Способ приготовления готовой лекарственной формы инсулина пролонгированного действия

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и может быть использовано в производстве высококачественных готовых лекарственных форм инсулинов пролонгированного действия. Способ характеризуется тем, что включает получение эфира инсулина человека транспептидацией свиного инсулина при молярном избытке ди-трет-бутилового эфира треонина в водно- органической среде в присутствии трипсина, ингибирование реакции закислением, хроматографическую очистку полученного эфира инсулина человека, снятие защитных групп трифторуксусной кислотой и очистку полученного сырого инсулина человека, его последующее растворение в разбавленной кислоте, добавление кислых растворов ионов цинка и протаминсульфата, смешивание с забуференными растворами м-крезола, фенола и глицерина и выдерживание растворов до образования кристаллов, при этом получение эфира инсулина человека проводят при весовом соотношении трипсина и свиного инсулина, равном 1:300-1000, перед закислением реакционной среды осуществляют дополнительное ингибирование реакции разбавлением реакционной смеси водой в 2-3 раза, а очистку эфира инсулина человека осуществляют путем проведения ВЭЖХ с последующим осаждением фракций эфирной производной в присутствии ионов цинка, снятием защитных групп и получением кристаллов сырого инсулина человека, который очищают повторным проведением ВЭЖХ, причем оба процесса очистки проводят с использованием в качестве неподвижной фазы сорбента DIASOGEL ODS (С 18) с размером частиц от 15 мкм и размером пор 120 А, а в качестве подвижной фазы на первом этапе используют 0,06 М-глицин HCL буфер, содержащий 0,015 М аммония сульфат и пропанол-2 с концентрацией от 20 до 35% и рН 2,5, а на втором - 0,05 М ацетатный буфер с содержанием пропанола-2 от 10 до 20% при рН 2,5, затем очищенные кристаллы инсулина человека поэтапно растворяют в разбавленной кислоте, причем сначала получают мелкодисперсную суспензию кристаллов инсулина в воде, а потом к ней добавляют разбавленную кислоту и смесь, полученную после смешивания с забуференными растворами м-крезола, фенола и глицерина, выдерживают при температуре 18-21°С в течение 20-22 часов. Технический результат - создание эффективного, экономического способа приготовления готовой лекарственной формы высокочистого препарата инсулина пролонгированного действия с низкими иммунологическими свойствами, который позволяет увеличить выход инсулина в процессе производства.

 

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и может быть использовано в производстве высококачественных готовых лекарственных форм (ГЛФ) инсулинов пролонгированного действия.

Известен способ получения фармацевтического препарата свиного инсулина, который включает водно-спиртовую экстракцию поджелудочной железы животных, очистку полученного экстракта от балластных белков, приготовление концентрированного раствора инсулина в присутствии натрия хлорида, натрия ацетата, соответствующего количества ионов цинка и затравки, с последующим разбавлением этой смеси в 10 раз (Schlichtkrull J. (1956 b) Insulin Crystals IV. The preparation of nuclei, seeds and monodisperse insulin crystal suspensions. Fcta Chem Scand 11:299-302).

Полученная таким образом готовая лекарственная форма инсулина содержит большое количество примесей, которые вызывают нежелательные аллергические реакции и осложнения. Кроме того, для такого способа характерны значительные потери инсулина в процессе производства.

Известен также “Способ получения полусинтетического инсулина человека” (патент США №4400465 от 1983 года), в котором эфир инсулина человека получают в две стадии: на первой стадии с помощью карбоксипептидазы А от свиного инсулина отщепляют аланин в позиции В30, а на второй трипсин пришивает эфир треонина. Реакция проводится при молярном избытке производной треонина по отношению к дезаланининсулину от 5:1 до 1000:1, в присутствии трипсина или трипсиноподобного фермента. Полученный эфир инсулина очищают хроматографией низкого давления, снимают защитные группы и осаждают человеческий инсулин, который затем для получения ГЛФ пролонгированного действия растворяют в разбавленной кислоте, смешивают с необходимыми добавками и выдерживают раствор до образования кристаллов. Но, как известно, такое двухстадийное получение эфирной производной инсулина приводит к увеличению количества примесей и к снижению выхода эфира инсулина человека по сравнению с реакцией транспептидации (патент США №4343898, стр.9, 1982 год), а, значит, не позволяет получить хороший выход продукта с улучшенными характеристиками.

