Тимолсодержащая композиция, полезная для лечения устойчивых к лекарственным средствам бактериальных инфекций
Настоящее изобретение относится к композиции, предназначенной для лечения устойчивых к лекарственным средствам бактериальных инфекций, содержащей эффективное количество “тимола”, полученного из растения Trychyspermum ammi, комбинацию мятного масла, содержащего соответствующие количества монотерпенов, выделяемого из Mentha spicata и Mentha arvensis, и обычные добавки, а также к способу получения композиции путем смешивания указанных выше ингредиентов и к способу лечения устойчивых к лекарственным средствам бактериальных инфекций путем введения пациенту терапевтически эффективного количества указанной композиции. Технический результат: создание средства для лечения заболеваний, вызываемых устойчивыми к лекарственным средствам бактериями или микроорганизмами, которое оказывает минимальное побочное действие или вообще не имеет побочных эффектов. 3 н. и 16 з.п. ф-лы, 12 табл.
Область техники
Настоящее изобретение относится к новой синергичной композиции, полезной для лечения устойчивых к лекарственным средствам бактериальных инфекций, которая содержит эффективное количество тимола, смесь эфирных масел Mentha arvensis и Mentha spicata или их монотерпеновых компонентов в соответствующем соотношении и обычные добавки. Указанная композиция полезна для лечения устойчивых к лекарственным средствам кишечных и системных инфекций. Композиция, отличающаяся повышенной активностью тимола, включает тимол в сочетании с указанным маслом, которое содержит редкую смесь карвона, лимонена и ментола. Данное изобретение относится также к способам получения указанной композиции и к способу применения тимола, выделенного из семян растения Trychyspermum amini (Ajwain), в качестве антибиотической композиции четвертого поколения, для борьбы с устойчивыми к лекарственным средствам бактериям. В частности, данное изобретение относится к применению соединения "тимол", выделенного из масла, получаемого перегонкой из семян растения Trychyspermum arnmi (Ajwain), для уничтожения бактерий, устойчивых даже к сильнодействующим антибиотикам третьего поколения, и патогенных микроорганизмов, устойчивых ко многим лекарственным средствам (mdr), и таким образом оно полезно в качестве травяной антибиотической композиции четвертого поколения на растительной основе.
Предпосылки изобретения
Микробные инфекции представляют главную опасность для здоровья человека и являются основной причиной заболеваний, вызывающих высокую смертность среди населения во всем мире. Кроме того, инфекции существенно ухудшают работоспособность человека, оказывая отрицательное влияние на разные метаболические функции и системы, такие как пищеварительная, дыхательная, мочеиспускательная, кровеносная, нервная системы и кожа. Это вызывает постоянное недомогание человека, пока он полностью не избавится от вызывающих болезнь микроорганизмов. Бактериальные инфекции представляют серьезную угрозу для здоровья и благополучия людей всех возрастов. Начиная с 1940-х годов, когда Александр Флеминг открыл пенициллин, для борьбы с патогенными микроорганизмами и лечения инфекционных заболеваний врачи обычно используют антибиотики и противомикробные лекарственные средства. Однако инфекционные микроорганизмы постоянно оказывают противодействие новым лекарственным средствам, вырабатывая устойчивость к используемому лекарственному средству/антибиотику. Появление штаммов, устойчивых к нескольким лекарственным средствам, представляет серьезную проблему в области медицины. Основной причиной возникновения устойчивости являются случайные мутации. Мутации могут возникать в генах, ответственных за обсуждаемую чувствительность к лекарственному средству. При недостаточном количестве новых антибиотиков, отличающихся новым механизмом воздействия, человечество может оказаться на грани медицинской катастрофы. Настало время обратиться к скрытым возможностям молекул растений, используя современные средства целенаправленного поиска для создания лекарственных средств и антибиотиков нового, более совершенного поколения, характеризующихся новыми принципами действия.
Новые противомикробные средства создают путем структурной модификации существующих средств, получая таким образом лекарственные средства следующего поколения с более широким спектром действия и более высокой эффективностью. Хорошо известными примерами создания семейства противомикробных средств следующего поколения являются пенициллины и цефалоспорины. Указанные лекарственные средства получены в результате химической модификации основного β-лактамного кольца. Цефалоспорин является лекарственным средством третьего поколения на основе цефалотина. Аналогичным образом, начиная с 1962 г., когда Лешер вместе с коллегами использовал налидиксовую кислоту для создания хинолона, противомикробного лекарственного средства первого поколения, семейство хинолонов уже пополнилось лекарственными средствами третьего поколения. В действительности, налидиксовая кислота нашла ограниченное применение при лечении системных инфекций, и в 1970-х годах были получены минимально улучшенные хинолоны, такие как оксолиновая кислота, пипемидиновая кислота и циноксацин. В начале 1980-х годов произошел прорыв, ознаменовавшийся созданием фторированных хинолонов. Сначала Вулфсон и Хупер создали норфлоксацин, хинолон второго поколения, имеющий 6-фтор и 7-пиперазин-заместители. Указанное вещество обладало более эффективным действием против грамотрицательных и грамположительных бактерий, таких как Pseudomonas aeruginosa и Staphylococcus aureus. Вслед за этим были разработаны родственные молекулы таких лекарственных веществ, как ципрофлоксацин, эноксацин, офлоксацин, пефлоксацин и так далее. Почти одновременно были созданы лекарственные средства третьего поколения, такие как ломфлоксацин, флероксацин, темафлоксацин, тосуфлоксацин, замещенные одним или несколькими дополнительными атомами фтора по сравнению с хинолонами второго поколения, имеющими один атом фтора в положении 6 основных хинолонов.
Постоянное и неограниченное использование хинолоновых/фторхинолоновых лекарственных средств постепенно делает бактерии, против которых направлены данные лекарственные средства, невосприимчивыми к их воздействию, что требует увеличения доз указанных соединений для уничтожения патогенных микроорганизмов. Поскольку указанные лекарственные средства являются синтетическими соединениями, они оказывают сильное побочное действие. Кроме того, патогенные микроорганизмы становятся устойчивыми к воздействию постоянно увеличивающихся доз указанных соединений, что еще больше усугубляет сложившуюся ситуацию. Для решения данной проблемы заявители разработали новый способ применения тимола, известного растительного соединения, которое используют отдельно для уничтожения устойчивых к лекарственных средствам бактерий и в сочетании с другими антибиотиками для борьбы с возникновением у бактерий устойчивости к лекарственным средствам.
