Способ идентификации свиней, резистентных к кишечным заболеваниям, ассоциированным с е.сoli, способ разведения свиней, резистентных к кишечным заболеваниям, ассоциированным с e.coli, выделенная днк-молекула (варианты) , молекулярный анализ для обнаружения рецепторов е.сoli f- 18 у свиней и набор для обнаружения рецепторов е.сoli f-18

 

Изобретение относится к области ветеринарии, в частности к разведению животных. Предложена выделенная ДНК-молекула, которая является полиморфной по свиному гену альфа-(1,2)-фукозилтрансферазы 1. Предложен способ идентификации свиней, резистентных к кишечным заболеваниям, ассоциированным с E. coli, предусматривающий исследование биологического образца, взятого у свиньи, на наличие полиморфного гена альфа-(1,2)-фукозилтрансферазы 1. Предложен способ разведения свиней, резистентных к кишечным заболеваниям, ассоциированным с E.coli, у которых ген альфа-(1,2)-фукозилтрансферазы 1 является полиморфным. Также предложен молекулярный анализ для обнаружения рецепторов E. coli F18 у свиней и набор для осуществления анализа. Данные о полиморфизме гена альфа-(1,2)-фукозилтрансферазы 1, полученные с помощью настоящего изобретения, позволяют дифференцировать резистентных свиней от восприимчивых, проводить диагностический тест и разводить свиней, которые будут генетически резистентны к заболеваниям, ассоциированным с F18 E.coli. 6 с. и 5 з.п. ф-лы, 4 табл., 1 ил.

Изобретение относится к композициям и к неинвазивным способам идентификации свиней, генетически резистентных к заболеваниям, ассоциированным с E. coli, а в частности к кишечным заболеваниям, ассоциированным со штаммом бактерии E. coli и передаваемым фимбрией F18. Было установлено, что ДНК-полиморфизм по гену альфа(1,2)-фукозилтрансферазы (FUT1) у свиней позволяет дифференцировать резистентных свиней от восприимчивых свиней и проводить диагностический тест, который может быть использован в свиноводстве.

Главная проблема в свиноводстве заключается в содержании здорового поголовья свиней. Актуальной проблемой являются кишечные расстройства у поросят после отъема. Ограниченное число серотипов токсогенных штаммов Escherichia (E. ) coli являются этиологическими факторами отечной болезни и диареи у поросят после отъема, особенно у поросят в возрасте 4-12 недель, и являются причиной серьезных экономических потерь на свиноводческих фермах во всем мире. Типичными клиническими симптомами отечного заболевания являются неврологические признаки, такие как атаксия, судороги и паралич. При патологоанатомическом исследовании отек обычно наблюдается в характерных участках, таких как веки и лоб, стенки желудка и брыжейка ободочной кишки. Эти болезни вызываются вариантом Шига-подобного токсина-II и энтеротоксинами, LT, STa, STb соответственно, продуцируемыми E.coli, которая колонизирует поверхность тонкой кишки, не вызывая при этом значительных морфологических изменений энтероцитов (клеток в тонком кишечнике). В этом отношении некоторые типы бактериальных штаммов E. coli, F18, F4 и К88 являются главной причиной гибели животных. "Отечная болезнь свиней представляет собой энтеротоксемию, характеризующуюся генерализованным повреждением сосудов. Эта энтеротоксемия вызывается токсином, вариантом Шига-подобного токсина-II, продуцируемым некоторыми штаммами E.coli" (Bertschinger et al., 1993). Бактерии E.coli отличаются по типам их пилей, группе связанных друг с другом адгезивных фимбрий, которые обозначаются, например, К88 или F18 (Vogeli et al., 1997).

Не все свиньи подвержены Е.coli-инфекции. Заражение этой бактерией зависит от прилипания (адгезии) этой бактерии к энтероцитам, которое опосредуется бактериальными фимбриями, обозначаемыми К88 или F18. Было показано, что восприимчивость к адгезии у свиней, то есть экспрессия у них рецепторов для связывания с фимбриями, генетически регулируется хозяином и наследуется как доминантный признак; причем в случае F18 В обозначает аллель восприимчивости, а b обозначает аллель резистентности (Vogeli et al., 1996; Meijerink et al., 1996). Генетический локус для F18-рецептора E.coli (ECF18R) был картирован на свиной хромосоме 6 (SSC6), исходя из его тесного генетического сцепления с локусом S и другими локусами группы сцепления с галотаном (HAL) на хромосоме 6. Рецептор для К88 E.coli находится на хромосоме 13.

Очевидно, что механизм резистентности ограничен кишечником, поскольку резистентные животные не подвергаются колонизации E.coli, то есть эта бактерия не прилипает к стенкам кишечника резистентных свиней. Было показано, что гликопротеновые рецепторы в мембране каймы щеточек ответственны за различия между адгезивным и неадгезивным фенотипами, относящимися к некоторым E.coli, а поэтому резистентность свиньи-хозяина определяется его генотипом. Были также исследованы бактерии с фимбриями (WO 94113811).

Современные методы идентификации свиней, которые являются резистентными к заболеваниям, ассоциированным с F18 E.coli, предусматривают: либо 1) сбор кишечных проб у свиней при их забивании и проведение микроскопического теста на адгезию, либо 2) заражение животных вирулентной E.coli ("тест на колонизацию"), либо 3) определение группы крови в системе групп крови А-O(S). Первые два метода практически не применяются для идентификации резистентных животных в целях их использования в качестве племенного поголовья. Хотя метод определения группы крови позволяет идентифицировать резистентных животных, однако, этот тест не дает возможности определить, являются ли восприимчивые животные гомозиготными или гетерозиготными по гену восприимчивости. Сведения о генотипе животных в отношении этих аллелей (состояний гена) являются очень важными для разработки программы эффективного разведения животных. Целью этой программы по разведению свиней является получение свиней, резистентных к заболеваниям, ассоциированным с F18 E.coli и приводящим к гибели племенного поголовья поросят после отъема.

В одной из публикаций, в связи с отечной болезнью у свиней, авторы указывают, что "Исследования направлены на поиск соответствующих генетических маркеров. .." (Bertschinger et al., 1993, page 87) и, цитируя Walters и Sellwood,1982, сообщают, что: Разведение резистентных свиней является привлекательным методом предупреждения заболеваний, для которых не существует эффективных мер профилактики. Эффективность этого метода зависит от доминирования гена (генов), кодирующего резистентность у поголовья свиней; от усовершенствованных методов идентификации резистентных свиней; и от отсутствия негативных генетических признаков, отбираемых совместно с этой резистентностью.

