Биотрансплантат и способ лечения дегенеративных и травматических заболеваний суставного хряща

 

Изобретение относится к медицине и касается приготовления биотрансплантата и способа лечения дегенеративных и травматических заболеваний суставного хряща. Биотрансплантат, характеризующийся тем, что он представляет собой суспензию хондропрогениторных клеток, полученных из гиалинового хряща эмбрионов человека 1-2 триместра беременности, путем механической и ферментативной дезагрегации с последующим культивированием клеточной суспензии на селективной культуральной среде в присутствии эмбриональной телячьей сыворотки, представляет собой гомогенную клеточную культуру с содержанием аггрекан- и коллаген II-экспресирующих клеток не менее 80%, жизнеспособных клеток не менее 90%, для лечения дегенеративных и травматических заболеваний опорно-двигательного аппарата. Изобретение обеспечивает повышение эффективности лечения в отсутствии нежелательных побочных результатов. 2 н. и 3 з.п. ф-лы.

Изобретение касается приготовления из культуры генетически немодифицированных хондропрогениторных клеток и способа лечения дегенеративных и травматических заболеваний суставного хряща.

Лечение дегенеративных заболеваний и травм опорно-двигательного аппарата до настоящего времени является сложнейшей задачей медицины. Это обусловлено широкой распространенностью данных заболеваний, большим процентом инвалидизации, снижением качества жизни больных, отсутствием эффективных методов лечения. Несмотря на углубление представлений о этиологии, патогенезе, процессах регенерации костной и хрящевой ткани, современные методы, распространенные в восстановительной хирургии, не всегда позволяют восполнить структуру и функцию поврежденных органов и тканей, что обусловлено дегенеративными процессами в рамках самого заболевания, массивностью травматического повреждения, несостоятельностью систем репарации, вследствие системных заболеваний и возрастных особенностей больных (Mankin et al 1982; Buckwalter et al., 1994). Одной из точек приложения в лечении заболеваний опорно-двигательного аппарата является стимуляция процессов репарации костной и хрящевой тканей.

В настоящие время широко используются различные биологические и синтетические материалы в виде имплантатов, в том числе с применением ауто- и аллогенных фибробластов, мезенхимальных стволовых клеток костного мозга, других элементов костного мозга, хондроцитов и др., с целью направленной остео- и хондрорегенерации (Ashton et al., 1980.; Aston et al., 1986; Brittberg et al., 1994). Как показано рядом авторов, используемые биологические и синтетические материалы не вызывают достаточной стимуляции репаративных процессов для восстановления структуры и функции ткани (Coletty et al, 1972; Furukawa et al., 1980).

Ауто- и аллогенные фибробласты представляют из себя дифференцированные клетки с низкими потенциями к пролиферации, миграции, направленной дифференцировке и репарации.

Ауто- и аллогенный костный мозг, получаемый путем стернальной пункции или трипанобиопсии гребня подвздошной кости взрослого человека (Yoo et al., 1998), характеризуется, клеточной неоднородностью, низким содержанием гематогенных стволовых клеток, которые также обладают ограниченными способностями к пролиферации, миграции и репарации. Кроме того, фибробласты, клеточные элементы костного мозга, полученные от взрослого человека, экспрессируют антигены гистосовместимости I и II классов. Применение ауто- и аллогенных фибробластов костного мозга оказывают выраженное трофическое действие, активируя неповрежденные участки ткани, однако в организме реципиента не "развиваются", и в результате элиминируются, но могут отторгаться и вызывать местные воспалительные реакции с дальнейшим развитием не гиалиновой, а волокнисто-хрящевой или фиброзной ткани (Coletty et al., 1972; Furukawa et al., 1980; Патент US Grande et al., 6214369, 04.10.2001).

Ауто- или аллогенные хондроциты, являясь зрелыми дифференцированными клетками хрящевой ткани, обладают ограниченной пролиферативной активностью, что не позволяет получать эти клетки в достаточном количестве с сохранением фенотипа (Brittberg et al., 1994; Katsube et al., 1999; Патент US McPherson et al., 6150163, 11.21.2000).