Среди смертельных бактериальных инфекций первое место занимает туберкулез, который ежегодно уносит более трех миллионов жизней во всем мире. Еще более ужасающим фактором является увеличение заболеваемости и смертности от туберкулеза среди ВИЧ-инфицированных субъектов. Распространение туберкулеза и частота поражения данным заболеванием лиц, зараженных вирусом иммунодефицита человека, как в развивающихся, так и в промышленно развитых странах заставило обратить внимание на насущную необходимость создания лекарственных средств нового, более совершенного поколения.
Во всем мире хорошо известно, что широко используемые антибиотики являются недостаточно эффективными для лечения таких заболеваний, как туберкулез. Даже развивающиеся страны вынуждены признать, что указанные заболевания приобретают характер эпидемии. Необходимо постоянно искать новые комбинации лекарственных средств, используя активные молекулы из природных источников, таких как растения, так как в противном случае человечеству в новом тысячелетии придется столкнуться с серьезными проблемами. Наиболее многообещающим достижением в области создания лекарственных средств является открытие новых молекул или новых применений для уже известных соединений, которые являются безопасными и не имеют каких-либо побочных эффектов. Такие активные биомолекулы в сочетании с другими антибиотиками могут уничтожать устойчивые к лекарственным средствам бактерии и одновременно с этим контролировать дальнейшее развитие устойчивости к лекарственным средствам у инфекционных микроорганизмов.
Тимол широко используется в разных травяных препаратах, начиная с жидкостей для полоскания рта и лекарственных средств против кишечных расстройств и кончая инфекционными поражениями кожи. Исходное масло и сам тимол являются непременными компонентами “бабушкиных” домашних рецептов для лечения самых разных недомоганий, так как они в равной степени полезны как детям, так и взрослым. Такие средства широко используются в Индии и на других континентах благодаря официальному и неофициальному распространению знаний традиционной и растительной медицины.
В некоторых соответствующих источниках предшествующего уровня техники, которые необходимо привести в данном описании изобретения для подтверждения уникальности настоящего изобретения, описаны различные нижеследующие применения.
1. Композиция для лечения вирусных инфекций, включая ВИЧ (Pruthi et al. 1999; патент США №5980903, 9 ноября 1999 г.), и лекарственные средства подобного действия (Badaway 1998; патент США №5801153, сентябрь 1998 г.; Rohatgi 1996, патент США №5529778, июнь 1996 г.; Hozumi et al. 1995, патент США №5411733, май 1995 г.).
2. Анальгезирующая композиция, временно подавляющая болевые симптомы артрита (Beck 1991, патент США №5073366, 17 декабря 1991 г.), и лекарственные средства подобного действия (Arbir et al. 1981, патент США №4307109, декабрь 1981 г.; Dubash et al. 1983, патент США №4383986, май 1983 г.; Seth 1985, патент США №4540572, сентябрь 1985 г.; Geria 1987, патент США №4702916, октябрь 1987 г.; Grohe 1989, патент США №4844902, июль 1989 г.; Bisset et al. 1989, патент США №4847071, июль 1989 г.; Deckner et al., патент США №4863725, июль 1989 г.).
3. Порошковая композиция для получения жидкости для полоскания рта (Smigel et al. 1999, патент США №4925655, 15 марта 1990 г.) и лекарственные средства подобного действия (Fleischman 1936, патент США №2035267, март 1936 г.; Poerschke 1937, патент США №2094671, октябрь 1937 г.; Welsh et al. 1970, патент США №3518343, июнь 1970 г.; Вrеесе et al. 1974, патент США №3821117, июнь 1974 г.; Cheng 1976, патент США №3936385, февраль 1976 г.).
Как видно из приведенных выше ссылок и литературных источников, ни в одном из известных изобретений не описывается и даже не упоминается возможность применения тимола и содержащих его композиций для лечения заболеваний, вызываемых устойчивыми к лекарственным средствам бактериями/микроорганизмами. И в то же время хорошо известно об использовании/потреблении данного вещества человеком, что делает ненужным проведение токсикологического исследования.
Таким образом, существует насущная потребность в эффективном недорогом средстве для лечения серьезных и опасных для жизни бактериальных инфекций, включая туберкулез, которое оказывает минимальное побочное действие или вообще не имеет побочных эффектов. Настоящее изобретение позволяет удовлетворить вышеуказанную потребность благодаря использованию известного природного соединения растительного происхождения и содержащей его композиции вместе с другими антибиотиками/соединениями для уничтожения бактерий, включая возбудителей туберкулеза. Специальные анализы биологической активности позволили выявить новое, применение растительного соединения "тимол", выделенного из масла, которое получают перегонкой из семян растения Trychyspermum ammi (Ajwain), для уничтожения бактерий, устойчивых даже к широко применяемым антибиотикам третьего поколения, и патогенных микроорганизмов, устойчивых к нескольким лекарственным средствам. Происхождение тимола, предшествующий опыт его традиционного применения и имеющаяся информация о потреблении человеком указанного соединения свидетельствуют о том, что данное вещество можно безопасно использовать в качестве травяного антибиотика четвертого поколения на растительной основе. Поэтому заявители исследовали возможность усиления активности тимола и разработали новую композицию, в состав которой входит тимол в сочетании с маслами/монотерпенами, полученными из различных видов мяты (Mentha arvensis и М. spicata), содержащих редкую комбинацию карвона, лимонена и ментола.