Локус генетического "маркера" представляет собой кодирующий или некодирующий локус, который сцеплен с нужным генетическим локусом, но не обязательно он должен быть им самим. Детектируемые фенотипы включают непрерывные или прерывистые признаки, например, полиморфизм длин рестрикционных фрагментов, продуктивные признаки, признаки бактериальной адгезии, колориметрические или ферментативные реакции и резистентность к антибиотикам. Локус S контролирует экспрессию антигенов группы крови А и О. У свиней, гомозиготных по рецессивному локусу S, не экспрессируются ни антигены группы крови А, ни антигены группы крови О. Аналогичные состояния наблюдаются у людей и обусловлены мутациями в гене альфа-(1,2)-фукозилтрансферазы, который кодирует группу крови Н человека (Kelly et al., 1994; см. также WO 9628967). Недавно был секвенирован свиной ген альфа-(1,2) фукозилтрансферазы (Cohney et al., 1996). Этот ген имеет большое сходство с геном свиньи, присутствующем в локусе S.

Локусы группы крови Н и Se были генетически и физически картированы на человеческой хромосоме 19q13.3. Эта область является эволюционно консервативной и содержит гены, гомологичные генам группы сцепления с HAL у свиней. Ген, кодирующий группу крови Н, представляет собой так называемый FUT1, а ген Se является эквивалентом гену FUT2. FUT1 определяет экспрессию антигена Н в линии дифференцировки эритроидных клеток, тогда как FUT2 регулирует экспрессию антигена Н в секреторном эпителии и в слюне. Консервативность гена FUT1 была обнаружена у низших млекопитающих, таких как крысы и кролики, а экспрессия мРНК была обнаружена в ткани головного мозга кролика и в толстой кишке крысы. Было показано, что у всех этих видов имеются два типа генов альфа-(1,2)-фукозилтрансферазы, которые по своей структуре имеют очень большое сходство с генами человека FUT1 и FUT2; а в частности, гены, гомологичные гену FUT1, обнаруживают видоспецифический характер экспрессии. У человека ген FUT1 ответственен за синтез антигенов Н в клетках-предшественниках эритроцитов. Однако у свиней эритроциты пассивно адсорбируют Н-подобные антигены из сыворотки, как и в случае человеческих антигенов Lewis. У свиней, все Н-подобные антигены ассоциируются с экзокринными секреторными тканями, и экспрессия гена FUT2 (Secretor) наблюдается в секреторной ткани других видов животных. Поэтому на экспрессию детерминантов групп крови А-O свиньи, которые перекрестно реагируют с антителами против антигенов групп крови Н и А человека, может оказывать влияние ген FUT2.

В качестве дополнительной информации относительно групп крови и заболеваний свиней, ассоциированных с E.coli, можно указать, что углеводные структуры антигенов группы крови опосредуют адгезию некоторых патогенных микроорганизмов к тканям хозяина, например Helicobacter pylori связывается с антигенами группы крови Lewis^b, а E.coli, вызывающая инфекции в мочевых путях, связывается с веществом Р группы крови. Гены, кодирующие гликозилтрансферазы, ответственны за образование углеводных структур, специфичных для данной группы крови, а поэтому они являются генами-кандидатами для борьбы с бактериальным заражением хозяина. Эти гены локализованы в той же самой области хромосомы, что и локус, ответственный за адгезию/отсутствие адгезии F18-позитивной E.coli в тонком кишечнике свиней. У свиней не экспрессируются антигены групп крови А и О вплоть до времени после отъема поросят, то есть времени, когда они становятся восприимчивыми к заболеваниям, вызываемым F18 E.coli.

Для диагностики и лечения кишечных Е.coli-ассоциированных заболеваний у свиней необходимо разработать новые методы. Был предложен метод обнаружения генетической мутации, предусматривающий проведение диагностического теста на некоторые расстройства у свиней (злокачественная гипертермия) (Fujii et al., 1991; патент США 5358649), но об использовании маркеров полиморфизма для проведения диагностики не сообщалось. Были описаны вакцины для вырабатывания резистентности к заражению E.coli (патент США 5552144; WO 8604604), но маловероятно, что их использование даст предпочтительный метод предупреждения Е.coli-ассоциированных заболеваний из-за трудностей, связанных с пероральным введением живой вакцины новорожденным свиньям и из-за регуляторных ограничений. Для лечения этих болезней существуют антибиотики, но они не являются эффективной мерой для профилактики.

Краткое описание изобретения Композиции и неинвазивные способы настоящего изобретения позволяют проводить идентификацию и выбраковку свиней, которые являются восприимчивыми к заболеваниям, ассоциированным с E.coli. Неинвазивный способ идентификации свиней, которые являются резистентными к заражению кишечника F18 E.coli, включает в себя следующие стадии: определение того факта, присутствует ли в биологическом образце, взятом от свиней, генетический полиморфизм, ассоциированный с резистентностью к бактериальной колонизации; и установление того факта, что данная свинья является резистентной в том случае, если эта свинья является гомозиготной по данному полиморфизму (полиморфизм представляет собой изменение нуклеотидной последовательности, присутствующей в данной популяции вследствие мутации).

Более конкретно, этот способ позволяет определить, является ли азотистое основание в положении 307 гена альфа-(1,2)- фукозилтрансферазы свиньи в биологическом образце, взятом от свиньи, лишь аденином или лишь гуанином; и идентифицировать данную свинью как резистентную в том случае, если азотистым основанием в положении 307 является лишь аденин.

Для того чтобы определить, присутствует ли полиморфизм в биологическом образце, полиморфизм длин рестрикционных фрагментов анализируют на геле, который разделяет их по молекулярной массе. Рестрикционные эндонуклеазы представляют собой ферменты, которые репродуцируемо разрезают нуклеиновокислотные молекулы в их специфических сайтах, что приводит к образованию фрагментов нуклеиновой кислоты с различными молекулярными массами в зависимости от места разрезания.

Настоящее изобретение также относится к способу разведения свиней, резистентных к заболеваниям, ассоциированным с E.coli, путем отбора таких свиней для разведения, которые обнаруживают генетический полиморфизм по гену альфа-(1,2) фукозилтрансферазы 1, что позволяет идентифицировать их как свиней, резистентных к кишечным заболеваниям, ассоциированным с Е.coli; с последующим разведением отобранных свиней.

