Способ получения анатоксина bordetella pertussis

 

Изобретение относится к области медицины, а именно к медицинской микробиологии, и может быть использовано для производства бесклеточной коклюшной вакцины. Сущность изобретения состоит в том, что в жидкой питательной среде культивируют коклюшные бактерии, отделяют супернатант, выделяют из него токсический материал, детоксикацию супернатанта осуществляют путем последовательного добавления сахарозы до концентрации 3-5% и формалина до концентрации 0,4% с последующим выдерживанием смеси при 36°С в течение 3 суток. Частично обезвреженный токсический материал выделяют из супернатанта в присутствии 1% раствора гексаметафосфата натрия и 2н. трихлоруксусной кислоты при рН 3,4-3,5. Полученный осадок отделяют центрифугированием при 12500 об/мин в течение 60 минут и растворяют в 0,07 М фосфатном буфере рН 7,5. В полученный препарат добавляют сахарозу до концентрации 10% и формалин до концентрации 0,15-0,2%. Окончательно его детоксицируют при 36°С в течение 15 суток. Техническим результатом является разработка способа получения высокоактивного и низкотоксичного анатоксина Bordetella pertussis, который может быть использован для получения бесклеточной коклюшной вакцины. 1 з.п.ф-лы.

Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано для производства бесклеточной коклюшной вакцины.

Известен способ получения анатоксина Bordetella pertussis путем культивирования коклюшных бактерий в жидкой питательной среде, отделения супернатанта, выделения из него токсина с последующей детоксикацией формалином и сорбцией анатоксина на гидроокиси алюминия, токсин из супернатанта выделяют осаждением 3-7%-ным раствором гексаметафосфата натрия в присутствии 0,002-0,006 М растворов соляной, серной и трихлоруксусной кислот при рН 3,4-3,6, а детоксикацию токсина проводят в 8-12%-ном растворе сахарозы (RU 1369042, А 61 К 39/10, 1986 г.).

Проблема получения высокоэффективных низкотоксичных вакцин для профилактики коклюшной инфекции остается актуальной, поскольку применяемая в практике корпускулярная вакцина обладает высокой реактогенностью, а бесклеточные коклюшные вакцины характеризуются выраженной протективной активностью и более низкой токсичностью.

Повышение протективной активности бесклеточной коклюшной вакцины - одно из важных условий совершенствования этих препаратов.

Технический результат заявленного способа заключается в получении высокоактивного и низкотоксичного анатоксина Bordetella pertussis.

Для достижения указанного технического результата в способе получения анатоксина Bordetella pertussis путем культивирования коклюшных бактерий в жидкой питательной среде, отделения супернатанта, выделения из него токсического материала, детоксикации токсического материала формалином и сорбцией анатоксина на геле гидроокиси алюминия, согласно изобретению детоксикацию супернатанта осуществляют путем последовательного добавления сахарозы до концентрации 3-5% и формалина до концентрации 0,4% с последующим выдерживанием смеси при 36°С в течение 3 суток, частично обезвреженный токсический материал выделяют из супернатанта в присутствии 1% раствора гексаметафосфата натрия и 2н. трихлоруксусной кислоты при рН 3,4-3,5, полученный осадок отделяют центрифугированием и растворяют в 0,07 М фосфатном буфере рН 7,5, в полученный препарат добавляют сахарозу до концентрации 10% и формалин до концентрации 0,15-0,2% и окончательно его детоксицируют при 36°С в течение 15 суток.

Кроме того, центрифугирование осуществляют при 12500 об/мин в течение 60 минут.

Сущность изобретения поясняется на следующих примерах выполнения способа.

Пример 1. Штамм 475а Bordetella pertussis 1 фазы со среды Борде-Жангу (2-й пассаж) инокулируют до концентрации 3,0-3,5 МОЕ в 1 мл в матрацы, содержащие 150-200 мл жидкой питательной среды и культивируют при 35,5°С в течение 5 суток. Супернатант отделяют от микробных клеток центрифугированием при 12500 об/мин в течение 60 минут.