Заявители открыли совершенно новые и перспективные возможности для защиты здоровья человека и борьбы с микробными инфекциями, вызываемыми устойчивыми к лекарственным средствам патогенными микроорганизмами. Неограниченное и чрезмерное применение известных антибиотиков вызывает появление инфекционных микроорганизмов, устойчивых к одному или нескольким лекарственным средствам. Заявители использовали категории устойчивости бактерий к лекарственным средствам в качестве основы для их классификации в зависимости от опасности для здоровья человека, которая гораздо шире традиционных таксономических классов. Данное изобретение, в частности, имеет дело с устойчивыми к лекарственным средствам бактериями, возникающими вследствие мутации, с последующим отбором из-за постоянного присутствия используемых антибиотиков. В своих экспериментах заявители использовали микроорганизмы Escherichia coli и Mycobacterium в качестве модельных систем для исследования возникновения устойчивости к хинолоновым и фторхинолоновым лекарственным средствам и появления штамма, устойчивого к нескольким лекарственным средствам, и обнаружили возможность нового применения молекулы растений (тимол) для уничтожения штаммов, устойчивых к нескольким лекарственным средствам, и бактерий, устойчивых к лекарственным средствам нового поколения, возникших под действием указанных лекарственных средств. Сделанное открытие является уникальным и имеет большие перспективы применения в области медицины.
Цели изобретения
Основной целью данного изобретения является новая композиция, полезная для лечения устойчивых к лекарственным средствам бактериальных инфекций.
Другой целью данного изобретения является новая композиция, содержащая эффективное количество тимола, выделенного из растения Trychyspermum ammi (Ajwain), комбинацию эфирных масел или монотерпенов, выделенных из Mentha spicata и Mentha arvensis, которая полезна для лечения бактериальных инфекций.
Еще одной целью данного изобретения являются способы получения новой композиции по настоящему изобретению.
Еще одной целью данного изобретения является антибактериальное средство, содержащее тимол, которое предназначено для лечения бактериальных инфекций.
Еще одной целью данного изобретения является способ применения тимола для уничтожения устойчивых к лекарственным средствам бактерий.
Краткое изложение изобретения
Настоящее изобретение относится к новой композиции, содержащей эффективное количество тимола, полученного из растения Trychyspermum ammi (Ajwain), соответствующую комбинацию мятных масел, полученных из Mentha spicata и Mentha arvensis, и обычные добавки. Данное изобретение относится также к способам получения указанной новой композиции, предназначенной для лечения устойчивых к лекарственным средствам бактериальных инфекций. Кроме того, данное изобретение относится к антибактериальному средству, содержащему эффективное количество тимола, которое предназначено для уничтожения устойчивых к лекарственным средствам бактерий. Данное изобретение относится также к способу применения тимола для уничтожения устойчивых к лекарственным средствам бактерий.
Подробное описание изобретения
Данное изобретение относится к новой синергичной композиции, полезной для лечения устойчивых к лекарственным средствам бактериальных инфекций, которая содержит эффективное количество "тимола", полученного из растения Trychyspermum ammi, комбинацию мятных масел, включающую соответствующие количества определенных монотерпенов, выделенных из Mentha spicata и Mentha arvensis, и обычные добавки.
В одном варианте осуществления изобретения тимол присутствует в количестве от примерно 100 до 500 мг или 20-50% (мас./мас.).
В другом варианте осуществления изобретения комбинация мятных масел присутствует в количестве от примерно 0,1 до 0,5 мг.
В другом варианте осуществления изобретения добавки выбирают из группы, включающей лимонную кислоту в количестве примерно 2-10 мг, карбонат кальция в количестве примерно 100-200 мг, гель гидроксида магния в количестве примерно 50-100 мг, лактозу в количестве примерно 200-600 мг, мед в количестве от примерно 0,1 до 1%, глутамат натрия в количестве примерно 200 мг и натриевый буфер.
В другом варианте осуществления изобретения мятное масло, если требуется, разводят до 10 раз.
В другом варианте осуществления изобретения мятное масло содержит лимонен в интервале от примерно 6 до 25%, ментол в интервале от примерно 0,50 до 2,50%, карвон в интервале от примерно 64,0 до 76%.
В другом варианте осуществления изобретения мед разводят до 10 раз.
В другом варианте осуществления изобретения данная композиция является эффективной против группы бактерий, выбираемых из рода Mycobacterium или Escherichia.
В другом варианте осуществления изобретения данная композиция является эффективной против бактерий, устойчивых к лекарственным средствам, выбираемым из группы, включающей бромид этидия, изониазид, хлорамфеникол, тетрациклин, рифампицин, налидиксовую кислоту, оксолиновую кислоту, спарфлоксицин, ципрофлоксицин и ломфлоксицин.
Новая синергичная композиция, полезная для лечения устойчивых к лекарственным средствам бактериальных инфекций, содержит эффективное количество "тимола", полученного из растения Trychyspermum ammi, мятное масло, полученное из гибрида Mentha spicata и Mentha arvensis, и обычные добавки.
Следует отметить, что синергичная композиция по данному изобретению обладает удивительными и неожиданными антибактериальными свойствами. Отдельные ингредиенты данной композиции не обладают свойствами композиции, полезной для лечения устойчивых к лекарственным средствам бактериальных инфекций. Композиция по настоящему изобретению, содержащая эффективное количество "тимола", полученного из растения Trychyspermum ammi, мятное масло, полученное из гибрида Mentha spicata и Mentha arvensis, и обычные добавки, обладает удивительными и неожиданными антибактериальными свойствами.
Композиция по настоящему изобретению может быть получена в разных физических формах, таких как таблетки, сироп, порошки, инъекционные растворы и т.д., известных в данной области. Чтобы получить такие композиции в разных физических формах, основные ингредиенты композиции, в частности соединение "тимол" и комбинацию эфирных масел, включающую желаемую смесь монотерпенов, смешивают с указанными выше обычными добавками, такими как мед, глутамат натрия, лимонная кислота и тому подобное, для повышения лечебной эффективности. Следует также отметить, что приведенные выше количества соответствующих ингредиентов в композиции указаны в качестве примеров, при этом можно использовать различные количества требуемых ингредиентов, которые могут быть легко определены специалистом в данной области. Соотношение количеств компонентов в композиции по настоящему изобретению не имеет критического значения и может изменяться в широких пределах. Лучшие результаты, конечно, будут получены при использовании тимола и определенной комбинации мятных масел в указанных выше пропорциях. Оптимальные количества ингредиентов в данной композиции будут изменяться в зависимости от способа введения композиции.