В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к ДНК-молекуле, которая обнаруживает полиморфизм по гену альфа-(1,2) фукозилтрансферазы 1 у свиней, а в частности по последовательности, представленной на чертеже. В других своих аспектах, настоящее изобретение относится к молекулам, имеющим нуклеотидные последовательности, комплементарные последовательностям, представленным на чертеже.

В одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к выделенной ДНК-молекуле, в которой гуанин в положении 307 заменен на аденин. В этой молекуле гуанин в положении 857 может быть также заменен на аденин. Другими выделенными ДНК-молекулами настоящего изобретения являются молекулы, имеющие мутацию в положении нуклеотида 229 последовательности, представленной на чертеже, где кодон СТТ заменен на кодон ТТТ, кодирующий вместо лейцина аминокислоту фенилаланин. Мутацией в положении нуклеотида 714 является замена GAT-->GAC, но она не приводит к замене аминокислоты в кодированном продукте.

Аспектами настоящего изобретения также являются полипептиды, кодируемые ДНК-молекулами настоящего изобретения и имеющие альфа-(1,2)фукозилтрансферазную активность.

Молекулярный анализ на обнаружение рецепторов для F18 E.coli у свиней предусматривает (а) выделение ДНК из ядросодержащих клеток свиней; (b) амплификацию ДНК посредством полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием олигонуклеотидов в качестве праймеров, которые являются комплементарными ДНК-последовательности гена альфа-(1,2) фукозилтрансферазы 1; (с) осуществление разрезания, по крайней мере, одним рестриктирующим ферментом, например Cfol; (d) разделение полученных фрагментов с помощью гель-электрофореза; (е) определение соответствующего числа и длин фрагментов на геле; и (f) определение, исходя из числа и длин фрагментов F18, какие именно рецепторы присутствуют в свиных клетках. Использование более крупных амплифицированных фрагментов, описанных в настоящей заявке, для анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ) в отличие от более мелких фрагментов является менее дорогостоящим, поскольку полосы ДНК могут быть подвергнуты электрофорезу на агарозном геле при относительно низких концентрациях. Кроме того, для продуцирования некоторых из этих фрагментов, для константного рестрикционного сайта, смежного с вариабельным диагностическим сайтом, необходимо использовать лишь один рестрикционный фермент.

В наборе для обнаружения полиморфизма, ассоциированного с рецепторами для F18 E.coli, используются олигонуклеотиды, находящиеся в отдельных контейнерах и комплементарные ДНК-последовательности гена альфа-(1,2)- фукозилтрансферазы 1 свиньи, что позволяет идентифицировать резистентных свиней от восприимчивых свиней. Этот тест может быть осуществлен на свиньях любого возраста.

Полиморфизм также может быть использован в целях разработки лекарственных средств для лечения свиней, имеющих Е.coli-ассоциированное заболевание. Мутированная форма альфа-(1,2) фукозилтрансферазы свиньи может взаимодействовать с нормальным ферментом, что предотвращает продуцирование кишечного рецептора для F18.

Краткое описание чертежей На чертеже показана нуклеотидная последовательность (FUT1) (нижняя) и предсказанная аминокислотная последовательность (верхняя) свиного полиморфизма α1-->2 фукозилтрансферазы настоящего изобретения, где для обозначения аминокислот был использован однобуквенный код. Сплошная двойная линия ниже аминокислотных последовательностей (=) указывает на предполагаемую трансмембранную область; пунктирная линия ниже аминокислотной последовательности указывает на три потенциальных сайта N-связанного гликозилирования (....).

□ указывает, где гуанин (G) заменен на аденин (A) у резистентных свиней.

* указывает на кодон терминации.

Для обозначения аминокислотных остатков используются следующие обозначения: А, Аlа; С, Cys; D, Asp; E, Glu; F, Phe; G, Gly; H, His; I, Ile; K, Lys; L, Leu; M, Met; N, Asn; P, Pro; Q, Gln; R, Arg; S, Ser; T, Thr; V, Val; W, Trp; и Y, Туr.

Описание предпочтительного варианта осуществления изобретения Молекулярный анализ на полиморфизм ДНК, ассоциированный с резистентностью свиней к Е.coly-ассоциированным заболеваниям, облегчает проведение диагностических анализов на отбор резистентных свиней для их разведения. Резистентные свиньи отличаются от восприимчивых свиней по локусу рецептора для F18 E. coli, идентифицированному с помощью маркеров полиморфизма настоящего изобретения.

Настоящее изобретение относится к неинвазивным способам и композициям для идентификации, с высоким уровнем чувствительности и специфичности, свиней, которые являются генетически восприимчивыми к заболеваниям, ассоциированным с инфекцией F18 E.coli, от свиней, которые являются резистентными к этому заболеванию. Было установлено, что ДНК-полиморфизм по гену альфа(1,2)-фукозилтрансферазы (FUT1) у свиней позволяет дифференцировать резистентных свиней от восприимчивых свиней. Полиморфизм возникает благодаря мутации (изменению) в нуклеотидной последовательности, приводящей к образованию нового аллеля. Аллель представляет собой одно из состояний гена. В популяции, где может присутствовать много аллелей гена, отличающихся заменами азотистого основания, эти аллели возникают предположительно вследствие мутаций в родительской ДНК-молекуле. Совместное присутствие в данной популяции более чем одного аллеля (именуемых "вариантами") называется генетическим полиморфизмом. Локусы, в которых может присутствовать более одного аллеля в качестве относительно стабильных компонентов популяции, являются локусами полиморфизма. Обычно один из локусов полиморфизма имеет низкую частоту встречаемости в данной популяции.

Как было определено из биологического образца (предпочтительно, из пробы крови), резистентные свиньи имеют полиморфизм в своих геномах, где в нуклеотидной последовательности в положении основания 307 (см. чертеж) обнаруживается лишь аденин, тогда как основанием в том же положении у гомозиготных восприимчивых свиней является гуанин. У гетерозиготных свиней обнаруживаются оба типа ДНК и эти свиньи являются восприимчивыми. Полиморфизм представляет собой изменение генной последовательности свиней (Cohney et al., 1996).

На семействах свиней был осуществлен анализ на сцепление генов и была определена генетическая взаимосвязь между полиморфизмом по FUT1 и резистентностью к заболеваниям у аутбредных свиней. В соответствии с настоящим изобретением был обнаружен полиморфизм в гене альфа-(1,2) фукозилтрансферазы 1 (FUT1). Полиморфизм, при котором имеется лишь одна замена в положении 307, был использован для установления тесного сцепления между геном трансферазы и S-системой, локусом ECF18R и другими локусами группы сцепления с HAL.

