Способ отбора животных по признакам, наследуемым по механизму родительского импринтинга

Изобретение относится к области биотехнологии. Способ предусматривает анализ образца генетического материала, взятого от свиньи, на присутствие локуса количественных признаков (QTL), локализованного в хромосоме 2 Sus scrofa, в положении 2р1.7, как было установлено при картировании. Отбирают свиней, имеющих нужные генотипические свойства. Способ позволяет повысить эффективность селекции. 3 с. и 19 з.п. ф-лы, 10 ил., 2 табл.

 

Настоящее изобретение относится к способам отбора племенных животных или животных, предназначенных для убоя, на нужные генотипические или возможные фенотипические свойства, в частности ассоциированные с мышечной массой и/или отложением жира. До настоящего времени схемы разведения домашних животных были направлены на продуктивные признаки и качество туши. Это приводило к значительному улучшению таких признаков, как репродуктивность, молочная продуктивность, соотношение мяса/жира, плодовитость, интенсивность роста и эффективность использования кормов. Данные относительно простых тестов на продуктивность дают основу для указанных улучшений поголовья животных и предполагается, что на отобранные признаки влияет большое число генов, каждый из которых оказывает небольшое действие (бесконечно малая генная модель). В этой области уже достигнуты значительные изменения. Во-первых, помимо "традиционных" продуктивных признаков цель селекционной работы некоторых организаций по разведению племенных животных направлена на признаки мясного качества. Во-вторых, имеются данные, что современные и новые признаки селекционного отбора могут иметь относительно значительные эффекты (известные как мажорные гены) в противоположность бесконечно малой модели, которая использовалась до настоящего времени.

Современные ДНК-технологии дают возможность использовать такие мажорные гены, и этот способ является весьма перспективным для улучшения мясного качества, особенно, если прямая оценка мясного качества не может быть практически осуществлена для потенциальных племенных животных. Указанная современная ДНК-технология может оказаться очень эффективной также для других признаков, таких как отношение мяса/жира, плодовитость, интенсивность роста и эффективность использования кормов. Кроме того, эти признаки не всегда легко определить у живых животных.

Данные для некоторых мажорных генов были первоначально получены с использованием сегрегационного анализа, то есть без какой-либо информации о ДНК-маркерах. Затем были осуществлены молекулярные исследования для определения локализации этих генов на генетической карте. На практике, и за исключением аллелей с очень большим эффектом, исследования ДНК необходимы для анализа генетической природы большинства экономически важных признаков. ДНК-маркеры могут быть использованы для определения локализации генов или аллелей, ответственных за качественные признаки, такие как масть животного, и они могут быть также использованы для детекции генов или аллелей со значительным влиянием на количественные признаки, такие как интенсивность роста, IMF и др. В данном случае этот метод называется картированием QTL (локус количественного признака), где QTL включает по крайней мере часть нуклеиновокислотного генома животного, в котором находится генетическая информация, способная оказывать влияние на указанный количественный признак (в указанном животном или в его потомстве). Информация на уровне ДНК может не только оказать помощь в фиксации специфичного мажорного гена в популяции, но может быть также использована для отбора количественного признака, по которому уже был проведен отбор. Помимо фенотипических данных, информация на молекулярном уровне может повысить точность селекции, а следовательно и селективный ответ.

Повышение качества мяса и качества туши относится не только к изменению уровней признаков, таких как нежность или "мраморность" мяса, но также и к повышению неоднородности. Существование мажорных генов дает прекрасную возможность для улучшения качества мяса, поскольку оно позволяет значительно продвинуться в нужном направлении. Во-вторых, оно дает возможность снизить изменчивость, поскольку позволяет авторам настоящего изобретения встраивать исследуемые гены в полученные ими продукты. Другой аспект заключается в отборе на мажорные гены, который позволяет осуществлять дифференциацию для конкретных рынков сбыта. Исследования проводились на некоторых видах животных, а в частности, на свиньях, овцах, оленях и крупном рогатом скоте.

В частности, интенсивный отбор на мясную продуктивность привел к получению животных с большой мышечной массой с нежирным мясом у некоторых видов крупного рогатого скота. В последние годы стало возможно картировать и клонировать некоторые гены, ответственные за эти фенотипы, что открыло путь к более эффективной селекции с помощью маркеров, к разработке лекарственнных средств для направленной доставки (повышающих качество продуктов) и к трансгенезу. Было показано, что мутации в рецепторе рианодина (Fuji et al., 1991; MacLennan & Phillips, 1993) и в миостатине (Grobet et al., 1997; Kambadur et al., 1997; McPherron & Lee, 1997) вызывают гипертрофию мышц у свиней и крупного рогатого скота, в то время как гены, оказывающие большое влияние на мышечную массу и/или отложение жира, были, например, картированы по хромосоме 4 свиньи (Andersson et al., 1994) и по хромосоме 18 овцы (Cocket et al., 1996).

Однако, несмотря на достигнутые успехи в идентификации QTL, эти данные в настоящее время имеют ограниченное использование в коммерческих селекционных программах. Многие специалисты в данной области пришли к выводу о необходимости идентификации конкретных генов, составляющих указанный QTL. Такая идентификация представляет собой главную задачу, поскольку QTL-область является относительно большой и может содержать множество генов. Идентификация исследуемых генов из множества генов, которые могут присутствовать в данном локусе, является довольно трудной для сельскохозяйственных животных.