Наиболее близким к заявляемому способу является способ, описанный в патенте США №4601852 А, опубликованном в 1986 году, в котором рассматривается способ приготовления препаратов инсулина, при котором получают эфир инсулина человека транспептидацией свиного инсулина при молярном избытке ди-трет-бутилового эфира треонина в водно-органической среде в присутствии трипсина. Молярный избыток эфира треонина по отношению к инсулину заявляется 10:100 кратным. Весовое соотношение свиного инсулина и трипсина равняется 1:1-100. Затем ингибируют реакцию закислением реакционной среды, выделяют эфир инсулина человека, проводят его хроматографическую очистку низкого давления (гель-фильтрацией), выделяют очищенный эфир инсулина концентрированием и осаждением, снимают защитные группы известным способом (например, трифторуксуной кислотой) и выделяют сырой инсулин человека, который растворяют в разбавленной кислоте, добавляют кислые растворы ионов цинка и протаминсульфата, смешивают с забуференными растворами м-крезола, фенола и глицерина и выдерживают полученную смесь до образования суспензии кристаллов ГЛФ инсулина пролонгированного действия. Этот способ позволяет увеличить выход эфира инсулина человека, который определяет выход инсулина человека в процессе производства, до 60% (а при определенных условиях даже до 90%) и существенно снизить количество примесей (до 7%).

Но недостатками этого способа все еще остаются довольно высокие иммунологические свойства препарата и значительные потери инсулина в процессе производства.

Задачей изобретения является создание эффективного, экономичного способа приготовления готовой лекарственной формы инсулина пролонгированного действия с низкими иммунологическими свойствами, который гарантирует увеличение выхода инсулина в процессе производства.

Поставленная задача решается тем, что в способе приготовления готовой лекарственной формы инсулина пролонгированного действия, включающем получение эфира инсулина человека транспептидацией свиного инсулина при молярном избытке ди-трет-бутилового эфира треонина в водно-органической среде в присутствии трипсина, ингибирование реакции закислением, хроматографическую очистку полученного эфира инсулина человека, снятие защитных групп трифторуксусной кислотой и очистку полученного сырого инсулина человека, его последующее растворение в разбавленной кислоте, добавление кислых растворов ионов цинка и протаминсульфата, смешивание с забуференными растворами м-крезола, фенола и глицерина, выдерживание растворов до образования кристаллов, согласно изобретению получение эфира инсулина человека проводят при весовом соотношении трипсина и свиного инсулина, равном 1:300-1000, перед закислением реакционной среды осуществляют дополнительное ингибирование реакции разбавлением реакционной смеси водой в 2-3 раза, а очистку эфира инсулина человека осуществляют путем проведения ВЭЖХ с последующим осаждением фракций эфирной производной в присутствии ионов цинка, снятием защитных групп и получением кристаллов сырого инсулина человека, которые очищают повторным проведением ВЭЖХ, причем оба процесса очистки проводят с использованием в качестве неподвижной фазы сорбента обращенно-фазового типа, например DAISOGEL ODS (C18), с размером частиц от 15 мкм и размером пор 120 Å, а в качестве подвижной фазы на первом этапе используют 0,06 М-глицин НСl буфер, содержащий 0,015 М аммония сульфат и пропанол-2 с концентрацией от 20 до 35% при рН 2,5, а на втором - 0,05 М ацетатный буфер с содержанием пропанола-2 от 10 до 20% при рН 2,5, затем очищенные кристаллы инсулина человека поэтапно растворяют в разбавленной кислоте, причем сначала получают мелкодисперсную суспензию кристаллов инсулина в воде, а потом к ней добавляют разбавленную кислоту, и смесь, полученную после смешивания с забуференными растворами м-крезола, фенола и глицерина, выдерживают при температуре 18-21°С в течение 20-22 часов.

Сопутствующими родственными примесями свиного инсулина являются свиной проинсулин и продукты модификации и деградации свиного инсулина.

Водно-органическая среда представляет собой воду со смесью апротонных (например, диметилацетамид) и протонных (например, 1,2 этандиол, 1,4 бутандиол, 1,5 пентадиол) растворителей.

Трипсин в представленном техническом решении может быть свиным или бычьим.

В реакции транспептидации может использоваться ди-трет-бутиловый эфир треонина или его соль.

Дополнительное ингибирование реакции транспептидации разбавлением реакционной смеси водой в 2-3 раза перед закислением позволяет непосредственно наносить разбавленную смесь на колонку системы высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), что устраняет необходимость выполнения ряда технологических операций, которые описаны в прототипе: то есть осаждения реакционной смеси, отделения осадка центрифугированием, растворения осадка. Кроме того, использование системы ВЭЖХ позволяет эффективно очистить эфир инсулина человека от свиного инсулина, который не прореагировал, и от примесей-спутников реакции транспептидации.

