Способ обнаружения свечения тромбоцитов

 

Изобретение относится к области медицины, в частности к гемостазиологии. Способ обеспечивает увеличение времени интенсивности спонтанного свечения тромбоцитов. Получают обогащенную тромбоцитами плазму крови, добавляют в нее вещества, повышающие уровень свечения, помещают эту смесь в прибор для последующей регистрации свечения, при этом полученную обогащенную тромбоцитами плазму разводят бедной тромбоцитами плазмой до концентрации тромбоцитов 300000-350000 кл/мкл, а в качестве вещества, повышающего уровень свечения, используют люминол конечной концентрации 10^-6 моль.

Изобретение относится к медицине, а также биохимии, а именно к гемостазиологии, и может быть использовано для диагностики нарушений функций тромбоцитов.

Известен способ выявления свечения тромбоцитов, включающий получение обогащенной тромбоцитами плазмы (ОТП) с добавлением тромбина, помещение ее в кювету хемилюминомера и регистрацию свечения (А.Б. Самаль, С.Н. Черенкевич и др. Агрегация тромбоцитов: методы изучения и механизмы. Гл.3.8 Хемилюминисценция тромбоцитов при индуцированной тромбином агрегации. - Минск: Университетское, 1990 г., с. 87.

Недостатком известного технического решения является то, что воздействие на плазму тромбином вызывает усиленное склеивание (агрегацию) тромбоцитов, что резко повышает их активность и вызывает кратковременное свечение, а это влияет на функцию тромбоцитов, искажая картину их фактического состояния, что не позволяет получать достоверную информацию об исходном функциональном состоянии тромбоцитов.

Наиболее близким по технической сущности к заявляемому способу и выбранному в качестве прототипа является способ обнаружения хемилюминисценции тромбоцитов, включающий получение обогащенной тромбоцитами плазмы крови, добавление в нее вещества, повышающего уровень свечения, помещение этой смеси в прибор с последующей регистрации выявленного свечения, а в качестве вещества повышающего уровень свечения используют двухвалентное железо (А.Б. Самаль, С.Н. Черенкович и др. Агрегации тромбоцитов: методы изучения и механизмы. Гл.3.8 Хемилюминисценция тромбоцитов. - Минск: Университетское, 1990 г., с. 88, рис. 51).

Недостатком известного технического решения является то, что воздействие на плазму двухвалентного железа вызывает такое кратковременное свечение тромбоцитов, что получить достоверную информацию об исходном функциональном состоянии тромбоцитов практически не представляется.

Задачей настоящего изобретения является получение достоверной информации функциональном состоянии тромбоцитов.

Техническим результатом является увеличение времени и интенсивности спонтанного свечения тромбоцитов.

Указанная задача достигается за счет того, что в известном способе обнаружения свечения тромбоцитов, включающем получение обогащенной тромбоцитами плазмы крови, добавление в нее вещества, повышающего уровень свечения, помещение этой смеси в прибор для последующей регистрации свечения, согласно изобретению полученную обогащенную тромбоцитами плазму разводят бедной тромбоцитами плазмой до концентрации тромбоцитов 300000-350000 кл/мкл, а в качестве вещества, повышающего свечения, используют люминол конечной концентрации 10^-6 моль.

Предлагаемый способ представляет собой совокупность приемов, позволяющих получать достоверную информацию о функциональном состоянии тромбоцитов в крови, что позволяет судить о наличии или отсутствии патологии клеточного звена у человека.

Проведенные исследования по патентным и научно-техническим источникам информации показали, что предлагаемый способ неизвестен н не следует явным образом из изученного уровня техники т.е. соответствует критериям “новизна” и “изобретательский уровень”.

Предлагаемый способ может быть применен в любой биохимической лаборатории медицинского учреждения, снабженного типовым оборудованием, выпускаемым отечественной или зарубежной промышленностью.

Таким образом, заявляемый способ является доступным, а следовательно, практически применимым.

Разведение обогащенной тромбоцитами плазмы бедной тромбоцитами плазмой до концентрации тромбоцитов 300000-350000 кл/мкл обеспечивает оптимальное спонтанное свечение тромбоцитов, определенное экспериментально.

