [1]. Однако процесс получения технологически довольно сложен, выход препарата незначителен, этап разделения путем высокоэффективной жидкостной хроматографии трудно применить при промышленном получении препарата. Иммунотропное вещество тимопоэтин, полученное из эмбриональной кожи крупного рогатого скота описанным выше методом, обладает активностью в иммунологических тестах: индуцирует дифференцировку протимоцитов и стимулирует образование циклического GMP в Т-клеточной линии СЕМ. Однако оно обнаружено лишь в эмбриональной коже и отсутствует в коже крупного рогатого скота. В качестве прототипа взят наиболее близкий к настоящему изобретению способ получения иммунотропных веществ из кожи свиньи путем измельчения кожи в растворе хлористого натрия, центрифугирования, нагревания, центрифугирования, обработки надосадочной жидкости ацетоном, центрифугирования, хроматографии на Сефадексе G-50, обессоливания и лиофилизации [2]. Этот же способ ранее был запатентован как способ получения вещества с молекулярной массой от 1400 до 15000 Д из кожи свиньи, влияющего на пролиферацию и дифференцировку кератиноцитов человека [3]. Однако, применяя этот метод, получают два иммунотропных вещества; одно - с молекулярной массой более 15000 Д и другое - с молекулярной массой от 1400 до 15000 Д, стимулирующие В-систему иммунитета. Они увеличивают количество антителообразующих клеток селезенки мышей на пике первичного иммунного ответа. Однако эти вещества не влияют на Т-систему иммунитета в тесте восстановления чувствительности фоновых розеткообразующих клеток селезенки тимэктомированных мышей к ингибирующему действию азатиоприна. Цель изобретения - увеличить активность получаемых иммунотропных веществ с помощью заявляемого метода так, чтобы они влияли и на В- и на Т-систему иммунитета. Эта цель достигается тем, что в способ, взятый в качестве прототипа, были введены три этапа высаливания сульфатом аммония. До стадии получения "ацетонового порошка" этапы методов совпадают: кожу свиньи измельчают, гомогенизируют в растворе хлористого натрия, центрифугируют, подвергают термоденатурации при 75-85oС в течение 10-20 мин, центрифугируют при 5000-15000 g в течение 10-30 мин, обрабатывают охлажденным до -20oС (или ниже) ацетоном в соотношении 1: 6-1: 8, высушивают "ацетоновый порошок" при комнатной температуре. Далее вводятся следующие этапы: "ацетоновый порошок" растворяют в 0,005-0,015 М растворе трис-HCl буфера рН 6,0-8,0, центрифугируют при 8000-10000 g в течение 10-20 мин при 4-6oС; осадок отбрасывают, а к супернатанту прикапывают насыщенный раствор сульфата аммония в соотношении 2:1-3: 1, центрифугируют при 8000-10000 g в течение 40-50 мин при 4-6oС, доводят рН супернатанта до 3,5-4,5 с помощью 8-10% раствора уксусной кислоты, добавляют сухой сульфат аммония из расчета: 14-15 г на 100 мл супернатанта, центрифугируют при 10000-12000 g в течение 20-30 мин при 4-6oС, гомогенизируют осадок в 0,01-0,02 М трис-НСl рН 7,5-8,5, прикапывают к гомогенату насыщенный раствор сульфата аммония в соотношении 1:1-1,5:1, центрифугируют при 16000-18000 g в течение 20-30 мин при 4-6oС. Далее делают по прототипу: гомогенизируют осадок в 30-50 мл 0,01-0,02 М трис-НСl + 0,14-0,15 М NaCl рН 7,5-8,5, центрифугируют при 16000-18000 g в течение 20-30 мин при 4-6oС, хроматографируют на колонке с Сефадексом G-50, собирают две фракции: одну с молекулярной массой выше 15000 Д и другую - с молекулярной массой от 1400 до 15000 Д, обессоливают и лиофилизируют. Температура термоденатурации 75-85oС и время термоденатурации подобраны таким образом, что нужные вещества остаются в растворе, в то время как часть неактивного материала денатурируется. Центрифугирование при 5000-15000 g в течение 10-30 мин и температуре 4-6oС подобраны так, что при этих параметрах денатурированные белки удаляются. При центрифугировании ниже 5000 g и менее 10 мин часть денатурированного неактивного материала остается в супернатанте, что загрязняет препарат. Увеличивать скорость центрифугирования более 15000 g и время более 30 мин не имеет смысла, т.