Настоящее изобретение относится к способу отбора домашних животных на нужные генотипические или потенциальные фенотипические свойства, предусматривающему тестирование указанного животного на присутствие подвергнутого родительскому импринтингу локуса качественных или количественных признаков (QTL). В этом случае, термин "домашнее животное" определяют как животное, отобранное по нужным генотипическим или потенциальным фенотипическим свойствам, или животное, происходящее от животного, отобранного по этим признакам.

Домашние животные имеют большой ресурс генетической и фенотипической изменчивости, при этом традиционное одомашнивание предусматривает отбор животного или его потомства по наличию желательных генотипических или потенциальных фенотипических свойств. За последнее столетие этот способ отбора был усовершенствован благодаря все возрастающему пониманию и применению законов менделевского наследования признаков. Одной из главных проблем, связанных с разработкой программ по разведению домашних животных, является негативная генетическая корреляция между репродуктивной способностью и продуктивными признаками. Это наблюдается, например, у крупного рогатого скота (высокая молочная продуктивность обычно приводит к истощению коров и быков), у домашней птицы (бройлерная линия имеет низкий уровень яйценоскости, а несушки обычно имеют очень низкий прирост мышечной массы), у свиней (очень плодовитые свиноматки имеют, обычно, много жира и сравнительно мало мяса) или у овец (в высокой степени плодовитые породы имеют низкое качество туши и наоборот). Настоящее изобретение позволяет по знанию характера родительского импринтинга различных признаков осуществлять отбор, например, отцовских линий, гомозиготных по унаследованному в результате родительского импринтинга QTL, например, сцепленному с признаками продуктивности или роста мышечной массы; при этом отбор на указанные признаки может быть менее строгим для материнской линии в пользу качества репродукции. Феномен генетического или родительского импринтинга никогда не использовался для селекции домашних животных и, при осуществлении селекционных программ, использование этого нестабильного генетического средства никогда не считалось возможным. Настоящее изобретение относится к селекционной программе, где знание характера родительского импринтинга нужного признака, как продемонстрировано в настоящем описании, позволяет разработать программу, например программу BLUP, с использованием модифицированного животного-модели. Это позволяет повысить точность оценки племенной ценности и эффективность селекции по сравнению со стандартными селекционными программами. До настоящего времени, при оценке стандартной программы BLUP эффект родительского импринтинга какого-либо признака считался пренебрежимо малым; однако, использование и понимание наследственного характера нужного признака, как показано в настоящем изобретении, позволяет осуществлять селекцию на основе родительского импринтинга даже без тестирования ДНК. Так, например, отбор генов, характеризующихся родительским импринтингом, дает возможность повысить однородность потомства; то есть (конечный) родитель, гомозиготный по "хорошему или желательному" аллелю, будет передавать их всему потомству, несмотря на другие родительские аллели, и все это потомство будет экспрессировать желательные родительские аллели. Это будет приводить к получению более однородного потомства. Представляющие интерес или являющиеся предпочтительными аллели от материнской линии часто являются аллелями, которые дают противоположные эффекты по сравнению с аллелями отцовской линии. Так, например, у мясных животных, таких как свиньи, аллели, сцепленные с признаками мясного качества, такими как внутримышечный жир или мышечная масса, могут быть фиксированы по материнской линии, тогда как аллели, сцепленные с признаком пониженного хребтового жира, могут быть фиксированы по отцовской линии. Другими желательными комбинациями являются, например, плодовитость и/или удои молока по женской линии, наряду с интенсивностью роста и/или мышечной массой по мужским линиям.

В предпочтительном варианте своего осуществления настоящее изобретение относится к способу отбора домашнего животного так, чтобы оно имело желательные генотипические или потенциальные фенотипические свойства, где указанный способ предусматривает тестирование образца нуклеиновой кислоты, взятого от данного животного, на присутствие локуса количественного признака (QTL), экспрессированного в соответствии с родительским импринтингом. Образец нуклеиновой кислоты может быть, в основном, получен из различных частей тела животного методами, известными специалистам. Традиционными образцами для тестирования нуклеиновой кислоты являются пробы крови или образцы тканей, взятых с поверхности кожи или мышц, но могут быть также использованы и образцы других тканей, а в частности, образцы спермы, образцы ооцитов или образцы эмбрионов. В таком образце присутствие и/или последовательность конкретной нуклеиновой кислоты, будь то ДНК или РНК, может быть определено методами, известными специалистам, такими как гибридизация или амплификация нуклеиновой кислоты, или методы секвенирования. Настоящее изобретение относится к способу тестирования такого образца на присутствие нуклеиновой кислоты, где QTL или сцепленный с ним аллель ассоциируется с феноменом родительского импринтинга; например, к способу тестирования, в котором определяют, способен ли отцовский или материнский аллель указанного QTL к преимущественной экспрессии в данном животном.

Целью селекционных программ для разведения крупного рогатого скота является повышение продуктивности животных путем улучшения их генетического состава. В основе такого улучшения лежит накапливание путем увеличения частоты встречаемости наиболее предпочтительных аллелей для генов, влияющих на нужные признаки продуктивности. Эти гены называются QTL. До начала девяностых годов генетическое улучшение достигалось применением биометрических методов, но без использования молекулярных данных, определяющих QTL.