Данное изобретение относится также к способу получения композиции, полезной для лечения устойчивых к лекарственным средствам бактериальных инфекций, который включает стадию смешивания эффективного количества масла тимола, полученного из растения Trychyspermum ammi, и комбинации мятных масел, полученных из Mentha spicata и Mentha arvensis, с обычными добавками.
В одном варианте осуществления изобретения тимол присутствует в количестве от примерно 100 до 500 мг или 20-50% (мас./мас.).
В другом варианте осуществления изобретения мятное масло присутствует в количестве от примерно 0,1 до 0,5 мг.
В другом варианте осуществления изобретения добавки выбирают из группы, включающей лимонную кислоту в количестве примерно 2-10 мг, карбонат кальция в количестве примерно 100-200 мг, гель гидроксида магния в количестве примерно 50-100 мг, лактозу в количестве примерно 200-600 мг, мед в количестве от примерно 0,1 до 1%, глутамат натрия в количестве примерно 200 мг и натриевый буфер.
В другом варианте осуществления изобретения мятное масло, если требуется, разводят до 10 раз.
В другом варианте осуществления изобретения мятное масло содержит лимонен в интервале от примерно 6,8 до 23,2%, ментол в интервале от примерно 0,66 до 2,50%, карвон в интервале от примерно 64,0 до 76,1%.
В другом варианте осуществления изобретения мед необязательно разводят до 10 раз.
В другом варианте осуществления изобретения масло тимола и мятное масло диспергируют в 0,1-1% меда с образованием сиропа.
В другом варианте осуществления изобретения масло тимола и мятное масло смешивают с лимонной кислотой в количестве 2-10 мг и растворяют в буфере, содержащем глутамат натрия, с образованием инъекционного раствора.
В другом варианте осуществления изобретения данная композиция является эффективной против группы бактерий, выбираемых из рода Mycobacterium или Escherichia.
В другом варианте осуществления изобретения данная композиция является эффективной против бактерий, устойчивых к лекарственным средствам, выбираемым из группы, включающей бромид этидия, изониазид, хлорамфеникол, тетрациклин, рифампицин, налидиксовую кислоту, оксолиновую кислоту, спарфлоксицин, ципрофлоксицин и ломфлоксицин.
Данное изобретение относится также к способу лечения устойчивых к лекарственным средствам бактериальных инфекций у человека, включающему стадию введения терапевтически эффективного количества новой композиции субъекту, нуждающемуся в этом.
В одном варианте осуществления изобретения данную композицию вводят перорально или подкожно.
В другом варианте осуществления изобретения данную композицию растворяют в 5 мл 0,05 М раствора натриевого буфера (рН 7,0), содержащего 200 мг глутамата натрия, и вводят в виде подкожной инъекции.
В другом варианте осуществления изобретения данная композиция является эффективной против бактериальных инфекций, таких как кишечные и системные инфекции.
В другом варианте осуществления изобретения лечение включает введение композиции против бактериальных инфекций, вызываемых бактериями, устойчивыми к лекарственным средствам, выбираемым из группы, включающей бромид этидия, изониазид, хлорамфеникол, тетрациклин, рифампицин, налидиксовую кислоту, оксолиновую кислоту, спарфлоксицин, ципрофлоксицин и ломфлоксицин.
В одном варианте осуществления изобретения данную композицию используют для лечения инфекций, вызываемых устойчивыми к нескольким лекарственным средствам бактериями, выбираемыми из рода Mycobacterium или Escherichia.
В другом варианте осуществления изобретения данную композицию используют для уничтожения бактерий, устойчивых к группе лекарственных средств, включающих бромид этидия, изониазид, хлорамфеникол, тетрациклин, рифампицин, налидиксовую кислоту, оксолиновую кислоту, спарфлоксицин, ципрофлоксицин и ломфлоксицин.
Настоящее изобретение является результатом запланированной экспериментальной работы путем выполнения анализов методом биологической оценки удельной активности. Данные исследования направлены на определение и оценку лечебного потенциала растительного соединения "тимол", выделенного из масла растения "Ajwain", в качестве антибиотика нового поколения и создание травяной антибиотической композиции более сильного действия, в частности, способного уничтожать устойчивые к лекарственным средствам бактерии. В результате выполненных экспериментов были получены данные о том, что штаммы Escherichia coli, устойчивые к налидиксовой кислоте (хинолоновое лекарственное средство широкого спектра действия) вследствие мутаций в гене gyrА, более чувствительны к воздействию масла, выделенного из растения Trychyspermum ammi, и его главного компонента "тимола".
Данное изобретение подробно описано в нижеследующих примерах, которые не должны рассматриваться как ограничивающие каким-либо образом объем или сферу применения изобретения.
Пример 1
Антибактериальную активность масла, выделенного из растения Trychyspermum ammi, в частности, тимольной и нетимольной фракции указанного масла определяют на основании зон торможения роста, образующихся на бактериальном газоне устойчивых к лекарственным средствам штаммов, при помощи анализов методом диффузии в дисках (таблица 1).
| Таблица 1 | |||||
| Зона торможения роста (в мм), определяемая при помощи анализов методом диффузии в дисках | |||||
| Штаммы Е. Coli | Наело Trychyspermum ammi | Нетимольная фракция масла | Тимол | ||
| 50 мг/мл | 50 мг/мл | 10 мг/мл | 20 мг/мл | 50 мг/мл | |
| СА8000 | 4,5 | - | 1,0 | 2,0 | 5,0 |
| DH5α | 5,0 | - | 1,0 | 2,0 | 5,5 |
| ЕТ8000 | 5,5 | - | 1,0 | 3,0 | 6,0 |
В приведенной выше таблице СА8000 означает дикий штамм Е. coli, в то время как DH5α и ЕТ8000 представляют мутации gyr, то есть изменение гена, кодирующего субъединицу Gyr A фермента ДНК-гиразы, ответственного за релаксацию ДНК.
Указанные мутанты устойчивы к воздействию хинолона вследствие измененной ДНК-гиразы. Специфические мутации подтверждены генетической комплементацией путем переноса клонированного в плазмиде гена gyr А. Как показано в таблице, зона уничтожения бактерий тимолом гораздо больше в случае мутантных штаммов дуг, которые устойчивы к воздействию указанных выше лекарственных средств. Подобная активность не обнаружена в нетимольной фракции рассмотренного масла.