При концентрации менее 300000 кл/мкл происходит малый выход свободных радикалов, в результате чего регистрируется слабое свечение.

При концентрации более 350000 кл/мкл большое количество тромбоцитов начинает взаимодействие друг с другом и образование свободных радикалов снижается, в результате чего уменьшается свечение.

Добавление люминола заявленной концентрации повышает чувствительность способа, он окисляется со свободными радикалами, образуемыми тромбоцитами, в результате чего повышает интенсивность их свечения.

Таким образом, обеспечивается спонтанное интенсивное и достаточно длительное свечение тромбоцитов, что позволяет достоверно судить о их функциональном состоянии.

Заявляемый способ осуществляют с помощью хемилюминомера ХЛ-003, регистрирующего устройства, например монитора компьютера и химического стакана объемом 50 мл.

Заявляемый способ осуществляют следующим образом.

Обогащенную тромбоцитами плазму (OTП), разведенную бедной тромбоцитами плазмой (БТП) в концентрации, например, 320000 кл/мкл в количестве 1 мл помещают в химический стакан и устанавливают в кюветную камеру хемилюминомера, который регистрирует спонтанное свечение тромбоцитов в течение 10 минут. Светосумма свечения выражается в условных единицах относительно к эталонному источнику излучения ЖС-19 содержащего соли урана и равна 1,231+1,18 усл.ед.

После этого в этот раствор добавляют рабочий раствор люминола с конечной концентрацией 10^-6 моль и снова регистрируют свечение полученного раствора, которое равно 7,71+1,18 усл.ед., что означает увеличение свечения в 6,26 раза.

При таком уровне свечения тромбоцитов можно достоверно судить о функциональном состоянии тромбоцитов.

По интенсивности способности свечения судят о функциональном состоянии тромбоцитов, а по продолжительности свечения судят о их жизнеспособности. Чем ярче свечение, тем лучше функциональное состояние тромбоцитов, чем длительнее свечение, тем больше их жизнеспособность.

Пример 1.

Исследование выполнено к биохимической лаборатории кафедры патологической физиологии Челябинской Государственной Медицинской Академии в мае 2001 г.

От областной станции переливания крови получена кровь здорового донора А, стабилизированная 3,8% раствором цитрата натрия (9:1) в пластиковую пробирку. После центрифугирования в течение 10 минут при 1500 об/мин получена ОТП (обогащенная тромбоцитами плазма), которую развели БТП (бедной тромбоцитами плазмой) до концентрации в ней тромбоцитов 300000-320000 в мкл. Пробы ОТП в объеме 1 мл поместили в кюветы и определяли хемилюминсценцию по заявляемому способу:

1. Первая проба ОТП: выявлено спонтанное свечение - регистрация в течение 10 минут.

Кол-во тромбоцитов

в ОТП, мкл Светосумма

300000 1,44

320000 1,56

2. Вторая проба, с добавлением люминола, зависимое свечение, конечная концентрация люминола в пробе 10^-6 моль регистрация 10 минут.

Светосумма

Проба 1 6,78

Проба 2 7,32

3. Люминолзависимое свечение после 1,5 часовой инкубации при 37°С имеет светосумму 7,7+1,19, что свидетельствует о нормальном функциональном состоянии тромбоцитов. Способность тромбоцитов сохранять свое свечение при 37°С в течение 1,5 часов свидетельствует и об их жизнеспособности в это время.

Предлагаемый способ по сравнению с прототипом обеспечивает:

1. Достоверность в оценке функционального состояния тромбоцитов.

2. Возможность достоверной диагностики заболевания по состоянию тромбоцитов.

Формула изобретения

Способ обнаружения свечения тромбоцитов, включающий получение обогащенной тромбоцитами плазмы крови, добавление в нее вещества, повышающего уровень свечения, помещение этой смеси в прибор для последующей регистрации свечения, отличающийся тем, что полученную обогащенную тромбоцитами плазму разводят бедной тромбоцитами плазмой до концентрации тромбоцитов 300000-350000 кл/мкл, а в качестве вещества, повышающего уровень свечения, используют люминол конечной концентрации 10^-6 моль.