Обнаружение тесного сцепления мутации в FUT1 и ECF18R позволяет проводить молекулярный тест, разработанный для идентификации свиней, резистентных к адгезии F18 E.coli, гетерозиготных (носителей) и гомозиготных восприимчивых к этой адгезии свиней. Этот диагностический тест позволяет идентифицировать, с высокой степенью чувствительности и специфичности, свиней, которые являются восприимчивыми к отечной болезни и диарее после отъема. Случаи полиморфизма настоящего изобретения отличаются для разных пород свиней. Vogeli и др. (1997) получили частоты аллеля М307 у 5 пород свиней из стад, которые не были родственными друг с другом. Возможность проведения диагностического теста на полиморфизм настоящего изобретения дает животноводам прекрасную возможность эффективно выбраковывать из своих стад свиней с аллелем восприимчивости ECF18R, что позволяет тем самым предотвращать неизбежную бактериальную адгезию F18 E.coli, вызывающую отечную болезнь и диарею у поросят после отъема.

Настоящее изобретение также относится к нуклеотидным последовательностям, которые являются вариантами последовательности гена альфа-(1,2)-фукозилтрансферазы 1, представляющими различные случаи полиморфизма в п.о. 307, и к диагностическому молекулярному набору для идентификации полиморфизма по гену альфа-(1,2)-фукозилтрансферазы.

Для получения генов-кандидатов для локуса рецептора F18 E.coli (ECF18R) из геномной библиотеки свиньи, содержащей гены альфа-(1,2) фукозилтрансферазы, FUT1 и FUT2, было выделено 5 космид и один геномный клон, содержащий этот ген, (Meijerink et al., 1997). Картирование посредством флуоресцентной гибридизации in situ показало, что все эти клоны находятся в диске q11 свиной хромосомы 6 (SSC6q11). Анализ последовательностей этих космид позволил охарактеризовать (а) открытую рамку считывания (ОРС) длиной в 1098 пар оснований, которая на 82,3% идентична последовательности FUT1 человека, и (b) вторую ОРС длиной в 1023 пар оснований, которая на 85% идентична последовательности FUT2 человека. Следовательно, локусы FUT1 и FUT2 являются, очевидно, свиными эквивалентами локусов группы крови Н и локусу Secretor человека. Прямое секвенирование двух ОРС свиней либо восприимчивых, либо резистентных к адгезии и колонизации E.coli с фимбриями F18 (ECF18R) выявило два полиморфизма в паре оснований 307 (М307) и в паре оснований 857 (М857) ОРС FUT1. Положения нуклеотидов были пронумерованы от кодона ATG (кодирующего метионин). Анализ этих мутаций у 34 семейств породы Landrace, давших 221 потомство, обнаруживая тесное сцепление с локусом, контролирующим резистентность и восприимчивость к адгезии и колонизации F18 E.coli в тонком кишечнике (ECF18R), и с локусом ингибитора группы крови S. Поэтому мутация в М307 является хорошим маркером для маркерной селекции животных, являющихся резистентными к адгезии F18 E.coli. Было обнаружено, что другая мутация в положении нуклеотида 229 приводит к полиморфизму, при котором кодон, кодирующий лейцин (СTT) заменяется на кодон (TTT) (кодирующий фенилаланин). Мутация в положении 714 (GAT-->GAC) (кодирующем аспарагиновую кислоту) не приводит к замене аминокислот. В FUT2 не было идентифицировано полиморфизма, который позволяет дифференцировать восприимчивых и резистентных свиней.

Примеры Нижеследующие примеры иллюстрируют варианты осуществления настоящего изобретения.

Пример 1: Анализ для отбора резистентных свиней Полиморфизм настоящего изобретения был легко идентифицирован с помощью ПЦР-тестов на ПДРФ. В одном из вариантов осуществления этих тестов использовали 160 п.о. - фрагмент свиной альфа-(1,2) фукозилтрансферазы 1, амплифицированный посредством ПЦР с использованием следующих праймеров: 5'-ССА ACGCCTCCGATTCCTGT-3' и 5'-GTGCATGGCAGGCTGGATGA-3'. Предпочтительными ПЦР-условиями для этого варианта осуществления теста является проведение 25 циклов со следующими интервалами времени и температурами: 94^oС, 30 с; 60^oС, 45 с; 72^oС, 90 с. Амплифицированную ДНК от резистентных свиней расщепляли рестриктазой Hgal, но не расщепляли рестриктазой HinPI. Амплифицированную ДНК от гомозиготных восприимчивых свиней расщепляли рестриктазой HinPI. Амплифицированную ДНК от гетерозиготных восприимчивых свиней частично расщепляли обоими ферментами.

Альтернативно ДНК выделяли из ядросодержащих клеток свиней стандартными методами. Прямое секвенирование последовательностей FUT1 и FUT2 свиней и их фланкирующие области у животных с другим генотипом ECF18R (Вb, bb) позволило идентифицировать две транзиции G-->А в положениях 307 и 857 (обозначенных М307 и М857 соответственно) открытой рамки считывания (ОРС) FUT1. Транзиция М307 приводит к элиминации рестрикционного сайта для Cfol. Амплификацию ДНК, выделенной из ядросодержащих клеток свиньи, осуществляли стандартными методами с использованием праймеров Р6 и Р11 (таблица 1) (3 мин при 95^oС, 30 циклов: 30 с при 95^oС, 30 с при 56^oС и 30 с при 72^oС, а затем 7 минут при 72^oС для реакции конечного удлинения) с последующей Cfol-рестрикцией и разделением на 3% агарозном геле, что приводило к полиморфизму длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ). Гомозиготные М307^AA-животные дали 2 полосы. Гомозиготные М307^GG-животные дали 93-, 241- и 87 п.о.-фрагменты. Гетерозиготные животные обнаруживали все четыре фрагмента.