Начиная с девяностых годов и благодаря последним достижениям в области геномики стало возможным идентифицировать QTL, определяющий представляющий интерес признак. Настоящее изобретение относится к идентификации и к использованию подверженного родительскому импринтингу QTL в целях отбора животных путем картирования локусов количественных признаков. К тому же, феномен генетического или родительского импринтинга никогда не применялся для селекции домашних животных и, при осуществлении селекционных программ, использование этого нестабильного генетического свойства никогда не считалось целесообразным. Так, например, Kovacs & Kloting (Biolchem.Mol. Biol.Int., 44: 399-405, 1998), в работе которых ничего не упоминается и не высказывается каких-либо предположений о родительском импринтинге, обнаружили сцепление определенного признака у крыс-самок, но не у крыс-самцов, которое навело на мысль о возможной специфичности по полу, ассоциированной с хромосомным участком, что, разумеется, исключает родительский импринтинг, то есть феномен, при котором ассоциированный с импринтингом признак одного родителя преимущественно, но не специфически по полу, экспрессируется в нем или в его потомстве.

Настоящее изобретение относится к предварительному определению локализации подвергнутого родительскому импринтингу QTL на данном геноме путем анализа на сцепление с генетическими маркерами и к точной идентификации подвергнутого(ых) родительскому импринтингу гена(нов) и его(их) каузальных мутаций. Молекулярные данные о таком подвергнутом родительскому импринтингу QTL позволяет более эффективно осуществлять селекционные программы. Применение молекулярных данных о подвергнутом родительскому импринтингу QTL в селекционных программах предусматривает: сегрегационный анализ с использованием маркеров для идентификации сегрегации функционально отличающихся подвергнутых родительскому импринтингу аллелей QTL в представляющих интерес популяциях; отбор с помощью маркеров (MAS), осуществляемый в линиях для усиления генетического ответа путем повышения точности отбора, интенсивности отбора или путем снижения интервала между поколениями с использованием информации о феномене родительского импринтинга; интрогрессию с помощью маркеров (MAI) для эффективного переноса представляющих интерес и переданных путем родительского импринтинга аллелей QTL от популяции-донора в популяцию-реципиента; генетическое конструирование идентифицированных родительских QTL и генетическую модификацию племенного поголовья с использованием трансгенной технологии; разработку повышающих продуктивность продуктов с использованием нужных лекарственных средств, разработанных на основе молекулярных данных относительно указанных QTL.

Авторами настоящего изобретения были проведены два независимых эксперимента для оценки возможностей практического применения родительского импринтинга QTL.

В первом эксперименте, проведенном на ранее описанных интеркроссах "пьетрен × крупная белая", было подсчитано правдоподобие данных с использованием модели отцовского (экспрессировались только отцовские аллели) и материнского (экспрессировались только материнские аллели) импринтинга и это правдоподобие сравнивали с правдободобием данных, полученных с использованием модели стандартных "менделевских" QTL. Полученные результаты со всей очевидностью продемонстрировали, что действительно экспрессируются отцовские QTL, причем аллель QTL (пьетрен × крупная белая), унаследованный от свиноматки F1, не оказывает никакого влияния на качество мясной туши и на качество F₂-потомства. Было очевидно, что весьма значимые lod-величины (логарифмы величины отношения вероятностей) были получены при тестировании на присутствие экспрессированного отцовского QTL, тогда как при исследовании хромосом, передаваемых свиноматками, не было получено каких-либо свидетельств относительно сегрегации QTL. При этом, та же самая тенденция наблюдалась для всех признаков, что указывало на то, что один и тот же прошедший импринтинг ген ответственен за эффекты, наблюдаемые для разных признаков. В таблице 1 указано максимальное правдоподобие (ML) фенотипического среднего для F₂-потомства, отсортированного по унаследованному отцовскому аллелю.

Во втором эксперименте, осуществленном на интеркроссах "дикая свинья × крупная белая", QTL-анализы по признакам конституции животного, жирности, мясного качества и роста осуществляли по карте хромосомы 2 с использованием статистической модели тестирования на присутствие эффекта импринтинга. Было получено явное свидетельство того, что экспрессированный отцовский QTL локализован на очень дальнем конце 2р (фиг.2; таблица 1). Явная экспрессия отцовского QTL проиллюстрирована методом наименьших квадратов, которая разделяет последующую популяцию на два класса по унаследованному отцовскому аллелю (Таблица 1). Для данного, прошедшего отцовский импринтинг, QTL реализация сегрегационного анализа, селекция (MAS) и интрогрессия (MAI) с помощью маркера могут быть осуществлены с использованием генетических маркеров, которые сцеплены с QTL, генетических маркеров, которые находятся в неравновесном сцеплении с QTL, или с использованием реальных каузальных мутаций в QTL.

Понимание эффекта родительского происхождения, присущего QTL, позволяет оптимально использовать его в селекционных программах. Действительно, сегрегационный анализ с помощью маркера, проводимый на модели родительского импринтинга, дает лучшие оценки эффектов QTL-аллелей. Более того, это позволяет применять специфические селекционные схемы с учетом оптимального использования QTL. В одном из вариантов настоящего изобретения наиболее предпочтительные аллели QTL могут быть фиксированы в линиях племенных животных и, например, использованы для выращивания промышленных кроссбредных самцов путем отбора с помощью маркера (MAS, внутрилинейный) и интрогрессии с помощью маркера (MAI, межлинейный). В другом варианте осуществления изобретения наихудшие аллели QTL могут быть фиксированы в линиях животных, используемых для выращивания промышленных кроссбредных самок, с помощью MAS (внутрилинейное скрещивание) и MAI (межлинейное скрещивание).