Известные способы получения хондропрогениторных клеток человека из фетальной хрящевой ткани, полученной на разных сроках гестации, включают в себя последовательную механическую и ферментативную дезагрегацию исходной хрящевой ткани с использованием различных ферментных растворов и их комбинации (коллагеназа, проназа, гиалуронидаза, деоксирибонуклеаза и др.) в различных концентрациях. В зависимости от способов дезагрегации можно получать различное количество клеток с необходимым фенотипом и различное количество жизнеспособных клеток от 50 до 80%. Для культивирования хондропрогениторных клеток используются как непокрытые носителями чашки Петри, культуральные флаконы, так и на различных неселективных подложках из коллагена, агарозы и др. (Brittberg et al., 1994; Fuchs et al., 2002). Перечисленные способы культивирования клеток в монослое не позволяют осуществлять более 2-3 пассажей без потери фенотипа хондропрогениторных клеток, которые дедифференцируются в фибробластоподобные клетки. Известны способы культивирования хондропрогениторных клеток в суспензии с использованием различных трехмерных носителей (альгинат, полигликолид, полилактат, ателоколлаген), что позволяет вести культуру более длительное время без потери фенотипа клеток (Kimura et al., 1984; Matsusaki et al., 1998).

Хондропрогениторные клетки, получаемые из фетальной хрящевой ткани путем последовательной дезагрегации и культивирования в селективных средах, при трансплантации с высокой эффективностью пролиферируют, мигрируют, встраиваются в очаг повреждения, дифференцируются в хондроциты или остеоциты, в зависимости от микроокружения, синтезируют внеклеточный матрикс, стимулируют ангиогенез (Патент RU 2160112, 12.10.2000).

Применения в качестве трансплантата культуры хондропрогениторных клеток позволяет повысить эффективность лечения и избежать нежелательных результатов.

До последнего времени основными принципами лечения дефектов суставного хряща оставались лаваж суставов и дебридемент суставной поверхности. С момента первого применения артроскопа прочно вошла в жизнь идея очистки суставов от нежизнеспособных фрагментов хряща, свободных внутрисуставных тел и синовиальной жидкости с растворенными в ней литическими ферментами. При остеоартрозе, в случаях полной дегенерации хряща сустава вплоть до обнажения субхондральной кости артроскопический лаваж и дебридемент оказались неэффективными методами лечения (Johnson et al., 1986). Известно, что для замещения дефекта хряща было предложено заполнять дефект фибрином. Во время таких процедур производился дебридемент сустава с целью очищения поверхности дефекта для лучшего контакта фибрина с подлежащей костью. Абразивная артропластика заключалась в обработке кости с помощью артроскопического бура до появления петехиального кровотечения из субхондрального слоя кости. Множественное рассверливание кости приводило к выходу на поверхность дефекта элементов костного мозга с образованием фиброзного сгустка. В основе всех этих методик лежала идея нарушения целостности кости для того, чтобы элементы костного мозга получили доступ из глубины губчатого слоя кости на поверхность дефекта. В результате при повторной артроскопии в области дефекта обнаруживалась фиброзная ткань или волокнистый хрящ (Dzioba et al., 1988; Ogilvie-Harris et al., 1991). К сожалению, новообразованная ткань уступала по своим механическим свойствам гиалиновому хрящу и не могла выдерживать нагрузки, которые прилагаются к суставу. Попытка стимулировать рост хрящевой ткани приводила к тому, что новый волокнистый хрящ не обладал достаточной прочностью и быстро изнашивался. Большое количество исследований показало ухудшение состояния больных в короткие сроки после такого вмешательства (Dzioba et al., 1988; Ogilvie-Harris et al., 1991). Для результатов лечения большое значение имела методика послеоперационного ведения больных.