Заключительная очистка на первой стадии процесса приготовления ГЛФ кристаллов инсулина человека, которые получаются после снятия защитных групп известным способом трифторуксусной кислотой и прямой кристаллизации, также проводится на колонке системы высокоэффективной жидкостной хроматографии и позволяет достичь еще лучших результатов.

В качестве неподвижной фазы заявитель использует сорбент обращение-фазового типа, например DAISOGEL ODS (C18), с размером частиц от 15 мкм и размером пор 120 Å, а в качестве подвижной фазы на первом этапе используют 0,06 М-глицин НСl буфер, содержащий 0,015 М аммония сульфат и пропанол-2 с концентрацией от 20 до 35% при рН 2,5, а на втором - 0,05 М ацетатный буфер с содержанием пропанола-2 от 10 до 20% при рН 2,5.

Условия реакции транспептидации, в частности, заявляемое фермент-субстратное соотношение, равное 1:300-1000, позволяет увеличить степень конверсии свиного инсулина или выход эфира инсулина человека, который характеризует выход конечного продукта, до 98% и уменьшить количество трудноудаляемых примесей до 1,5%. На повышение степени устранения примесей направлена и дополнительная очистка полученных кристаллов инсулина человека - до 0,9%.

На второй стадии приготовления ГЛФ инсулина человека пролонгированного действия полученные кристаллы инсулина человека растворяют в разбавленной кислоте поэтапно: сначала их суспендируют в воде и хорошо перемешивают до получения мелкодисперсной суспензии, а потом добавляют к ней 1 М НСl. Приготовление мелкодисперсной суспензии на первом этапе, то есть обеспечение такого состояния, когда каждая отдельная мелкая частичка инсулина оказывается со всех сторон окруженной водой, создает условия для их быстрого растворения в разбавленной кислоте на втором этапе. Таким образом, время контакта кристаллов инсулина с кислотой уменьшается, что, в соответствии с исследованиями авторов, приводит к уменьшению количества образующегося А21-дезамида инсулина и, следовательно, к увеличению чистоты препарата. Потом добавляют кислые растворы ионов цинка и протаминсульфата, смешивают с забуференными растворами, которые содержат м-крезол, фенол и глицерин. Полученный раствор выдерживают при температуре 18-21°С в течение 20-22 часов. Такой режим выращивания кристаллов позволяет получить кристаллическую суспензию с более однородными по размеру кристаллами тетрагональной формы длиной от 1 до 25 мкм, что обеспечивает более равномерное освобождение инсулина в организме человека (в Европейской фармакопее 2002 г., 4-е издание, стр.1374, длина кристаллов допускается от 1 до 60 мкм).

Решение поставленной задачи иллюстрируется примерами конкретного выполнения.

Пример 1.

6 г сырого свиного инсулина суспендировали в 24 мл воды, добавили 3,0 мл уксусной кислоты, 180 мл 0,7 М ди-трет-бутилового эфира треонина в смеси диметилацетамида и 1,4 бутандиола, 19 мг трипсина в 12 мл 0,05 М кальция ацетата, реакционную смесь перемешивали в течение 16 часов при температуре 23°С. Реакцию ингибировали разбавлением водой в 2 раза по отношению к объему реакционной смеси и рН смеси довели до 2,5 10% НСl. Разбавленную реакционную смесь профильтровали через фильтр с размером пор 0,2 мкм для нанесения на колонку системы ВЭЖХ. В качестве неподвижной фазы использовали сорбент обращенно-фазового типа DAISOGEL ODS (С 18) с размером частиц 15 мкм и размером пор 120 Å. Для подвижной фазы использовали 0,06 М глицин-НСl буфер, который содержал 0,015 М аммония сульфата с концентрацией пропанола-2 от 20 до 35% при рН 2,5. Фракции эфирной производной осадили в присутствии ионов цинка при рН от 6,8 до 7,0, отцентрифугировали, полученный осадок промыли водой и высушили в вакуумном сушильном шкафу. 5,0 г полученного эфира инсулина человека растворили в 60 мл трифторуксусной кислоты, выдержали 40 минут при температуре 25°С, трифторуксусную кислоту отогнали на роторном испарителе при температуре не выше 30°С, полученный сырой инсулин человека растворили в воде и провели прямую цитратную кристаллизацию при рН 5,8.