В предпочтительном варианте осуществления изобретения указанным животным является свинья. В качестве примера можно отметить, что настоящее изобретение дает представление о том, что в настоящее время половина потомства от широко распространенных промышленных кроссбредных хряков "пьетрен × крупная белая" наследует нежелательный по мышечной массе QTL крупной белой породы, что приводит, как показано в настоящем изобретении, к значительной потере массы, и настоящее изобретение, например, дает возможность проводить отбор лучшей половины популяции по этому признаку. Однако, имеется также возможность отбора промышленных линий свиноматок, обогащенных аллелями, нежелательными для хряков, что позволяет наделять свиноматок другими аллелями, которые, например, являются более благоприятными для репродуктивных целей.

В предпочтительном варианте осуществления способа настоящего изобретения указанный QTL локализован в положении, соответствующем QTL, локализованному в хромосоме 2 свиньи.

Так, например, из данных сравнительного картирования хромосом свиньи и человека, включая "роспись" разнонаправленных хромосом, известно, что SSC2p является гомологичной HSAllpter-q13^11,12. Известно, что HSAllpter-q13 составляет кластер подвергнутых импринтингу генов: IGF2, INS2, Н19, МАН2, P57^KIP2, K_vLQTL1, Tapa/CD81, Orct12, Impt1 и Ip1. Кластер подвергнутых импринтингу генов, локализованных в HSAllpter-q13, характеризуется 8 экспрессированными материнскими генами H1 9, МАН2, P57^KIP2, K_vLQTL1, TAPA/CD81, ORCT12, IMPT1 и IР1, и двумя экспрессированными отцовскими генами IGF2 и INS. Однако, Johanson и др. (Genomic, 25: 682-690, 1995) и Reik и др. (Trends in Genetics, 13: 330-334, 1997) сообщили, что местонахождение этих локусов у различных животных пока неизвестно. Так, например, локусы HSA11 и MMU7 не соответствуют друг другу и локусы MMU7 и SSC2 не соответствуют друг другу, тогда как локусы HSA11 и SSC2, вероятно, соответствуют друг другу, и не имеется каких-либо указаний относительно того, в каком месте на хромосомах трех видов локализованы один или несколько, например, идентифицированных выше генов, экспрессированных в зависимости от того, каким родителем они были переданы.

Что касается других домашних животных, таких как крупный рогатый скот, овцы, домашняя птица и рыба, имеющих аналогичные области в своем геноме, содержащем такой кластер прошедших импринтинг генов QTL, то, в этой связи, настоящее изобретение относится к использованию указанных ортологичных областей других домашних животных в селекционных программах с применением феномена родительского импринтинга. У свиней указанный кластер картирован приблизительно в положении 2р1.7 хромосомы 2, однако, способ, представленный в настоящем изобретении и предусматривающий использование (фрагментов) указанных экспрессированных материнских или отцовских ортологичных или гомологичных генов или QTL, предпочтительно применяют для других животных, а также в целях разведения и селекции. Так, например, представлен способ, где указанный QTL ассоциирован с потенциальной мышечной массой и/или отложением жира, предпочтительно с ограниченным влиянием на другие признаки, такие как качество мяса и ежедневный прирост массы указанного животного, либо где указанный QTL включает по крайней мере часть аллеля инсулин-подобного фактора роста 2 (IGF2). Reik et al. (Trends in Genetics, 13:330-334, 1997) объясняют, что этот ген у человека связан с синдромом Беквита-Видемана, который, очевидно, является синдромом, ассоциированным с родительским импринтингом и наиболее часто наблюдаемым в человеческом плоде, где данный ген играет важную роль в пренатальном развитии. При этом не было обнаружено какой-либо связи или не было высказано каких-либо предположений о связи с постнатальным развитием, относящимся к развитию мышечной массы или жирности (домашних) животных.

В предпочтительном варианте своего осуществления настоящее изобретение относится к способу отбора свиней на нужные генотипические или потенциальные фенотипические свойства, предусматривающему тестирование образца, взятого от указанной свиньи, на присутствие локуса количественного признака (QTL), локализация которого была определена при картировании хромосомы 2 Sus scrofa в положении 2р1.1. В частности, настоящее изобретение относится к использованию генетических маркеров для теломерного конца хромосомы 2р свиньи при отборе с помощью маркера (MAS) прошедшего родительский импринтинг локуса количественнных признаков (QTL), влияющего на количество и качество мясной туши у свиней. Кроме того, настоящее изобретение относится к использованию генетических маркеров, ассоциированных с локусом IGF2 в MAS у свиней, таких как полиморфизм и микросателлиты и другие указанные здесь характерные нуклеиновокислотные последовательности, такие как последовательности, представленные на фиг.4-10. В предпочтительном варианте своего осуществления настоящее изобретение относится к QTL, локализованному на дистальном конце хромосом 2 Sus scrofa и влияющему на различные уровни количества и качества мясной туши, а, в частности, мышечной массы и отложения жира.

В первом эксперименте анализ путем картирования QTL осуществляли на интеркроссах "дикая свинья × крупная белая" с оценкой 200 особей F₂. F₂-Животных умерщвляли либо при живом весе по крайней мере в 80 кг, либо при максимальном возрасте 190 дней. Затем собирали фенотипические данные по массе при рождении, росту, отложению жира, конституции животного, массе внутренних органов и качеству мяса; подробное описание фенотипических признаков приводится в работах Andersson et al.¹ и Anderssson-Eklund et al.⁴.