Пример 2
Чувствительность устойчивых к надидиксовой кислоте штаммов Escherichia coli к различным антибиотикам, определяемая методом ядовитого агара
Независимые мутанты, устойчивые к налидиксовой кислоте, получают в Е. coli путем индуцированного и спонтанного мутагенеза в диком штамме СА8000. Полученные мутанты испытывают на чувствительность не только к налидиксовой кислоте, но также к другим хинолоновым и фторхинолоновым лекарственным средствам последних поколений, так как устойчивость к лекарственным средствам второго и третьего поколений также возникает вследствие одной или нескольких мутаций только в гене gyrА. В нижеследующей таблице 2 показана перекрестная устойчивость таких мутантов.
| Таблица 2 | |||||
| Перекрестная устойчивость мутантов NalR E. coli | |||||
| Мутантные (NalR) штаммы Е. coli | Рост в среде ядовитого агара, содержащей | ||||
| Налидиксовая кислота | Оксолиновая кислота | Спарфлоксацин | Ципрофлоксацин | Ломфлоксацин | |
| 50 мкг/мл | 5 мкг/мл | 5 мкг/мл | 5 мкг/мл | 5 мкг/мл | |
| CAN 101 | ÷ | - | ÷ | - | - |
| CAN 102 | ÷ | - | ÷ | - | - |
| CAN 103 | ÷ | - | ÷ | - | - |
| CAN 104 | ÷ | - | ÷ | - | - |
| CAN 105 | ÷ | - | ÷ | - | - |
| CAN 106 | ÷ | ÷ | ÷ | - | - |
| CAN 107 | ÷ | ÷ | ÷ | - | - |
| CAN 108 | ÷ | ÷ | ÷ | - | - |
| CAN 109 | ÷ | ÷ | ÷ | - | - |
| CAN 110 | ÷ | ÷ | ÷ | - | - |
| CAN 111 | ÷ | ÷ | ÷ | - | - |
| CAN 112 | ÷ | - | ÷ | - | - |
| CAN 113 | ÷ | ÷ | ÷ | - | - |
| CAN 114 | ÷ | ÷ | ÷ | - | - |
| CAN 115 | ÷ | ÷ | ÷ | - | - |
| CAN 116 | ÷ | ÷ | ÷ | - | - |
| CAN 117 | ÷ | ÷ | ÷ | - | - |
| CAN 118 | ÷ | ÷ | ÷ | - | - |
| CAN 119 | ÷ | - | ÷ | - | - |
| CAN 120 | ÷ | - | ÷ | - | - |
| CAN 121 | ÷ | ÷ | ÷ | - | - |
| CAN 122 | ÷ | ÷ | ÷ | - | - |
| CAN 123 | ÷ | ÷ | ÷ | - | - |
| CAN 124 | ÷ | ÷ | ÷ | - | |
| CAN 125 | ÷ | ÷ | ÷ | - | - |
| CAN 126 | ÷ | ÷ | ÷ | - | - |
| CA 8000 (WT) | - | - | - | - | - |
| ÷ = Наличие роста; - = Отсутствие роста; WТ = дикий штамм |
Устойчивые к налидиксовой кислоте штаммы растут в присутствии разных антибиотиков, представленных в приведенной выше таблице. Указанные мутанты характеризуются положительным ростом в присутствии высокой концентрации налидиксовой кислоты. Некоторые из указанных мутантов устойчивы также к оксолиновой кислоте, все штаммы устойчивы к спарфлоксацину, но ни один из штаммов не устойчив к воздействию ципрофлоксацина, лекарственного средства второго поколения, и ломфлоксацина, лекарственного средства третьего поколения. Как предполагалось, контрольный дикий штамм СА8000 чувствителен ко всем антибиотикам.
Пример 3
Биологическая оценка тимола на активность против мутантов NаlR Е. coli
Указанные выше мутанты испытывают на чувствительность к тимолу с целью дальнейшего подтверждения гипотезы о более эффективном уничтожении тимолом мутантов NalR E. coli, что свидетельствует о возможности его применения в качестве растительного антибиотика для уничтожения устойчивых к лекарственным средствам бактерий. При выполнении указанных анализов тимол демонстрирует высокую активность против всех мутантов NalR, устойчивых к одному или нескольким лекарственным средствам (таблица 3).
| Таблица 3 | |||
| Анализ методом диффузии в дисках для определения активности тимола против устойчивых к налидиксовой кислоте мутантов Escherichia coli | |||
| Мутантные (NalR штаммы Е. coli | Тимол (зоны торможения роста в мм) | ||
| 50 мкг/диск | 100 мкг/диск | 250 мкг/диск | |
| CAN 101 | Тr | 1,5 | 4,0 |
| CAN 102 | Тr | 2,0 | 7,0 |
| CAN 103 | Тr | 2,0 | 4,0 |
| CAN 104 | Тr | 2,0 | 6,0 |
| CAN 105 | Тr | 2,0 | 5,0 |
| CAN 106 | 1 | 2,0 | 4,0 |
| CAN 107 | 1 | 3,0 | 5,0 |
| CAN 108 | Тr | 2,0 | 5,0 |
| CAN 109 | 1 | 3,0 | 6,0 |
| CAN 110 | 1 | 3,0 | 6,0 |
| CAN 111 | 1 | 3,0 | 5,0 |
| CAN 112 | 1 | 3,0 | 5,0 |
| CAN 113 | Тr | 2,0 | 5,0 |
| CAN 114 | 1 | 3,0 | 6,0 |
| CAN 115 | 1 | 3,0 | 5,0 |
| CAN 116 | 1 | 3,0 | 5,0 |
| CAN 117 | 1 | 3,0 | 5,0 |
| CAN 118 | 1 | 3,0 | 5,0 |
| CAN 119 | 1 | 3,0 | 6,0 |
| CAN 120 | 1 | 3,0 | 6,0 |
| CAN 121 | 1 | 3,0 | 5,0 |
| CAN 122 | Тr | 2,0 | 5,0 |
| CAN 123 | 1 | 3,0 | 5,0 |
| CAN 124 | 1 | 3,0 | 5,0 |
| CAN 125 | 1 | 3,0 | 5,0 |
| CAN 126 | 1 | 2 | 5,0 |
| CA 8000 (WT) | 1 | 2 | 4 |
| Тr - Следовая активность (<0,5 мм); WТ = дикий штамм |
Соединение "тимол" действительно способно уничтожать все устойчивые к налидиксовой кислоте мутанты Е. coli с более высокой эффективностью по сравнению с диким штаммом СА8000.