Пример 2: Чувствительность и специфичность анализа с использованием альфа-(1,2)-фукозилтрансферазы для обнаружения резистентности свиней к F18 Е.coli Были проведены исследования для определения связи между резистентностью к заболеванию и полиморфизмом в положении 307 гена FUT1. 183 поросят-отъемышей (в возрасте 2-6 месяцев) брали из шести различных племенных стад. Перед началом исследования было известно, что лишь в одном из этих стад имеются резистентные животные, и было известно, что в этом стаде имеется высокая частота заболеваемости синдромом стресса у свиней. В других 5 стадах синдрома стресса у свиней не наблюдалось, и случаи резистентности к этому заболеванию были неизвестны. Отбор свиней от каждого стада проводили произвольно, после чего свиней подвергали безболезненной эфтаназии и брали селезенку и образцы тонкой кишки. Из ткани селезенки экстрагировали ДНК и использовали в ПЦР-ПДРФ-анализах, описанных в Примере 1. Клетки тонкой кишки выделяли путем соскабливания слизистой оболочки с кишки, эти клетки подвергали лизису в гипотоническом растворе EDTA и промывали путем центрифугирования. Кайму щеточек очищенных клеток кишечника инкубировали с F18 E.coli. Эту смесь анализировали с помощью фазово-контрастной микроскопии. Этот анализ позволял определить, является ли данная свинья восприимчивой (образцы тонкой кишки имели прилипающие бактерии) или резистентной (образцы тонкой кишки не имели прилипающих бактерий). ПЦР-ПДРФ-анализ на полиморфизм коррелировал с анализом на связывание бактерий с клетками тонкой кишки для 53 из 53 резистентных свиней и для 128 из 130 восприимчивых свиней. Две свиньи, которые были идентифицированы как восприимчивые с использованием анализа на связывание бактерий с клетками тонкой кишки, были первоначально с помощью ПЦР-ПДРФ-анализа неправильно определены как резистентные. Было установлено, что два из этих шести стад содержали резистентных свиней, а одно стадо имело свиней с синдромом стресса, что свидетельствовало о том, что ПЦР-ПДРФ-анализ позволяет идентифицировать резистентных к заболеванию животных среди животных, которые не имеют синдром стресса у свиней.

Пример 3: Локализация FUT1 на хромосоме 6 (SSC6) Космиды ETHs1, -s2, -s3, -s4 и -s6 были идентифицированы после скрининга космидной библиотеки с использованием нуклеотидного зонда для FUT1, полученного из геномной ДНК свиньи, и с использованием праймеров Р7 и Р10, и эти космиды были картированы с помощью FISH- и DISC-ПЦР на хромосоме 6 в диске q11.

Пример 4: Идентификация ОРС FUT1 свиньи Гибридизация KspI-, EcoRI- и KspI/EcoRI-гидролизатов космид с радиоактивно меченными праймерами Р6-Р11 и Р7-Р10 для FUT1-фрагментов свиньи при Саузерн-блот-анализе выявила идентичные авторадиографические сигналы для ETHs2, -s4 и -s6, тогда как от космид ETHs1 и -s3 были получены другие сигналы. Из космиды ETHs2 с помощью KspI были выделены субклоны длиной 940 п.о. и 6,2 т. п. о., соответствующие исследуемой длине гибридизирующихся KspI-фрагментов на Саузерн-блоте. Последовательности, полученные от двух субклонов, были объединены, в результате чего были получены последовательности длиной в 1501 п.о., что соответствовало результатам прямого секвенирования геномных ПЦР-продуктов. Эта последовательность в 1501 п.о. содержит открытую рамку считывания (ОРС) длиной в 1098 п.о., соответствующую ОРС FUT1 человека, с идентичностью нуклеотидов 82,3% и идентичностью аминокислот 80,8%. Эта ОРС кодирует полипептид.

Пример 5: Идентификация FUT2 и псевдогена FUTP свиньи
ETHs1 имеет один ДНК-фрагмент (2,7 т.п.о.), который гибридизуется с последовательностями FUT1, а ЕТНs3 имеет два фрагмента (2,7 т.п.о. и 8,2 т.п. о. ). Субклонирование и неполное секвенирование 2,7 т.п.о.-EcoRI-фрагмента ETHs1 и -s3 подтвердило, что эти два фрагмента являются идентичными. Эта последовательность имеет высокую степень сходства с человеческим FUT2, но обнаруживает несколько модификаций в NH₂- и -СООН-концевых областях. Эти модификации приводят к сдвигам рамки считывания, которые не совпадают с консервативной ОРС, а поэтому можно предположить, что эта последовательность, полученная из 2,7 т. п.о.-фрагмента, представляет собой псевдоген (FUT2P). После субклонирования ВаmHI-гидролизатов ЕТНs3 были идентифицированы гибридизирующиеся последовательности, содержащиеся в 8,2 т.п.о.-EcoRI-фрагменте. Последовательность полученных субклонов представляет собой ОРС длиной 1023 п.о. и по своей нуклеотидной последовательности является на 85% идентичной, а по своей аминокислотной последовательности на 83% идентичной последовательности FUT2 человека. В NH₂- и -СООН-концевых областях, между последовательностью свиного FUT2 и последовательностью FUT2P, происходящего от 2,7 т.п.о.-фрагмента, наблюдалось много отличий. Предсказанная аминокислотная последовательность соответствует частично определенной аминокислотной последовательности свиного фермента Secretor (Thurin & Blaszczyk-Thurin, 1995). Полученные последовательности свиных FUT1, FUT2 и FUTP были помещены в Банк генов (Genbank) и имеют номера доступа U70883, U70881 и U70882 соответственно. Гены FUT1 и FUT2 имеют в высокой степени гомологичные последовательности. Это было принято во внимание при разработке праймеров. Кроме того, в последующих исследованиях необходимо дифференцировать активность ферментов FUT1 и FUT2.

Пример 6: Идентификация мутаций М307 и М857 и характеризация М307
ДНК выделяли из ядросодержащих клеток свиней стандартными методами. Прямое секвенирование последовательностей свиных FUT1 и FUT2 и их фланкирующих областей у животных с различными генотипами ECF18R (Вb, bb) позволило идентифицировать две транзиции G-->А в положениях 307 и 857 (обозначенных М307 и М857 соответственно) открытой рамки считывания (ОРС) FUT1. Транзиция М307 приводит к элиминации рестрикционного сайта для фермента Cfol. Амплификацию ДНК, выделенной из ядросодержащих клеток свиньи, осуществляли стандартными методами с использованием праймеров Р6 и Р11 (3 мин при 95^oС, 30 циклов: 30 с при 95^oС, 30 с при 56^oС и 30 с при 72^oС, а затем 7 минут при 72^oС для реакции конечного удлинения) с последующей Cfol-рестрикцией и разделением на 3% агарозном геле, что приводило к полиморфизму длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ). Гомозиготные М307^AA-животные дали 2 полосы (93- и 328 п.о.-фрагменты). Гомозиготные M307^GG-живoтныe дали 87-, 93-, 241 п.о.-фрагменты. Гетерозиготные животные обнаруживали все четыре фрагмента.