QTL (не оказывающий какого-либо значительного влияния на толщину хребтового жира) у точно не определенного локуса на проксимальном конце хромосомы 2, оказывающего умеренное влияние на мышечную массу и локализованного на расстоянии примерно 30 см от рассматриваемого здесь прошедшего родительский импринтинг QTL, был ранее описан авторами настоящего изобретения; тогда как QTL, рассматриваемый в данном описании, имеет очень большой эффект, что объясняется по крайней мере 20-30% дисперсией и благодаря чему QTL по настоящему изобретению приобретает особый коммерческий интерес, который еще более возрастает в том случае, если присутствующий QTL был подвергнут родительскому импринтингу. Маркерная карта хромосомы 2р была уточнена в процессе разработки настоящего изобретения путем добавления микросателлитных маркеров для схватывания всего плеча хромосомы. Были использованы следующие микросателлитные маркеры: Swc9, Sw2443, Sw2623 и Swr2516, все от дистального конца 2р⁷. QTL-анализы признаков конституции животного, жирности, качества мяса и роста осуществляли с использованием новой карты хромосомы 2. Было получено явное подтверждение того, что QTL локализуется на наиболее дистальном конце 2р (Фиг.1; Таблица 1). QTL оказывает очень сильное влияние на содержание постного мяса в окороке и объясняет неожиданную 30%-ную остаточную фенотипическую дисперсию в популяции F₂. Было также отмечено большое влияние на площадь самой длинной хребетной мышцы, на массу сердца и на толщину хребетного жира (подкожного жира). Было обнаружено умеренное влияние на признак качества мяса, коэффициент отражения. QTL не оказывал значимого влияния на брюшинный жир, массу при рождении, рост, массу печени, почек или селезенки (данные не приводятся). У свиней крупной белой породы аллель в этом QTL ассоциирован с большей мышечной массой и меньшей толщиной хребтового жира, что соответствует отличию этой породы от популяции дикой свиньи.

Во втором эксперименте картирование QTL осуществляли для интеркроссов "пьетрен × крупная белая", давших 1125 потомков F₂. Родительские породы крупная белая и пьетрен отличаются по ряду экономически важных фенотипов. Порода пьетрен известна своей исключительно высокой мышечной массой и постностью мяса¹⁰ (фиг.2), тогда как крупная белая порода известна своими сверхвысокими показателями роста. Для всего потомства F₂ были зарегистрированы двадцать один различный фенотип, определяющие показатель роста (5), мышечную массу (6), отложение жира (6) и качество мяса (4). Для картирования QTL, ответственного за генетические различия между этими породами, авторы настоящего изобретения предприняли сканирование целого генома с использованием микросателлитных маркеров в исходном образце 677 особей потомства F₂. Для анализа хромосомы 2 была использована карта нижеследующих микросателлитных маркеров: SW2443, SWC9 и SW2623, SWR2516-(0,20)-SWR783-(0,29)-SW240-(0,20)-SW776-(0,08)-S0010-(0,04)-SW1695-(0,36)-SWR308. Анализ хромосомы 2 свиньи с использованием многоточечного алгоритма максимального правдоподобия показал высокозначимые lod-величины (логарифма величины отношения вероятностей) (вплоть до 20) для трех из шести фенотипов, определяющих мышечную массу (% постной фракции мяса, % окорока, % спинной части туши) и для трех из шести фенотипов, определяющих отложение жира (толщину хребтового жира (BFT), % хребтового жира, % жировой фракции) на дистальном конце короткого плеча хромосомы 2 (фиг.1). Для остальных шести фенотипов, определяющих мышечную массу и жирность, в соответствующей области хромосомы были получены положительные lod-величины, однако экспериментально не был достигнут порог значимости (α=5%). Не существует каких-либо данных о влиянии соответствующего QTL на показатели роста (включая массу при рождении) или о зарегистрированных оценках качества мяса (данные не приводятся). Для подтверждения этого факта оставшийся образец от 355 F₂-потомков был генотипирован для четырех наиболее дистальных маркеров 2р, и анализ, проведенный на QTL для указанных признаков, дал наиболее высокие lod-величины в первом анализе. Lod-величины в диапазоне от 2,1 до 7,7 явно подтверждают присутствие мажорного QTL в данной области. В таблице 2 представлены соответствующие оценки максимального правдоподобия (ML) для трех генотипических средних, а также остаточная дисперсия. Данные, полученные в сегрегационном анализе с помощью маркеров, указывают на остаточную сегрегацию в этом локусе в популяции породы пьетрен.

Следовательно, эти эксперименты со всей очевидностью свидетельствуют о существовании QTL, оказывающих большое влияние на качество и количество туши, и локализованных на теломерном конце плеча хромосомы 2р свиньи; при этом очевидно, что у этого QTL существуют аллельная серия, состоящая по крайней мере из трех аллелей: дикая свинья < крупная белая < пьетрен, и что, более вероятно, она дает наблюдаемую сегрегацию в породе пьетрен.