Пример 4
Выделение и исследование мутантов Е. coli, устойчивых к ломфлоксацину (фторхинолоновое лекарственное средство третьего поколения)
Индуцированные мутанты получают после отбора в присутствии ломфлоксацина в питательной среде. Рост устойчивых к ломфлоксацину штаммов Escherichia coli исследуют в присутствии различных антибиотиков методом ядовитого агара для определения перекрестной устойчивости. Как ожидалось, устойчивые к ломфлоксацину (лекарственное средство третьего поколения) штаммы устойчивы также к антибиотикам первого и второго поколений (таблица 4).
| Таблица 4 | ||||||
| Характер чувствительности устойчивых к ломфлоксацину клеток Е. coli | ||||||
| Мутантные (LomR) штаммы Е. coli | Рост в среде ядовитого агара, содержащей | |||||
| Ломфлоксацин | Налидиксовая кислота | Оксолиновая кислота | Аорфлоксацин | Ципрофлоксацин | Спарфлоксацин | |
| 1,5 мкг/м | 50 мкг/мл | 5 мкг/мл | 20 мкг/мл | 2 мкг/мл | 20 мкг/мл | |
| CAL 101 | ÷ | ÷ | ÷ | ÷ | - | ÷ |
| CAL 102 | ÷ | ÷ | ÷ | ÷ | - | ÷ |
| CAL 103 | ÷ | ÷ | ÷ | ÷ | - | ÷ |
| CAL 104 | ÷ | ÷ | ÷ | ÷ | - | ÷ |
| CAL 105 | ÷ | ÷ | ÷ | ÷ | - | ÷ |
| CAL 106 | ÷ | ÷ | ÷ | ÷ | - | ÷ |
| CAL 107 | ÷ | ÷ | ÷ | ÷ | - | ÷ |
| CAL 108 | ÷ | ÷ | ÷ | ÷ | - | ÷ |
| СА 8000(WT) | - | - | - | - | - | - |
| ÷ = Наличие роста; - = Отсутствие роста; WT = дикий штамм |
Пример 5
Биологическая оценка тимола на активность против мутантов LomR Е. coli
Мутанты, устойчивые к ломфлоксацину, испытывают на чувствительность к тимолу при помощи анализа методом диффузии в дисках. Как видно из таблицы 5, тимол эффективно уничтожает все мутантные клетки LomR Escherichia coli, что свидетельствует о возможности его прямого использования в качестве лекарственного средства нового поколения против устойчивых к лекарственным средствам бактерий.
| Таблица 5 | ||
| Анализ методом диффузии в дисках для определения активности тимола против устойчивых к ломфлоксацину мутантов Escherichia coli | ||
| Мутантные (LomrR) штаммы Е. coli | Тимол (зоны торможения роста в мм) | |
| 50 мкг/диск | 100 мкг/диск | |
| CAL 101 | 2,0 | 4,0 |
| CAL 102 | 3,0 | 5,0 |
| CAL 103 | 2,0 | 3,0 |
| CAL 104 | 1,0 | 1,5 |
| CAL 105 | 2,0 | 4,0 |
| CAL 106 | 2,0 | 4,0 |
| CAL 107 | 2,0 | 4,0 |
| CAL 108 | 3,0 | 5,0 |
| СА8000 | 3,0 | 5,0 |
| Тr = Следовая активность (<0,5 мм); WT = дикий штамм |
Пример 6
Оценки тимола на активность против устойчивых к налидиксовой кислоте мутантов Mycobacterium smegmatis
Получив обнадеживающие результаты эффективности тимола в качестве антибактериального средства против разных концентраций и типов устойчивых к лекарственным средствам мутантов Е. coli, авторы настоящего изобретения выполнили эксперименты с использованием Mycobacterium. Были использованы бактерии М. smegmatis, представляющие быстрорастущую модельную систему, предназначенную для исследования лекарственных средств против туберкулеза. В диком штамме МС2 была выделена серия устойчивых к лекарственным средствам мутантов. Устойчивые к налидиксовой кислоте штаммы сначала испытывали на чувствительность к тимолу. Устойчивые к налидиксовой кислоте мутанты получены путем выращивания дикого штамма Mycobacterium smegmatis в среде, содержащей 50 мкг/мл налидиксовой кислоты. Как видно из таблицы 6, тимол может эффективно уничтожать штаммы NalR Mycobacterium smegmatis, что свидетельствует о его полезности в качестве эффективного антибактериального лекарственного средства против микобактерий.
Пример 7
Биологическая оценка тимола на активность против мутантов LomR Mycobacterium smegmatis
Устойчивые к ломфлоксацину мутанты получают, выращивая дикий штамм Mycobacterium smegmatis в среде, содержащей 20 мкг/мл ломфлоксацина (антибиотик третьего поколения, относящийся к классу фторхинолонов). Указанные мутанты устойчивы к воздействию ломфлоксацина до концентрации 60 мкг/мл. Важно отметить, что степень устойчивости, достигаемая в микобактериальных клетках в результате мутаций, является очень высокой по сравнению с Е. coli, поэтому лекарственные средства, способные уничтожать такие мутанты LomR, крайне необходимы и ценны. Весьма интересным является тот факт, что указанные мутанты устойчивы также к воздействию антибиотиков второго поколения, таких как ципрофлоксацин. Указанные мутанты испытывают на чувствительность к тимолу, соединению по данному изобретению, который, как видно из таблицы 1, эффективно уничтожает устойчивые к нескольким лекарственным средствам клетки Mycobacterium smegmatis, что подтверждает возможность использования тимола в качестве травяного антибиотика четвертого/нового поколения.