Пример 7: Характеризация мутации М857
Мутация М857 представляет собой транзицию, которая приводит к элиминации сайта для рестриктазы AciI. Для введения двух дополнительных AciI-сайтов в положения 866 и 872 был сконструирован праймер PBEST. ПЦР с использованием праймеров Р7 и PBEST (3 мин при 95^oС, 30 циклов: 30 с при 95^oС, 30 с при 56^oС и 30 с при 72^oС, а затем 7 минут при 72^oС для реакции конечного удлинения) с последующей AciI-рестрикцией позволила проводить ПЦР-ПДРФ-анализ на 3% агарозном геле. Гомозиготные М307^AA-животные дали 174 п.о. -фрагмент, а продукты амплификации М307^GG-животных дали 136- и 38-п.о.-фрагменты.

Пример 8: Генетическое картирование гена FUT1
В семействах свиней Landrace события рекомбинации между М307 и локусом группы сцепления с HAL (S, ECF18R, RYR1, GPI, PGD) позволили выявить рекомбинационные фракции Θ<0,04 (Таблица 2). Количественный показатель сцепления генов Z для всех рекомбинационных фракций составлял 24,6- 50,6, что явно свидетельствовало о сцеплении между этими локусами. Эти данные позволяют проводить генетическое картирование гена FUT1 на группу сцепления с HAL в непосредственной близости от S и ECF18R, на оба из которых оказывает влияние FUT1. У экспериментальных свиней семейства Landrace, была обнаружена аллельная ассоциация между ECF18R и RYR1. Избыток генотипов RYR1^TT в положении 1843 в RYR1 (галотанвосприимчивый генотип) наблюдался у свиней, резистентных к отечной болезни и диарее после отъема (генотип ECF18R^b/b) (Таблица 3). Эта ассоциация аллелей является результатом неравновесности по сцеплению, то есть отклонения наблюдаемых частот встречаемости данного гаплотипа от ожидаемых частот встречаемости этого гаплотипа при независимом наборе аллелей. Поэтому неравновестность по сцеплению означает неслучайную ассоциацию аллелей, принадлежащих к сцепленному локусу. Однако из-за низкой частоты рекомбинации, порядок локуса не мог быть определен, поскольку он является значительно выше, чем другие.

Пример 9: Ассоциация M307^A с ECF18^b и М307^G с ECF18R^B
У свиней-родителей семейства Landrace (SL) и свиней породы Large White (LW), аллель ECF18R^b (аллель резистентности к отечной болезни и диарее после отъема) на 100% ассоциирован с М307^A, а аллель ECF18R^B (аллель восприимчивости к отечной болезни и диарее после отъема) на 100% ассоциирован с М307^G (где А = аденин; G = гуанин). У свиней породы SL, 88% свиней (30/34) имеет S^S в расчете на все гаплотипы ECF18R^b и М307^G соответственно. У свиней Large White, соответствующие значения для обоих гаплотипов S^S-ECF18R^b и S^S-M307^A составляли 82% (9/11). У экспериментальных семейств SL, встречаемость аллеля М307^A в локусе FUT1 была низкой, а у свиней LW этот аллель даже отсутствовал. Поэтому для аллелей М857 и аллелей фланкирующих генов, значительной гаметной ассоциации не наблюдалось. Транзиции G-->А в положениях 307 FUT1 и 857 FUT1 с различной степенью частоты были также обнаружены у свиней Duroc, Hampshire и Pietrain, что позволяет предположить, что эти транзиции встречаются также у свиней других пород.

Пример 10: Распределение генотипов FUT1
Как видно из Таблицы 4, распределение генотипов FUT1 в нуклеотидном положении 307 для типов ECF18R значительно отличается от ожидаемого отношения, если предположить, что оба они являются независимыми. В тесте с использованием ДНК было установлено, что из 119 ЕСЕ18R^b/b-животных, резистентных к отечному заболеванию и диарее после отъема, 118 имели генотип М307^AA. Одно резистентное животное имело генотип М307^A/G. Из 131 восприимчивых свиней, 130 имели генотип М307^A/G или М307^G/G. Одно животное, восприимчивое к адгезии Е. coli, было гомозиготным M307^A/A-живoтным, на что указывал ДНК-тест. Данные этого примера и примера 2 вместе с предыдущими исследованиями дают основание предположить, что ген FUT1 представляет собой ген, присутствующий в локусе S свиньи и в локусе ECF18.

Хотя данные, полученные от 4 животных этого примера и примера 2, противоречат этому предположению, однако, вероятно, что эти животные были неправильно фенотипированы с точки зрения их резистентности/восприимчивости к заболеваниям.

Пример 11: Аминокислотные замены в альфа-(1,2) фукозилтрансферазе
Замены G --> в п. о. +307 и в п.о. +857 гена 1 альфа-(1,2) фукозилтрансферазы приводили к предсказанным аминокислотным заменам аланина (нейтральная-неполярная) на треонин (нейтральная-полярная) и аргинина (основная) на глутамин (нейтральная-полярная) соответственно, которые могут иметь функциональные последствия в кодированном продукте. Замена С-->Т в п. о.229 приводит к аминокислотной замене фенилаланина (нейтральная-неполярная) на лейцин (нейтральная-неполярная).

Методы:
1. Праймеры
Праймеры, происходящие от гена FUT1 человека, были использованы для амплификации его свиного аналога из геномной ДНК. Исходя из полученных свиных последовательностей были сконструированы специфические праймеры, которые были использованы для последующих реакций амплификации и секвенирования (Таблица 1).

2. Скрининг геномной свиной библиотеки
Свиные геномные библиотеки были скринированы либо с использованием зонда для свиного FUT1, полученного с использованием праймеров Р7 и р10, либо с использованием кДНК свиного FUT1. Свиную геномную библиотеку, сконструированную в SuperCos 1 (Stratagene, La Jolla, Ca, USA), скринировали с использованием α³²-dАТР-меченого (Prime It II, Stratagene) зонда FUT1, полученного из геномной ДНК свиньи с использованием праймеров Р7 и Р10. После гибридизации фильтров-реплик при 42^oС в течение 15 часов (50% формамид, 6хSSC, 5 х раствор Денхардта, 0,5% ДСН, 0,1 мг/мл спермы лосося) и двухкратной промывки при 65^oС в течение 30 минут (1хSSC, 0,1% ДСН), позитивные колонии были идентифицированы после экспонирования (15 ч, -80^oС) с рентгеновской пленкой.