Влияние идентифицированного QTL на мышечную массу и отложение жира является действительно значительным, причем то же самое значение было получено для локуса CRC, хотя, вероятно, без ассоциированных с ним неблагоприятных воздействий на качество мяса. Авторами настоящего изобретения было установлено, что оба локуса вместе подтверждают примерно 50%-ное расхождение породы "пьетрен" и крупной белой породы по признакам мышечной массы и постности мяса. QTL оказывает очень большое влияние на содержание постного мяса в окороке и объясняет неожиданно обнаруженную 30% остаточную фенотипическую дисперсию в F₂-популяции. Было также отмечено большое влияние на площадь наиболее длинной спинной мышцы, на массу сердца и на толщину хребтового жира (подкожного жира). Наблюдалось умеренное влияние на один признак качества мяса, коэффициент отражения. QTL не оказывает большого влияния на брюшной жир, массу при рождении, рост, массу печени, почки или селезенки (данные не приводятся). Аллель в данном QTL крупной белой породы, по сравнению с аллелем дикой свиньи, ассоциирован с большей мышечной массой и меньшей толщиной хребтового жира, что соответствует различию между этой породой и популяцией диких свиней. Сильно выраженный эффект импринтинга, наблюдаемый для всех ассоциированных с ним признаков, свидетельствует об участии одного каузативного локуса. Плейотропное влияние на массу скелетной мышцы и размер сердца является, очевидно, адаптивным с физиологической точки зрения, поскольку большая мышечная масса требует большего сердечного выброса.

В другом варианте своего осуществления настоящее изобретение относится к способу отбора свиней, имеющих желательные генотипические или потенциальные фенотипические признаки, где указанный способ предусматривает тестирование образца от данной свиньи на присутствие локуса количественных признаков (QTL), локализованного на карте хромосомы 2 Sus scrofa в положении 2р1.7, где указанный QTL включает по крайней мере часть аллеля инсулин-подобного фактора-2 (IGF2) или близкородственной ему геномной области, такой как полиморфизмы и микросателлиты, и другие характерные нуклеиновокислотные последовательности, указанные в настоящем описании, такие, которые были показаны на фиг.4-10. Важная роль IGF2 в пренатальном развитии хорошо задокументирована с использованием анестезированных мышей, а также исходя из его каузативной роли в синдроме Беквита-Видемана. Настоящее изобретение продемонстрировало важную роль IGF2-области также для постнатального развития.

Для того чтобы показать роль IGF2, авторы настоящего изобретения провели следующие три эксперимента:

Клон геномного IGF2 выделяли путем скрининга библиотеки ВАС свиньи. В FISH-анализах с использованием данного ВАС-клона наблюдался сильный соответствующий сигнал на терминальной части хромосомы 2р.

Полиморфный микросателлит локализован в 3'UTR IGF2 у мышей (Genbank U71085), людей (Genbank S62623) и лошадей (Genbank AF020598). Возможное присутствие соответствующего свиного микросателлита исследовали путем прямого секвенирования 3'UTR IGF2 с использованием ВАС-клона. Комплексный микросателлит был идентифицирован на расстоянии примерно 800 п.н. ниже от стоп-кодона; при этом, сравнение последовательностей показало, что этот микросателлит был идентичен ранее описанному анонимному микросателлиту, Swc9⁶. Этот маркер был использован в предварительных исследованиях по картированию QTL и его локализация на генетической карте соответствует, по всей вероятности, QTL в родословных "пьетрен × крупная белая" и "крупная белая × дикая свинья".

Анализ кДНК скелетной мышцы и печени 10-недельного плода, гетерозиготного по трансверсии nt241 (G-A) во втором экзоне свиного гена IGF11 и SWC9, показал, что ген IGF11 также подвержен импринтингу в этих тканях у свиней и экспрессируется только отцовским аллелем.

Исходя из опубликованной кДНК-последовательности¹⁶ печени взрослой свиньи, авторами настоящего изобретения были сконструированы пары праймеров, позволяющие амплифицировать всю кодирующую последовательность Igfll, включающую 222 п.н. лидерной последовательности и 280 п.н. трейлерной последовательности в кДНК скелетной мышцы свиньи. Секвенирование продуктов полимеразной цепной реакции с обратной транскриптазой (ОТ-ПЦР), полученных от пород "пьетрен" и "крупная белая", показало, что кодирующие последовательности были идентичны друг другу для обеих пород и идентичны указанной опубликованной последовательности. Однако, в лидерной последовательности была обнаружена транзиция GА, соответствующая экзону 2 у самцов. В соответствии с общепринятой номенклатурой, этот полиморфизм был обозначен как nt241(G-A). Авторами настоящего изобретения был разработан тест-скрининг на указанный полиморфизм в одном нуклеотиде 9 (SNP) на основе реакции лигирования амплификации, что позволило определить генотип полученного авторами материала по родословной. На основании этих данных было показано, что IgfII ко-локализуется вместе с микросателлитным маркером SWC9 (θ=0%), а поэтому фактически совпадает, очевидно, с большинством положений QTL, а также находится в пределах 95% допустимого интервала для QTL. Последующие анализы последовательности показали, что микросателлитный маркер SWC9 действительно расположен в 3'UTR гена IgfII.

Как упоминалось ранее, информация об указанном QTL позволяет разработать способ селекции отбора животных, таких как свиньи, с улучшенной кондицией мясной туши. Рассматриваются различные варианты осуществления настоящего изобретения, включая сегрегационный анализ с помощью маркера для идентификации сегрегации функционально отличающихся аллелей QTL в представляющих интерес популяциях; отбор с помощью маркера (MAS), проводимый внутри линий для усиления генетического ответа путем повышения точности отбора, интенсивности отбора или путем уменьшения интервала между поколениями; интрогрессию с помощью маркера (MAI) для эффективного переноса предпочтительных аллелей QTL от популяции-донора в популяцию-реципиент и, тем самым, для усиления генетического ответа в популяции-реципиенте. Реализация вариантов сегрегационного анализа, отбора (MAS) и интрогрессии (MAI) с помощью маркера может быть осуществлена с использованием генетических маркеров, которые сцеплены с QTL, генетических маркеров, которые находятся в неравновесном сцеплении с QTL, или с использованием реальных каузальных мутаций в QTL.