В настоящее время формируется представление о том, что ключом к успешному замещению дефекта хряща является обратимость процесса выработки коллагена с помощью культуры собственных хондроцитов. Зрелые хондроциты хрящевой ткани сохраняют свою способность изменять тип вырабатываемого коллагена. При заборе ткани из донорского участка хондроциты вырабатывают коллаген II типа. Во время их культурирования происходит изменение их свойств. Если хондроциты образуют монослойную культуру, то они начинают вырабатывать коллаген I типа. После помещения этой культуры в дефект на суставной поверхности начинается вновь выработка коллагена II типа. В хондроцитах не обнаруживается коллаген Х типа, который является показателем гипертрофии хондроцитов и возможного костеобразования. Это говорит о том, что хондроциты взрослого являются зрелыми клетками, которые не могут в дальнейшем дифференцироваться в костные клетки. После имплантации хондроциты имплантированной культуры располагаются по периферии дефекта хряща и слипаются, а затем и полностью интегрируются с хрящом хозяина. В настоящее время это наиболее эффективная методика замещения дефектов хрящевой поверхности суставных концов костей (Barone et al., 1997).

Технической задачей настоящего изобретения является получение гомогенной культуры хондропрогенеторных клеток для трансплантации при травматических и дегенеративных заболеваниях хрящевой и костной ткани, для повышения эффективности их лечения.

Для решения поставленной задачи предложена группа изобретений, объединенных общим изобретательским замыслом.

Один из объектов - культура генетически немодифицированных хондропрогениторных клеток человека. Культура получена из гиалинового хряща эмбрионов человека 1-2 триместра беременности и содержит аггрекан- и коллаген II-экспрессирующих клеток не менее 80% и не более 20% примесных клеток. Второй объект - способ получения хондропрогениторных клеток. Хрящевую ткань эмбрионов человека 1-2 триместра беременности отмывают, механически измельчают и подвергают ферментативной дезагрегации в течение 40-90 минут в растворе, содержащем 0,01-0,1% раствор коллагеназы II типа, 0,05-0,1% раствор проназы Е. Суспензию первичных диссоциированных хондропрогениторных клеток засевают с плотностью не менее 1×10⁶ кл./мл. и культивируют в среде, содержащей ростовую среду DMEM/F12, 10% эмбриональной телячьей сыворотки с добавлением ростовых добавок и факторов роста.

Среду неоднократно меняют. При достижении клеточной культуры конфлюэнтного состояния осуществляют пассирование с использованием раствора трипсина для дезагрегации монослоя. Плотность посева 1×10⁶ кл./мл.

Клетки культивируют 18-25 дней при 37°С в атмосфере 5% CO₂. Пассируют культуру не более двух раз.

Способ осуществляется следующим образом

Для приготовления биотрансплантата используется фетальный абортивный материал, полученный при искусственном прерывании беременности у здоровых, предварительно обследованных на наличие вирусных и бактериальных инфекций женщин. Фетальный материал переносят в стерильный сосуд с раствором Хэнкса и гентамицина (80 мг/л). Дальнейшая работа производится в стерильных условиях ламинарного бокса. Выделенная с помощью хирургических инструментов хрящевая ткань тщательно отмывается от сгустков крови, максимально отделяются все мягкие ткани (кожа, фасции, мышцы, сухожилия, связки) и костная ткань. Полученную хрящевую ткань измельчают до кусочков не менее 1 мм. куб. Затем подвергают ферментативной и механической дезагрегации - освобождение клеточных элементов от тканевого матрикса.

Способ дезагрегации заключается в использовании 0,1% раствора коллагеназы II типа (Sigma), 0,05% раствора проназы Е (Sigma) в одномоментном инкубировании кусочков хрящевой ткани в течение 40-90 мин в двухкомпонентном (1:1) ферментном растворе с последующим измельчением путем многократного пипетирования до получения одноклеточной суспензии. Полученная суспензия трижды отмывается путем центрифугирования при 700 об/мин.

Способ культивирования

Суспензию первичных диссоциированных хрящевых клеток, полученных из фетальной хрящевой ткани, культивируют на непокрытых носителями культуральных чашках Петри в среде, содержащей ростовую среду DMEM+F12 (1:1, Gibco BRL), 10% эмбриональной телячьей сыворотки (НПП ПанЭко), 1% ИТС (инсулин, трансферин, селенит. НПП ПанЭко), 50 мкг/мл аскорбиновой кислоты (Sigma), 10 мкг/мл гентамицина, 5 мкг/мл амфотерицина В с добавлением ростовых факторов 5-20 нг/мл bFGF (Sigma) и/или 0,1-10 нг/мл TGFβ ₁ (Sigma). Замену среды производят каждые 3 дня. При достижении клеточной культуры конфлюэнтного состояния следует пассирование с использованием 0,05% раствора трипсина для дезагрегации монослоя, той же культуральной среды, при плотности посева не менее 10×10⁵ кл./мл. Возможно проведение не более двух пассажей вследствие дедифференцировки и изменении фенотипа (снижение количества аггрекан- и коллаген II-экспресирующих клеток) получаемых клеток.