3. In situ-гибридизация свиных метафазных хромосом
Космидные клоны ETHs1, ETHs2, ETHs3, ETHs4 и ETHs6 были подвергнуты флуоресцентной in situ-гибридизации (FISH) (Solinas Toldo et al., 1993) или прямой РСТ in situ (DISC ПЦР) на свиных метафазных хромосомах. Перед гибридизацией метафазные хромосомы были подвергнуты Q-бэндингу и сфотографированы. Зонды были помечены путем рандомизированного праймирования с использованием биотин-16-dUTP. Детекцию сигнала и амплификацию проводили с использованием авидин-ФИТЦ (флуоресцеин-изотиоцианат) и биотинилированного антитела против авидина. Хромосомы подвергали контрастному окрашиванию 4,6-диамидино-2-фениллиндолом, и относительные положения космид были определены как описано Solinas Toldo, 1993.

4. Субклонирование
Продукты ферментативной рестрикции зонд-позитивных геномных колоний выделяли на агарозном геле, переносили на найлоновые мембраны, и зонд-позитивные полосы субклонировали в плазмиды для секвенирования FUT1. Последовательность FUT1, полученная этим методом, показана на чертеже.

KspI-, EcoRI- и KspI/EcoRI-гидролизаты всех космид выделяли на 0,8% агарозном геле и переносили на найлоновую мембрану Hybond-N (Meijerink et al., 1997). Этот блот гибридизовали с α³²Р-dАТР-мечеными PCR-продуктами FUT1 (праймеры Р6-Р11 и Р7-Р10). Исходя из авторадиографических сигналов, ETHsl, -s2 и -s3 подвергали последующему субклонированию в pBluescript SK-(Stratagene), и по этим субклонам были определены последовательности FUT. Последовательности двух FUT-подобных открытых рамок считывания (ОРС) (FUT1 и FUT2), полученные из космид ETHs1, -s2 и -s3, сравнивали для ЕСF18R-позитивных (ВВ/Вb) и ECF18R-негативных животных (bb) путем прямого секвенирования ПЦР-продуктов.

5. Полимеразная цепная реакция и прямое секвенирование
С использованием набора для краситель-дидезокситерминации цепи (Реrkin Elmer Ready Reaction Dye Terminator kit) (Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT, USA) и 10 пмоль праймера осуществляли цикл секвенирования в температурных условиях, которые предусматривали первоначальную денатурацию в течение 5 мин при 95^oC с последующим проведением 25 циклов в течение 30 с при 95^oС, 15 с при 50^oС и 4 мин при 60^oС. Праймеры, используемые для амплификации и секвенирования генов альфа-(1,2)-фукозилтрансферазы свиньи перечислены в Таблице 1. Принимая во внимание высокую степень сходства FUT1, FUT2 и псевдогена FUT2 были сконструированы дополнительные праймеры благодаря возможности перекрестного отжига. Образцы анализировали на секвенаторе ABI 373A (Applied Biosystems Inc. ), а анализ последовательности проводили с помощью GCG-упаковки (Devereux, 1984).

6. Получение данных о потомстве
Полиморфизм по одному нуклеотиду анализировали для 221 свиней Landrance, полученных от 4 хряков и 16 свиноматок, и для 29 свиней Large White, полученных от 9 спариваний между неродственными свиньями. В целях получения большого числа данных о потомстве для оценки сцепления между свиными генами, кодирующими рецепторы ECF18, и отобранными полиморфными локусами были получены данные лишь о спаривании свиней Landrance типа B/b х b/b.

7. Тест на колонизацию
В исследованиях, проведенных Bertschinger et al., 1993, вышеупомянутые свиньи Landrance были также протестированы на восприимчивость к ECF18 в тесте на колонизацию. Для этих целей свиней сразу после отъема инокулировали бактерией штамма Е.coli 124/76 серотипа O139:K12(B):H1:F18 (Rippinger et al. , 1995). Ежедневно проводили анализ экскрементов на присутствие бактерий. Степень колонизации вычисляли как среднюю величину из двух наиболее высоких значений анализа экскрементов. Было установлено, что свиньи со средним значением 3,5, полученным из анализа экскрементов и соответствующим 6,7 log колониеобразующих единиц (к. о. е.)/г или более, являлись восприимчивыми к колонизации. Этот предел был установлен, исходя из отсутствия смертности свиней, имеющих показатели ниже этого значения, и исходя из оценок, полученных от пометов с полной резистентностью.

8. Анализ на связь с нуклеотидным полиморфизмом
Результаты, относящиеся к полиморфизму по одному нуклеотиду, сравнивали с данными типирования для ECF18R, которые были идентифицированы в in vitro-анализе на адгезию, описанном Vodeli et al. (1996), и с данными типирования для GPI-, PGD-, α-1-В-гликопротеин-(АIВG), рианодинового рецептора (RYRI), ЕАН- и S-локусов, опубликованными в работе Vogeli et al., (1996). Анализ на попарное сцепление и определение рекомбинантных фракций осуществляли с использованием программы CRI-MAP, версии 2.4 (Green et al., 1990). Многокомпонентный анализ на сцепление осуществляли путем проведения последовательного встраивания в карту вышеуказанных локусов. Частоты гаплотипов вычисляли исходя из данных, полученных от животных-родителей семейств Landrance, и от 8 животных-родителей Large White, которые были подвергнуты типированию на гаплотип ECF18R на основе данных о потомстве. Тетрахорические корреляции ECF18R и мутации в FUT1 (FUT1/M307) (полиморфизм) вычисляли для всего потомства Landrance и Large White.