В другом варианте своего осуществления настоящее изобретение относится к способу отбора свиней, имеющих желательные генотипические или потенциальные фенотипические признаки, где указанный способ предусматривает тестирование образца, взятого от данной свиньи, на присутствие локуса количественных признаков (QTL), локализованного на карте хромосомы 2 Sus scrofa в положении 2р1.7, где указанный QTL является отцовским экспрессированным QTL, то есть экспрессированным из отцовского аллеля. Известно, что у человека и мыши Igf2 является импринтабельным и экспрессируется в некоторых тканях исключительно из отцовского аллеля. Анализ кДНК скелетной мышцы свиней, гетерозиготных по SNP и/или SWC9, показал, что у этих свиней сохраняется тот же самый импринтинг. Понимание эффекта родительского происхождения, характеризующего QTL, как было показано в настоящем изобретении, отныне позволяет оптимально его использовать в селекционных программах. Действительно, в настоящее время половина потомства, полученного от наиболее распространенных промышленных кроссбредов "пьетрен × крупная белая", наследует нежелательный аллель, ответственный за значительные экономические потери. Использование способа настоящего изобретения позволяет избежать этой проблемы.

Настоящее изобретение также относится к выделенной и/или рекомбинантной нуклеиновой кислоте или к ее функциональному фрагменту, содержащему прошедший родительский импринтинг локус количественных признаков (QTL) или его фрагмент, способный преимущественно экспрессироваться по аллелю одного из родителей.

Получение такой нуклеиновой кислоты настоящего изобретения позволяет генерировать трансгенных животных, у которых нужные гены способны исключительно или преимущественно экспрессироваться по аллелю одного из родителей, что дает возможность получать потомство от указанного животного, гомозиготное по нужному признаку, связанному с желательными свойствами, аналогичными свойствам, ассоциированным с родительским экспрессированным аллелем.

В предпочтительном варианте своего осуществления настоящее изобретение относится к выделенной и/или рекомбинантной нуклеиновой кислоте или к ее функциональному фрагменту, содержащему синтетический, способный к родительскому импринтингу, локус количественных признаков (QTL) или его функциональный фрагмент, происходящий по крайней мере из одной хромосомы. Употребляемый здесь термин "синтетический" относится к QTL, экспрессированному в зависимости от того, каким родителем он был передан, где различные элементы объединены и происходят из различных положений данного генома одного или нескольких животных. Настоящее изобретение относится к рекомбинантной нуклеиновой кислоте, где последовательности, ассоциированные с родительским импринтингом одного QTL, объединены с последовательностями, ассоциирующимися с генами или предпочтительными аллелями второго QTL. Такая генная конструкция предпочтительно используется для получения трансгенных животных, где второй QTL наделен способностью к родительскому импринтингу в отличие от характера наследования у дикого животного, от которого происходит QTL. Такой второй QTL может, например, происходить от той же самой хромосомы, где расположена область родительского импринтинга, но он может также происходить от того же самого вида или даже от другого вида. У такой свиньи указанный второй QTL может быть, например, ассоциирован с геном рецептора эстрогена (ESR) (Rothschild et al., PNAS, 93, 201-201, 1996) или FAT-QTL (Anderssson, Science, 263, 1771-1774, 1994), например, происходящим от другой хромосомы свиньи, такой как хромосома 4. Второй или дополнительный QTL может также происходить от другого (домашнего) животного или человека.

Настоящее изобретение также относится к выделенной и/или рекомбинантной нуклеиновой кислоте или происходящему от нее функциональному фрагменту, по крайней мере частично соответствующему QTL свиньи, локализованному на карте хромосомы 2 Sus scrofa в положении 2р1.7, где указанный QTL ассоциирован по крайней мере с потенциальной мышечной массой и/или с отложением жира у указанной свиньи, и/или где указанный QTL включает по крайней мере часть аллеля инсулин-подобного фактора роста-2 (IGF2) Sus scrofa, находящегося предпочтительно на участке между INS и H1 9, либо предпочтительно происходящего от домашней свиньи такой породы, как пьетрен, мейшан, дюрок, ландрас или крупная белая, или от дикой свиньи. Так, например, геномный клон IGF2 был выделен путем скрининга библиотеки ВАС свиньи. В FISH-анализах с использованием данного ВАС-клона наблюдался сильный соответствующий сигнал на концевой части хромосомы 2р. Полиморфный микросателлит локализован в 3'UTR IGF2 у мыши (Genbank U71085), человека (Genbank S62623) и лошади (Genbank AF020598). Возможное присутствие соответствующего свиного микросателлита исследовали путем прямого секвенирования 3'UTR IGF2 с использованием ВАС-клона. Комплексный микросателлит был идентифицирован на расстоянии примерно 800 п.н. ниже от стоп-кодона; при этом сравнение последовательностей показало, что этот микросателлит был идентичен ранее описанному анонимному микросателлиту, Swc9. Был сконструирован ПЦР-праймер и было обнаружено, что данный микросателлит (IGF2ms) является в высокой степени полиморфным по трем различным аллелям у двух родоначальников диких свиней и двух других из восьми родоначальников породы крупной белой. IGF2ms был полностью информативным в интеркроссе, поскольку родоначальник породы, а также родитель родоначальника, могли быть определены с достоверностью для каждого аллеля в каждом F₂-животном.