Кристаллическую суспензию отфильтровали, кристаллы промыли водой, растворили в 0,25 М уксусной кислоте и нанесли на колонку системы ВЭЖХ. В качестве подвижной фазы использовали 0,05 М ацетатный буфер с содержанием пропанола-2 от 10 до 20% при рН 2,5. Фракцию инсулина человека кристаллизовали при рН 5,8, суспензию кристаллов отфильтровали, промыли водой и лиофильно высушили. Выход инсулина человека составил 4,5 г. Методом иммуноферментного анализа было установлено, что содержание свиного проинсулина в полученном инсулине человека было менее 1 мкг/г. Что касается остальных родственных примесей, то с помощью аналитической системы ВЭЖХ было установлено их содержание - 0,85%.

Полученный инсулин человека поместили в 320 мл воды, а затем перемешали до получения мелкодисперсной суспензии, добавили такое количество 1 М НСl, чтобы рН раствора было не ниже 3,1. 0,355 г протаминсульфата растворили в 58,4 мл воды, добавляя 1 М НСl до такого же рН. 0,0252 г цинка хлорида добавили в раствор протаминсульфата. Потом смешали все приготовленные кислые растворы. Дальше приготовили буферный раствор из 5,88 г натрия фосфорнокислого однозамещенного двухводного в 2,32 л воды, добавили 44,8 г глицерина, 5,25 г м-крезола и 2,1 г фенола, перемешали в течение 30 минут и рН смеси довели до 7,8. Потом буферный раствор подвергли стерилизующей фильтрации и профильтровали туда смесь кислых растворов, протаминсульфата, цинка хлорида и инсулина. Полученную смесь выдерживали, перемешивая, при температуре 20°С в течение 21 часа для получения кристаллической суспензии ГЛФ инсулина пролонгированного действия. Форму и размер полученных кристаллов определяли с помощью микроскопа при 400-кратном увеличении. Кристаллы имели тетрагональную форму и длину от 3 до 21 мкм. Исследования ГЛФ инсулина пролонгированного действия с помощью аналитической системы ВЭЖХ показали, что фармацевтический препарат имеет активность 40 МЕ/мл, содержит высокомолекулярных соединений 0,4%, сопутствующих родственных примесей 0,8%, А21-дезамида инсулина 0,4% и имеет активность супернатанта 0,3 МЕ/мл.

Пример 2.

Условия получения кристаллов инсулина человека и проведения других операций по приготовлению ГЛФ инсулина пролонгированного действия, как в примере 1, за исключением того, что на первой стадии процесса добавили 30 мг трипсина в 12 мл 0,05 М кальция ацетата, а реакцию проводили в течение 10 часов при температуре 23°С. Выход инсулина человека составил 3,36 г, а по данным ВЭЖХ количество сопутствующих родственных примесей в нем составляло 4,2%. Исследования готовой лекарственной формы инсулина пролонгированного действия по примеру 2 с помощью ВЭЖХ показали, что активность фармацевтического препарата составляла 39,2 МЕ/мл, содержание высокомолекулярных соединений 0,7%, родственных сопутствующих примесей 4,1%, А21-дезамида инсулина 2,0%, активность супернатанта 0,4 МЕ/мл. Длина кристаллов составляла 2-23 мкм.

Пример 3.

Условия получения кристаллов инсулина человека и проведения других операций по приготовлению готовой лекарственной формы инсулина пролонгированного действия, как в примере 1, за исключением того, что на первой стадии процесса добавили 4,8 мг трипсина в 12 мл 0,05 М кальция ацетата, а реакционную смесь перемешивали в течение 20 часов при температуре 20°С. Выход инсулина человека составил 3,0 г. Исследования фармацевтического препарата по примеру 3 показали, что его активность составляла 38,5 МЕ/мл, содержание высокомолекулярных соединений 0,8%, родственных сопутствующих примесей 1,8%, А21-дезамида инсулина 0,8%, активность супернатанта 0,5 МЕ/мл. Длина кристаллов составляла 2-25 мкм.

Пример 4.