9. Саузерн-блот-анализ
Саузерн-блот-анализ осуществляли с использованием космид ETHs1 (1-3), ETHs2 (4-6) и ЕТНs3 (7-9) после их расщепления ферментами KspI (1, 4, 7), EcoRI (2, 5, 8) и KspI/EcoRI (3, 6, 9) и разделения на 0,8% агарозе. Гибридизация с α³²-Рd-АТР-меченым 5' FUT1-фрагментом (праймеры Р6-Р11) приводила к аналогичной гибридизации 940 п. о.-полосы как в KspI-гидролизате (дорожка 4), так и в KpsI/EcoRI-гидролизате (дорожка 6). Однако гибридизация с 3'FUT1-фрагментом (праймеры Р7-Р10) (Таблица 1) показала на присутствие 6,2 т.п.о. -KspI-полосы на дорожке 4 и 1,1 т.п.о. -KspI/EcoRI-полосы на дорожке 6. Оба 5'- и 3'-FUT1-фрагмента гибридизовались с тем же 4,6 т.п.о.-EcoRI-фрагментом на дорожке 5. Это указывает на присутствие KspI-сайта в гене FUT1, присутствующем в космиде ETHs2. Перекрестная гибридизация 3'FUT1-фрагмента обнаруживает 2,7 т. п. о. -(дорожки 2, 3, 8 и 9) и 8,2 т.п.о.-(дорожки 8 и 9)-полосы, что в конечном счете указывает на идентичность псевдогена FUT2 (неполная ОРС) и генных последовательностей FUT2 соответственно.

10. Полиморфизм рестрикционных фрагментов
Детекция (А) М307 G-->А-мутации и (В) М857 G-->А-мутации в гене FUT1 свиньи была достигнута путем проведения анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов с использованием различных рестриктирующих ферментов. Гидролиз амплифицированных FUT1-фрагментов ферментами Cfol (А) и AciI (В) приводит к полиморфизму рестрикционных фрагментов. На первой дорожке представлен 100 п.о.-маркер. Длины фрагментов указаны в парах оснований. (А) Генотип М307^A/A (дорожка 2) генерирует рестрикционные фрагменты длиной 328 и 93 п. о. , генотип М307^G/G (дорожка 4) генерирует рестрикционные фрагменты длиной 93, 241 и 87 п.о., а гетерозиготные генотипы М307^A/G (дорожка 3) дают все четыре фрагмента.

(В) Гидролиз генотипа М857^A/A (дорожка 2) приводит к генерированию фрагмента длиной 174 п.о.; гидролиз генотипа М857^G/G (дорожка 4) приводит к генерированию фрагментов длиной 136 и 38 п.о.; а гидролиз генотипов М307^A/G (дорожка 3) дает все четыре фрагмента.

11. Источник свиней
Данные о экспериментальной породе свиней Swiss Landrace были получены из двух родословных, которые были выведены в Институте ветеренарной бактериологии, Цюрихский университет. Свиньи всех других пород Large White, Swiss Landrace, Duroc, Hampshire и Pietrain были получены из различных племенных стад Швейцарии. Другие свиньи были произвольно получены от ферм на Среднем западе США.

Цитированные документы:
Bertschinger et al. (1993) Veterinary Microbiology 35: 79-89.

Cottermann (1947) Contrib. Lab. Verlebr. Biol. Univ. Mich. 33: 1-21.

Cohney et al. (1996) Immunogenetics 44: 76-79.

Devereuxe et al., (1984) Nucleic Acids Res. 1: 387-395.

Fujii et al. (1991) Science 253: 448-451.

Green el al. (1990) Documentation for CRI-MAP, Version 2.4, St. Louis: Washington University School of Medicine.

Kelly et al. (1994), Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 91: 5843-5847.

Meijerink, et al. (1997) Mamm. Genome 8: 736-741.

Rippinger (1995) Vet. Microbial. 45: 281-295.

Solinas Toldo et al. (1993) Mamm. Genome 4: 720-727.

Thurin and Blaszczyk-Thurin (1995) J. Biol. Chem. 270 (44): 26577-26580.

Vögeli et al. (1996) Animal Genetics 27:321-328
Vögeli et al. (1997) Schweiz. Arch. Tierheilk. 139: 479-484.

U.S. Pat. No. 5358649, Maclennon el al.

U.S. Pat. No. 5552144, Valery et al.

WO 8604604 987P, Inventor: Peterson.

WO 9628967, Inventor: Koike, C.

WO 9413811, Inventors: Imberechts and Lintermans.

TW 266264, Inventors: Jeng and Liou.

Формула изобретения

1. Способ идентификации свиней, резистентных к кишечным заболеваниям, ассоциированным с E. coli, где E. coli является штамм F18, включающий: а. определение факта, является ли азотистым основанием в положении 307 гена альфа-(1,2)-фукозилтрансферазы 1 в биологическом образце, взятом у свиньи, лишь аденин; и b. идентификацию свиней как резистентных, если в положении 307 азотистым основанием является лишь аденин.

2. Способ разведения свиней, резистентных к заболеваниям, ассоциированным с E. coli, включающий: а. отбор для разведения таких свиней, которые обнаруживают генетический полиморфизм по гену альфа-(1,2)-фукозилтрансферазы 1, что позволяет идентифицировать их как свиней, резистентных к кишечным заболеваниям, ассоциированным с E. coli; и b. разведение отобранных свиней.

3. Способ по п. 2, где E. coli является штамм F18.

4. Выделенная ДНК-молекула, которая является полиморфной по свиному гену альфа-(1,2)-фукозилтрансферазы 1, когда находится в позиции 307 и имеет нуклеотидную последовательность, представленную на фиг. 1.

5. Выделенная ДНК-молекула по п. 4, где в положении 307 вместо гуанина присутствует аденин.

6. Выделенная ДНК-молекула, которая является комплементарной нуклеотидной последовательности по фиг. 1.

7. Выделенная ДНК-молекула по п. 6 с заменой аденина на гуанин в нуклеотидной позиции 857.

8. Выделенная ДНК-молекула по п. 6 с тимином в нуклеотидной позиции 229.

9. Молекулярный анализ для обнаружения рецепторов E. coli F18 у свиней, включающий выделение ДНК из ядросодержащих клеток свиньи; амплификацию упомянутой ДНК посредством полимеразной цепной реакции, использующей олигонуклеотиды в качестве праймеров, которые являются комплиментарными ДНК-последовательности свиного гена альфа-(1,2)-фукозилтрансферазы 1; осуществление рестрикции, по меньшей мере, с одним рестриктирующим ферментом; разделение полученных фрагментов с помощью гель-электрофореза; определение соответствующих чисел и длин фрагментов на геле; и определение, исходя из чисел и длин фрагментов F18, какие рецепторы присутствуют.

10. Молекулярный анализ по п. 9, где рестриктирующим ферментом является Cfol.

11. Набор для обнаружения рецепторов E. coli F18, включающий олигонуклеотиды, которые находятся в отдельных контейнерах, при этом упомянутые олигонуклеотиды являются комплиментарными ДНК-последовательности полиморфизмов по гену I альфа-(1,2)-фукозилтрансферазы свиньи.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4