| Таблица 7 | |||
| Анализ методом диффузии в дисках для определения активности тимола против устойчивых к ломфлоксацину мутантов Mycobacterium smegmatis | |||
| Мутантные (LomR) штаммы Mycobacterium smegmatis | Ломфлоксацин | Тимол (зоны торможения роста в мм) | |
| 200 мкг/диск | 100 мкг/диск | 150 мкг/диск | |
| MSL 101 | - | 1 | 3 |
| MSL 102 | - | 1 | 3 |
| MSL 103 | - | 1 | 3 |
| MSL 104 | - | 1 | 3 |
| MSL 105 | - | 1 | 3 |
| MSL 106 | - | Tr | 3 |
| MSL 107 | - | 1 | 3 |
| MSL 108 | - | 1 | 3 |
| MSL 109 | - | 1 | 2,5 |
| MSL 110 | - | 1 | 3 |
| MSL 111 | - | 1 | 3 |
| MSL 112 | - | 1 | 3 |
| MC (WT) | - | 1 | 3 |
| Tr = Следовая активность (<0,5 мм); - = Отсутствие активности; WT = дикий штамм |
Пример 8
Активность тимола против бактериальных мутантов, устойчивых к изониазиду, другому новому противотуберкулезному лекарственному средству
| Таблица 8 | |
| Чувствительность к тимолу устойчивых к изониазиду мутантных клеток Escherichia coli | |
| Штаммы Е. coli | Тимол (зоны торможения роста в мм) 100 мкг/диск |
| СА8000 | 6 |
| САО3 | 2 |
| САО3 (ревертант) | 8 |
Изониазид является еще одним лекарственным средством, широко используемым для лечения туберкулеза, так как бактерии чувствительны к воздействию данного лекарственного средства из-за отсутствия системы oxyR. Дикий штамм Е. coli устойчив к концентрации данного антибиотика (1000 мкг/мл). Указанный штамм подвергают мутагенезу при помощи N’,N-метилнитрозогуанидина с целью получения чувствительного штамма, который поддается уничтожению при концентрации 250 мкг/мл в бульоне (САО3). Кроме того, в чувствительной мутантной культуре обнаружена спонтанная мутация, устойчивая к изониазиду в концентрации 1000 мкг/мл. Указанные культуры испытывают на чувствительность к тимолу при концентрации 100 мкг/диск, выполняя анализ методом диффузии в дисках, результаты которого показывают, что наиболее чувствительным к тимолу является устойчивый к изониазиду ревертантный штамм (САО3 ревертант).
Пример 9
Активность тимола против мутантов, устойчивых к бромиду этидия (устойчивых к нескольким лекарственным средствам)
| Таблица 9 | |
| Штаммы Mycobacterium amegmetis | Тимол (100 мкг/диск) |
| Дикий штамм | 8 мм |
| Штамм, устойчивый к бромиду этидия | 11 мм |
Мутант Mycobacterium smegmetis получают путем последовательного обогащения нормально чувствительных диких штаммов до достижения концентрации бромида этидия в бульоне, равной 12 мкг/мл. Данный мутант хорошо растет при указанной концентрации бромида этидия, в то время как дикий штамм уничтожается при концентрации бромида этидия в бульоне, равной 3 мкг/мл. Кроме того, установлено, что данный устойчивый к бромиду этидия штамм также устойчив к нескольким другим лекарственным средствам (mdr), в частности к таким антибиотикам, как хлорамфеникол (20 мкг/мл), тетрациклин (10 мкг/мл) и рифампицин (40 мкг/мл).
Пример 10
Активность тимола, соединения по настоящему изобретению, при различных значениях рН в отношении штамма Escherichia coli СА8000
| Таблица 10 | ||||
| Концентрация | рН (зона торможения роста в мм) | |||
| 4,00 | 7,00 | 9,00 | 1М NaOH | |
| 12,5 мкг/диск | - | - | - | - |
| 25 мкг/диск | следы | 1,00 | - | - |
| 50 мкг/диск | 2,00 | 2,00 | 1,00 | 1,00 |
| 100 мкг/диск | 4,00 | 6,00 | 3,00 | 2,00 |
Из приведенной выше таблицы следует, что активность соединения по настоящему изобретению является максимальной при нейтральном показателе рН (7,00).
Пример 11
Получение тимолсодержащей синергичной антибактериальной композиции против устойчивых к нескольким лекарственным средствам бактерий
На основании выполненных исследований установлено, что тимол является сильнодействующим бактерицидным средством против устойчивых к нескольким лекарственным средствам бактерий. Кроме того, установлено, что действие указанного средства усиливается при объединении масел, выделенных из различных видов мяты Mentha arvensis и Mentha spicata. Данная комбинация масел содержит лимонен (6,8-23,2%), ментол (0,66-2,45%), карвон (64,0-76,1%) и неидентифицированные фракции в эфирных маслах, дополняющие до 100% на разных стадиях роста. При использовании указанной комбинации масел с тимолом в концентрации 0,1% антибактериальная активность тимола увеличивается на 45%. Помимо этого, указанное масло сообщает композиции приятный аромат карвона с привкусом ментола. С учетом изложенного выше получены разные композиции, описанные ниже.
| Таблица 11 | ||||
| Анализ методом диффузии в дисках для определения синергичного действия тимола с налидиксовой кислотой против клеток Е. coli | ||||
| Концентрация налидиксовой кислоты (мкг/диск) | Зона торможения роста (в мм) диска, содержащего | Концентрация тимола (мкг/диск) | ||
| Налидиксовая кислота | Комбинация (налидиксовая кислота + тимол) | Тимол | ||
| 0,25 | 3 | 4 | Tr | 12,5 |
| 0,50 | 6 | 12 | 2 | 25,0 |
| 1,00 | 9 | 10 | 3 | 50,0 |
| 1,50 | 11 | 10 | 5 | 75,0 |
| 2,00 | 12 | 10 | 6 | 100,0 |
| Tr = Следовая активность (<0,5 мм); WT = дикий штамм |
| Таблица 12 | ||||
| Анализ методом диффузии в дисках для определения синергичного действия тимола с маслом гибрида Mentha против клеток Е. Coli | ||||
| Масло гибрида Mentha (мкг/диск) | Зона торможения роста (в мм) диска, содержащего | Концентрация тимола (мкг/диск) | ||
| Масло гибрида Mentha | Комбинация (масло + тимол) | Тимол | ||
| 50 | 0 | 1,0 | 3,0 | 50 |
| 5 | 0 | 5,0 | 3,0 | 50 |
| 0,5 | 0 | 2,5 | 3,0 | 50 |
| Tr = Следовая активность (<0,5 мм); WT = дикий штамм |
Композиция 1
1. Тимол 100-500 мг (20-50%, маc.маc.)