Экспериментально подобранные условия, объединяющие критерии отбора исходного биоматериала и режим культивирования, являются оптимальными для достижения следующих результатов:

- Система последовательной ферментативной дезагрегации исходной ткани позволяет получать максимальное количество жизнеспособных клеток одинакового фенотипа с незначительной примесью гетеротопных клеток.

- Режим культивирования и селективные культуральные среды позволяют максимально наращивать количество аггрекан- и коллаген II-экспресирующих клеток.

- Режим культивирования и селективные культуральные среды позволяют получать гомогенную клеточную культуру с содержанием аггрекан- и коллаген II-экспресирующих клеток не менее 80%.

- Режим культивирования и селективные культуральные среды позволяют получать гомогенную клеточную культуру с содержанием не более 20% примесных клеток.

В качестве биотрансплантата используют свежеполученную клеточную культуру или после ее криоконсервировации. В качестве криопротектора используют 7% диметилсульфоксид.

Пример осуществления способа лечения

Трансплантацию осуществляют на открытом суставе, под общим наркозом. Доступ к суставу осуществляют стандартным методом в зависимости от локализации повреждения.

После артротомии осуществляют дебридемент хрящевого дефекта вплоть до здоровой хрящевой ткани. Удаляют рубцы и освобождают субхондральную кость, которая должна быть неповрежденной и не кровоточить. Из надкостницы близлежащей кости выкраивают свободный лоскут несколько больших размеров, чем размер дефекта. Дефект хряща покрывают надкостницей, которая обращена камбиальным слоем. Далее надкостницу подшивают к краям дефекта рассасывающимися нитями 6-0. Сверху шов покрывают фибриновым клеем. Для заполнения дефекта хряща суспензию хондропрогениторных клеток в необходимом объеме с количеством клеток не менее 10 млн. в мл вводят под надкостницу на дефект хряща с помощью 10 мл стерильного шприца. Отверстие после введения клеток заклеивают фибриновым клеем. Операционную рану ушивают традиционным способом.

В послеоперационный период необходима полная иммобилизация сустава в течение 2-х недель; с 3 по 6 недели разрешается частичная нагрузка на оперированном сустав; с 6 по 12 - щадящая нагрузка; с 12 по 26 - свободный режим движения в суставе и с 26 по 52 недели - движение в суставе без ограничений. Клеточная культура генетически немодифицированных хондропрогениторных клеток обладает высокими потенциями к пролиферации, дифференцировке, синтезирующих внеклеточный хрящевой матрикс, для использования в качестве биотрансплантата в травматологии, ортопедии, челюстно-лицевой хирургии.

Формула изобретения

1. Биотрансплантат для лечения дегенеративных и травматических заболеваний суставного хряща, представляющий собой суспензию хондропрогениторных клеток человека, характеризующийся содержанием аггрекан- и коллаген II-экспрессирующих клеток не менее 80%, жизнеспособных клеток не менее 90%, полученных из гиалинового хряща эмбрионов человека 1-2-го триместра беременности, путем механической и ферментативной дезагрегации, которые культивируют в среде, содержащей ростовую среду DMEM+F12, 10% эмбриональной телячьей сыворотки, с добавлением ростовых добавок и факторов роста.

2. Биотрансплантат по п.1 содержит свежеприготовленную клеточную культуру.

3. Биотрансплантат по п.1 содержит клеточную культуру криоконсервированную с использованием в качестве криопротектора диметилсульфоксида.

4. Способ лечения дегенеративных и травматических заболеваний суставного хряща, характеризующийся тем, что используют биотрансплантат по пп.1-3.

5. Способ по п.4, где суспензию хондропрогениторных клеток с количеством клеток не менее 10 млн в 1 мл вводят под надкостницу на дефект хряща.