Условия получения кристаллов инсулина человека и проведения других операций по приготовлению готовой лекарственной формы инсулина пролонгированного действия, как в примере 1, за исключением того, что на первой стадии процесса добавили 180 мл 0,51 М ди-трет-бутилового эфира треонина в смеси диметилацетамида и 1,5 пентадиола, а для очистки эфира инсулина человека и кристаллов инсулина человека использовали

сорбент DAISOGEL ODS (С 18) с размером частиц 15 мкм и размером пор 200 Å. Иммуноферментный анализ полученного очищенного инсулина человека показал содержание в нем свиного проинсулина менее 1 мкг/г, содержание родственных примесей, определенное методом ВЭЖХ, 1,65%. Исследования ГЛФ инсулина пролонгированного действия показали, что его активность составляла 39,3 МЕ/мл, содержание высокомолекулярных соединений 0,5%, родственных сопутствующих примесей 1,8%, А21-дезамида инсулина 0,9%, а активность супернатанта 0,35 МЕ/мл. Длина кристаллов составляла 1-26 мкм.

Пример 5.

Условия получения кристаллов инсулина человека и проведения других операций по приготовлению готовой лекарственной формы инсулина пролонгированного действия, как в примере 4, за исключением того, что использовали сорбент DAISOGEL ODS (С 18) с размером частиц от 40 до 60 мкм и размером пор 120 Å. Иммуноферментный анализ полученного очищенного инсулина человека показал содержание в нем свиного проинсулина 2,1 мкг/г, а содержание родственных примесей 3,75% (метод ВЭЖХ). Исследования ГЛФ инсулина пролонгированного действия показали, что его активность составляла 39,0 МЕ/мл, содержание высокомолекулярных соединений 0,6%, родственных сопутствующих примесей 4,1%, А21-дезамида инсулина 1,9%, а активность супернатанта 0,35 МЕ/мл. Длина кристаллов составляла 2-28 мкм.

Пример 6.

Условия проведения операций по приготовлению готовой лекарственной формы инсулина пролонгированного действия, как в примере 1, но в качестве подвижной фазы при очистке эфира инсулина человека использовали 0,1 М глицин-НСl, который содержал 0,1 М аммоний сульфат и пропанол-2 с концентрацией от 20 до 35% при рН 2,5. Содержание свиного проинсулина в полученном инсулине человека составило менее 1 мкг/г (иммуноферментный анализ), а содержание родственных примесей 1,75% (метод ВЭЖХ). Характеристики ГЛФ инсулина пролонгированного действия были следующими: активность составляла 39,2 МЕ/мл, содержание высокомолекулярных соединений 0,5%, родственных сопутствующих примесей 2,1%, А21-дезамида инсулина 1,7%, а активность супернатанта 0,39 МЕ/мл. Длина кристаллов составляла 2-36 мкм.

Пример 7.

Условия проведения операций по приготовлению готовой лекарственной формы инсулина пролонгированного действия, как в примере 1, но в качестве подвижной фазы при очистке полученных кристаллов инсулина человека использовали 0,1 М ацетатный буфер, который содержал пропанол-2 с концентрацией от 10 до 20% при рН 2,5.

Содержание свиного проинсулина в полученном инсулине человека составило 2,2 мкг/г (иммуноферментный анализ), а содержание родственных примесей 2,85% (метод ВЭЖХ). Характеристики ГЛФ инсулина пролонгированного действия были следующими: активность составляла 38,9 МЕ/мл, содержание высокомолекулярных соединений 0,7%, родственных сопутствующих примесей 3,1%, А21-дезамида инсулина 1,5%, а активность супернатанта 0,37 МЕ/мл. Длина кристаллов составляла 2-34 мкм.

Пример 8.

Условия проведения операций по приготовлению готовой лекарственной формы инсулина пролонгированного действия, как в примере 1, за исключением того, что раствор, полученный после смешивания с забуференными растворами м-крезола, фенола и глицерина, выдерживали при температуре 14°С. Исследования фармацевтического препарата инсулина пролонгированного действия по примеру 8 показали, что его активность, содержание высокомолекулярных соединений, родственных сопутствующих примесей, А21-дезамида инсулина, активность супернатанта были на уровне, описанном примере 1, но в пределах ошибки определения. Однако при этом 95% кристаллов имели длину от 1 до 55 мкм.

Пример 9.

Условия проведения операций по приготовлению готовой лекарственной формы инсулина пролонгированного действия, как в примере 1, за исключением того, что раствор, полученный после смешивания с забуференными растворами м-крезола, фенола и глицерина, выдерживали при температуре 25°С. Исследования фармацевтического препарата инсулина пролонгированного действия по примеру 9 показали, что его активность, содержание высокомолекулярных соединений, родственных сопутствующих примесей, А21-дезамида инсулина были на уровне, описанном примере 1, но в пределах ошибки определения. При этом кристаллы имели длину от 1 до 55 мкм и активность супернатанта составляла 1,2 МЕ/мл, что свидетельствовало о неполном процессе кристаллизации

Пример 10.