к. при этих условиях денатурированный материал полностью осаждается. Изменение соотношения вес порошка после обезжиривания: объем воды менее 1:4 и более 1:6 приводит к загрязнению препарата. Три стадии высаливания сульфатом аммония подобраны таким образом, что удаляется неактивный материал и супрессорные вещества, а активный материал остается и подвергается очистке. Выбор концентрации буфера (0,005-0,015 М) и его рН (6,0-8,0) обусловлен тем, что в нем не происходит потери активности получаемых веществ, в то же время препараты хорошо разделяются по молекулярным массам на Сефадексе G-50. Хлористый натрий до концентрации 0,14-0,15 М добавляется к буферу для того, чтобы можно было определять активность веществ в пробах сразу после разделения на Сефадексе. Определяли активность иммунотропных веществ в двух тестах: тесте Ерне и азатиоприновом тесте. В тесте Ерне определяли влияние иммунотропных веществ на количество антителообразующих клеток (АОК) селезенки мышей СВА на пике первичного иммунного ответа [2, 4]. Эритроциты барана вводили внутрибрюшинно в 0,5 мл физиологического раствора в концентрации 400 млн/мл. Одновременно подкожно вводили испытуемые препараты в дозе 1, 10 и 100 мкг на мышь. На пятые сутки животных забивали, выделяли селезенки и подсчитывали число зон гемолиза в чашках Петри. Определяли процент АОК по отношению к контролю, принимая среднюю арифметическую в контрольной группе за 100%. Все результаты соотносили со средней арифметической в контрольной группе. В азатиоприновом тесте Баха определяли влияние иммунотропных веществ на восстановление чувствительности фоновых розеткообразующих клеток (фРОК) селезенки тимэктомированных мышей к ингибирующему действию азатиоприна [5]. Мышей-самцов С 57 В 1/6 тимэктомировали в возрасте 6-8 недель для создания модели частичного иммунодефицита по Т-системе иммунитета и брали в опыт через 2-8 недель после операции. Получали суспензию клеток селезенки. В опытные пробы помимо азатиоприна добавляли испытуемые препараты до конечной концентрации 1, 5, 10, 20, 50 и 100 мкг/мл. Подсчитывали количество фРОК селезенки тимэктомированных мышей на 104 ядросодержащих клеток. Результаты выражали в процентах фРОК по формуле![](https://img.findpatent.ru/img_data/58/586482.gif)
![](https://img.findpatent.ru/chr/177.gif)
![](https://img.findpatent.ru/chr/8226.gif)
![](https://img.findpatent.ru/chr/177.gif)
Формула изобретения
Способ получения иммунотропных веществ из кожи свиньи, включающий измельчение, гомогенизацию кожи в растворе хлористого натрия, центрифугирование, термоденатурацию супернатанта при температуре 75-85oС в течение 10-20 мин, охлаждение смеси до 4oС, центрифугирование денатурированного материала при 5000-15000 g в течение 10-30 мин при 4oС, обработку супернатанта охлажденным до -20oС или ниже ацетоном в соотношении 1:6-1:8, отмывку выпавшего осадка охлажденным ацетоном, высушивание при комнатной температуре, растворение осадка в 0,005-0,015 М растворе трис-HCl буфера рН 6,0-8,0 и центрифугирование, с последующей хроматографией на колонке с Сефадексом G-50 и сбором фракции целевого продукта с молекулярной массой 1400-15000 Д, обессоливанием и лиофилизацией, отличающийся тем, что центрифугирование растворенного осадка проводят при 8000-10000 g в течение 10-20 мин при 4-6oС, к супернатанту прикапывают насыщенный раствор сульфата аммония в соотношении 2:1-3:1, центрифугируют при 8000-10000 g в течение 40-50 мин при 4-6oС, доводят рН полученного супернатанта до 3,5-4,5 прикапыванием 8-10%-ного раствора уксусной кислоты, добавляют сухой сульфата аммония из расчета 14-15 г - на 100 мл супернатанта, центрифугируют при 10000-12000 g в течение 20-30 мин при 4-6oС, гомогенизируют осадок в 0,01-0,02 М трис-HCl рН 7,5-8,5, прикапывают к гомогенату насыщенный раствор сульфата аммония в соотношении 1:1-1,5:1, центрифугируют при 16000-18000 g в течение 20-30 мин при 4-6oС, осадок гомогенизируют в 30-50 мл 0,01-0,02 М трис-HCl + 0,14-0,15 М NaCl pH 7,5-8,5, центрифугируют при 16000-18000 g в течение 20-30 мин при 4-6oС, а при хроматографии на колонке с Сефадексом G-50 одновременно собирают фракцию с молекулярной массой выше 15000 Д.РИСУНКИ
Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3