2. Эфирное масло из гибрида 0,1-0,5 мг
3. Лимонная кислота 2-10 мг
4. Карбонат кальция 100-200 мг
5. Гель гидроксида магния 50-100 мг
6. Лактоза 200-600 мг
7. Общая масса 500-1000 мг
Ингредиенты тщательно смешивают, измельчают в порошок и упаковывают в желатиновые капсулы, которые можно приобрести коммерческим путем.
Композиция 2
Эфирное масло разводят в 0-10 раз.
1. Тимол 50-300 мг (10-60%) в комбинации эфирных масел.
Данным препаратом пропитывают 250 мг шарики лактозы.
Композиция 3
Мед разводят в 0-10 раз стерильной дистиллированной водой и добавляют следующие ингредиенты:
1. Тимол 50-300 мг (10-60%)
2. Комбинация эфирных масел из различных видов мяты (0,1-1,0%)
Композиция 4
1. Тимол 100-500 мг
2. Лимонная кислота 2-10 мг
Два указанных компонента растворяют в 5 мл 0,05 М раствора натриевого буфера (рН 7,0), содержащего 200 мг глутамата натрия.
1. Композиция, предназначенная для лечения устойчивых к лекарственным средствам бактериальных инфекций, содержащая тимол, полученный из растения Trachyspermum ammi, в количестве 100-500 мг и мятное масло в количестве 0,1-0,5 мг, по существу содержащее лимонен в интервале примерно 6 - 25%, ментол в интервале примерно 0,50 - 2,50%, карвон в интервале примерно 64 - 76%, которое получают из гибрида Mentha spicata и Mentha arvensis, и обычные добавки.
2. Композиция по п.1, в которой добавки выбирают из группы, включающей лимонную кислоту в количестве примерно 2-10 мг, карбонат кальция в количестве примерно 100-200 мг, гель гидроксида магния в количестве примерно 50-100 мг, лактозу в количестве примерно 200-600 мг, мед в количестве примерно от 0,1 до 1%, глутамат натрия в количестве примерно 200 мг и натриевый буфер.
3. Композиция по п.1, в которой мятное масло, при необходимости, разводят до 10 раз.
4. Композиция по п.2, в которой мед необязательно разводят до 10 раз.
5. Способ получения композиции по п.1, предназначенной для лечения устойчивых к лекарственным средствам бактериальных инфекций, предусматривающий смешивание тимола, полученного из растения Trachyspermum ammi, в количестве 100-500 мг, мятного масла в количестве 0,1-0,5 мг, по существу содержащего лимонен в интервале примерно 6 - 25%, ментол в интервале примерно 0,50 - 2,50% и карвон в интервале примерно 64 - 76%, которое получают из гибрида Mentha spicata и Mentha arvensis, и обычных добавок.
6. Способ по п.5, в котором добавки выбирают из группы, включающей лимонную кислоту в количестве примерно 2-10 мг, карбонат кальция в количестве примерно 100-200 мг, гель гидроксида магния в количестве примерно 50-100 мг, лактозу в количестве примерно 200-600 мг, мед в количестве примерно 0,1 - 1%, глутамат натрия в количестве примерно 200 мг и натриевый буфер.
7. Способ по п.5, в котором мятное масло разводят до 10 раз.
8. Способ по п.6, в котором мед необязательно разводят до 10 раз.
9. Способ по п.5, в котором тимол и мятное масло диспергируют в 0,1-1% меда с получением сиропа.
10. Способ по п.5, в котором тимол и мятное масло смешивают с лимонной кислотой в количестве 2-10 мг и растворяют в буфере, содержащем глутамат натрия для получения раствора для инъекции.
11. Способ по п.5, в котором указанная композиция является эффективной против группы бактерий, выбираемых из рода Mycobacterium или Escherichia.
12. Способ по п.5, в котором указанная композиция является эффективной против бактерий, устойчивых к лекарственным средствам, выбираемым из группы, включающей бромид этидия, изониазид, хлорамфеникол, тетрациклин, рифампицин, налидиксовую кислоту, оксолиновую кислоту, спарфлоксицин, ципрофлоксицин и ломфлоксицин.
13. Способ лечения устойчивых к лекарственным средствам бактериальных инфекций, предусматривающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества композиции по п.1.
14. Способ по п.13, в котором композицию по п.1 вводят пероральным или подкожным способом.
15. Способ по п.13, в котором указанную композицию растворяют в 5 мл 0,05 М раствора натриевого буфера (рН 7,0), содержащего 200 мг глутамата натрия, для введения в виде подкожной инъекции.
16. Способ по п.13, в котором указанная композиция является эффективной против бактериальных инфекций, таких, как кишечные и системные инфекции.
17. Способ по п.13, в котором лечение включает введение композиции против бактериальных инфекций, вызываемых бактериями, устойчивыми к лекарственным средствам, выбираемым из группы, включающей бромид этидия, изониазид, хлорамфеникол, тетрациклин, рифампицин, налидиксовую кислоту, оксолиновую кислоту, спарфлоксицин, ципрофлоксицин и ломфлоксицин.
18. Способ по п.13, в котором устойчивые ко многим лекарственным средствам бактерии относятся к роду Mycobacterium или Escherichia.
19. Композиция по п.1, предназначенная для уничтожения устойчивых к нескольким лекарственным средствам бактерий, выбранных из бактерий, устойчивых к бромиду этидия, изониазиду, хлорамфениколу, тетрациклину, рифампицину, налидиксовой кислоте, оксолиновой кислоте, спарфлоксицину, ципрофлоксицину или ломфлоксицину, и таким образом для эффективного лечения бактериальных инфекций при введении соответствующей дозы.