Условия проведения операций по приготовлению готовой лекарственной формы инсулина пролонгированного действия, как в примере 1, за исключением того, что раствор, полученный после смешивания с забуференными растворами м-крезола, фенола и глицерина выдерживали в течение 17 часов. Исследования фармацевтического препарата инсулина пролонгированного действия по примеру 10 показали, что его активность, содержание высокомолекулярных соединений, родственных сопутствующих примесей, А21-дезамида инсулина и активность супернатанта были на уровне, описанном в примере 1, но в пределах ошибки определения. Количество кристаллов с длиной от 1 до 25 мкм составляло только 55%.

Пример 11.

Условия проведения операций по приготовлению готовой лекарственной формы инсулина пролонгированного действия, как в примере 1, за исключением того, что раствор, полученный после смешивания с забуференными растворами м-крезола, фенола и глицерина, выдерживали в течение 25 часов. Исследования фармацевтического препарата инсулина пролонгированного действия по примеру 11 показали, что его активность, содержание высокомолекулярных соединений, родственных сопутствующих примесей, А21-дезамида инсулина и активность супернатанта были на уровне, описанном в примере 1, но в пределах ошибки определения. Количество кристаллов с длиной от 1 до 25 мкм составляло 95%. Такой же результат получают, выдерживая раствор 22 часа, то есть здесь процесс приготовления готовой лекарственной формы инсулина просто необоснованно затягивается.

Таким образом, как показывает сравнение примера 1 с другими примерами, несоблюдение заявляемых пределов фермент-субстратного соотношения (примеры 2 и 3) приводит к увеличению содержания примесей в препаратах и к увеличению потерь инсулина в процессе производства, изменение заявляемых параметров системы ВЭЖХ (примеры 4-7) к увеличению содержания сопутствующих примесей, а значит, к увеличению иммуногенности препаратов, несоблюдение заявляемых пределов режима выращивания кристаллов (примеры 8-11) приводит либо к необоснованному затягиванию процесса производственного процесса, то есть к снижению его эффективности, либо не позволяет получать кристаллы с меньшим разбросом по длине, что снижает качество ГЛФ инсулина. В то же время, как свидетельствует пример 1, соблюдение заявляемой технологии позволяет получить экономичным и эффективным способом качественную готовую лекарственную форму инсулина пролонгированного действия с пониженньми иммунологическими свойствами.

Способ приготовления готовой лекарственной формы инсулина пролонгированного действия, включающий получение эфира инсулина человека транспептидацией свиного инсулина при молярном избытке ди-трет-бутилового эфира треонина в водно-органической среде в присутствии трипсина, ингибирование реакции закислением, хроматографическую очистку полученного эфира инсулина человека, снятие защитных групп трифторуксусной кислотой и очистку полученного сырого инсулина человека, его последующее растворение в разбавленной кислоте, добавление кислых растворов ионов цинка и протаминсульфата, смешивание с забуференными растворами м-крезола, фенола и глицерина и выдерживание растворов до образования кристаллов, отличающийся тем, что получение эфира инсулина человека проводят при весовом соотношении трипсина и свиного инсулина, равном 1:300-1000, перед закислением реакционной среды осуществляют дополнительное ингибирование реакции разбавлением реакционной смеси водой в 2-3 раза, а очистку эфира инсулина человека осуществляют путем проведения ВЭЖХ с последующим осаждением фракций эфирной производной в присутствии ионов цинка, снятием защитных групп и получением кристаллов сырого инсулина человека, который очищают повторным проведением ВЭЖХ, причем оба процесса очистки проводят с использованием в качестве неподвижной фазы сорбента DIASOGEL ODS (С 18) с размером частиц от 15 мкм и размером пор 120 Å, а в качестве подвижной фазы на первом этапе используют 0, 06 М-глицин HCL буфер, содержащий 0,015 М аммония сульфат и пропанол-2 с концентрацией 20-35% и рН 2,5, а на втором - 0,05 М ацетатный буфер с содержанием пропанола-2 10-20% при рН 2,5, затем очищенные кристаллы инсулина человека поэтапно растворяют в разбавленной кислоте, причем сначала получают мелкодисперсную суспензию кристаллов инсулина в воде, а потом к ней добавляют разбавленную кислоту и смесь, полученную после смешивания с забуференными растворами м-крезола, фенола и глицерина, выдерживают при температуре 18-21°С в течение 20-22 ч.