К 1 л супернатанта добавляют последовательно сахарозу до концентрации 3% и формалин до концентрации 0,4%. Смесь выдерживают в термостате при 36°С в течение 3 суток. Затем к 1 л смеси приливают последовательно 50 мл 20% раствора гексаметафосфата натрия и рН смеси доводят до 3,4 2н. трихлоруксусной кислотой (ТХУ). Осадок отделяют центрифугированием при 12500 об/мин в течение 60 минут и растворяют в 20 мл 0,07 М фосфатного буфера рН 7,5. К полученному препарату добавляют сахарозу до концентрации 10% и формалин до концентрации 0,15%. Препарат окончательно детоксицируют при 36°С в течение 15 суток. Полученный анатоксин сорбируют на геле гидроокиси алюминия в концентрации 8 мкг белкового азота на 1 мг геля в 1 мл.

Пример 2. Штамм 475а Bordetella pertussis 1 фазы со среды Борде-Жангу (2-й пассаж) инокулируют до концентрации 3,0-3,5 МОЕ в 1 мл в матрацы, содержащие 150-200 мл жидкой питательной среды и культивируют при 35,5°С в течение 5 суток. Супернатант отделяют от микробных клеток центрифугированием при 12500 об/мин в течение 60 минут.

К 1 л супернатанта добавляют последовательно сахарозу до концентрации 5% и формалин до концентрации 0,4%. Смесь выдерживают в термостате при 36°С в течение 3 суток. Затем к 1 л смеси приливают последовательно 50 мл 20% раствора гексаметафосфата натрия и рН смеси доводят до 3,5 2н. ТХУ. Осадок отделяют центрифугированием при 12500 об/мин в течение 60 минут и растворяют в 20 мл 0,07 М фосфатного буфера рН 7,5.

К полученному препарату добавляют сахарозу до концентрации 10% и формалин до концентрации 0,2%. Препарат окончательно детоксицируют при 36°С в течение 15 суток. Полученный анатоксин сорбируют на геле гидроокиси алюминия в концентрации 8 мкг белкового азота на 1 мг геля в 1 мл.

При сравнительном изучении протективной активности анатоксинов, полученных предлагаемым и известным способами, было показано, что препараты, полученные предлагаемым способом, были значительно активнее препаратов, полученных известным способом, и содержали 23,3±0,3 международных защитных единиц (МЗЕ) в 1 мл, в то время как препараты, полученные известным способом, содержали 16,0±1,62 МЗЕ/мл. Различия были статистически достоверны при р=0,01.

По требованию Всемирной организации здравоохранения одна иммунизирующая доза для человека должна содержать 4 МЗЕ.

Для препаратов, полученных предлагаемым способом, она составляла 1,3 мкг белкового азота, а для препаратов, полученных известным способом, - 2 мкг белкового азота.

Изучение токсических свойств препаратов, полученных предлагаемым и известным способами, показало, что гистаминсенсибилизирующая активность ГСД50 (доза, сенсибилизирующая 50% мышей к гистамину) для заявленного способа составляла 17,5 мкг белкового азота, что в 13,46 раза превышало иммунизирующую дозу для человека. Для известно способа ГСД50 составляла 18,7 мкг белкового азота, что в 9,35 раза превышало иммунизирующую дозу для человека.

Полученные данные свидетельствовали о более низкой токсичности препаратов, полученных заявленным способом, в сравнении с препаратами, полученными известным способом.

Преимущество изобретения заключается в том, что разработан способ получения высокоактивного и низкотоксичного анатоксина Bordetella pertussis, который может быть использован для получения бесклеточной коклюшной вакцины.

Формула изобретения

1. Способ получения анатоксина Bordetella pertussis путем культивирования коклюшных бактерий в жидкой питательной среде, отделения супернатанта, выделения из него токсического материала, детоксикации токсического материала формалином и сорбцией анатоксина на геле гидроокиси алюминия, отличающийся тем, что детоксикацию супернатанта осуществляют путем последовательного добавления сахарозы до концентрации 3-5% и формалина до концентрации 0,4% с последующим выдерживанием смеси в термостате при 36°С в течение 3 суток, частично обезвреженный токсический материал выделяют из супернатанта в присутствии 1%-ного раствора гексаметафосфата натрия и 2 н трихлоруксусной кислоты при рН 3,4-3,5, полученный осадок отделяют центрифугированием и растворяют в 0,07 М фосфатном буфере рН 7,5, в полученный препарат добавляют сахарозу до концентрации 10% и формалин до концентрации 0,15-0,2% и окончательно его детоксицируют при 36°С в течение 15 суток.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что центрифугирование осуществляют при 12500 об/мин в течение 60 мин.