Анализ на сцепление с использованием родословной интеркроссов осуществляли с IGF2ms и микросателлитами Sw2443, Sw2623 и Swr2616, все из которых локализованы у дистального конца 2р⁷. IGF2 был сначала приписан 2р по высокой значимости lod-величины (например, Z=89,0; θ=0,003 по отношению к Swr2516). Многоточечные анализы, включающие использование ранее типированных маркеров хромосомы 2, выявили нижеследующий порядок расположения локусов (расстояний на усредненной по полу карте Kosambi cM): Sw2443/Swr2516-0,3-IGF2-14,9-Sw2623-10,3-Sw256. He наблюдалось рекомбинантов между Sw2443 и Swr2616, и предположение о проксимальной локализации IGF2 по отношению к этим локусам основано на одном рекомбинанте, дающем подтверждение lod-величины, равной 0,8 для указанного порядка. Наиболее дистальный маркер в более раннем исследовании QTL авторов настоящего изобретения, Sw256, локализован примерно на расстоянии 25 сМ от дистального конца группы сцепления.

Настоящее изобретение, кроме того, относится к использованию нуклеиновой кислоты или ее функционального фрагмента, полученного в соответствии с настоящим изобретением в способе в соответствии с настоящим изобретением. В предпочтительном варианте осуществления изобретения использование способа настоящего изобретения позволяет проводить отбор племенного животного или животного для убоя, или эмбриона, или спермы, происходящей от этих животных, на основании наличия нужных генотипических или потенциальных фенотипических свойств. В частности, настоящее изобретение относится к такому использованию, при котором указанные свойства относятся к мышечной массе и/или отложению жира. QTL настоящего изобретения может быть применен или использован для повышения, например, содержания постного мяса или снижения толщины хребтового жира путем отбора с помощью маркера внутри популяции или путем интрогрессии с помощью маркера предпочтительных аллелей от одной популяции в другую. Примерами отбора с помощью маркера и с использованием QTL настоящего изобретения является проведение сегрегационного анализа с помощью маркера и с использованием сцепленных маркеров или маркеров с неслучайным распределением для идентификации функционального отличия аллелей QTL.

Более того, идентификация каузативной мутации в QTL является отныне возможной и, кроме того, позволяет идентифицировать функционально отличающиеся аллели QTL. Настоящее изобретение также относится к таким функционально отличающимся аллелям QTL, локализованным на дистальном конце хромосомы 2р и оказывающим большое влияние на массу скелетной мышцы, размер сердца и толщину хребтового жира. Наблюдение аналогичного эффекта QTL в интеркроссах "крупная белая × дикая свинья", а также "пьетрен × крупная белая" подтвердило существование серии по крайней мере из трех различных функциональных аллелей. Кроме того, предварительные данные, полученные в сегрегационном анализе с использованием маркеров, указывали на остаточную сегрегацию в этом локусе в популяции "пьетрен" (данные не приводятся). Частота аллельной серии, рассматриваемой в настоящем изобретении, позволяет идентифицировать каузальный полиморфизм, который, вследствие количественной природы наблюдаемого эффекта, является маловероятным для крупных генных альтераций, но является вероятным в отношении незначительных регуляторных мутаций. Влияние на мышечную массу этих трех аллелей оценивается в том же самом порядке, как и в породах, в которых они обнаружены, то есть свиньи породы пьетрен являются более мускулистыми, чем свиньи породы белой крупной, которые, в свою очередь, имеют более высокое содержание постного мяса, чем дикая свинья. Кроме того, настоящее изобретение относится к использованию рассматриваемых аллелей для внутрилинейной селекции или для маркерной интрогрессии с использованием сцепленных маркеров, маркеров с неслучайным распределением или аллелей, содержащих каузативные мутации.

Настоящее изобретение, кроме того, относится к животному, отобранному способом настоящего изобретения. Так, например, отныне может быть отобрана свинья, характеризующаяся тем, что она является гомозиготной по аллелю в QTL, локализованном на карте хромосомы 2 Sus scrofa в положении 2р1.7, а поэтому она входит в объем настоящего изобретения. Поскольку указанный QTL ассоциирован с потенциальной мышечной массой и/или отложением жира у указанной свиньи и/или указанный QTL содержит по крайней мере часть аллеля инсулин-подобного фактора роста-2 (IGF2) Sus scrofa, то может быть осуществлен отбор перспективных свиней для племенного разведения или убоя. В частности, настоящее изобретение относится к животному, которое является самцом. Такой самец или его сперма или эмбрион, происходящие от него, могут быть предпочтительно использованы при разведении животных для создания племенных линий или для конечного разведения животных, предназначенных для убоя. В предпочтительном варианте такого использования настоящего изобретения, самца или его сперму, специально отобранных так, чтобы они были гомозиготными по аллелям, вызывающим максимальную гипертрофию и постность мышечной массы, использовали для продуцирования потомства, гетерозиготного по такому аллелю. Благодаря экспрессии указанного отцовского аллеля, указанное потомство также будет приобретать эти благоприятные признаки, например ассоциированные с мышечной массой, даже если самка-родитель имеет другой генетический фон. Кроме того, отныне стало возможным осуществлять положительный отбор самки(ок) по наличию различных признаков, например ассоциированных с плодовитостью, но не оказывающих негативного влияния на свойство мышечной массы, которое наследуется по аллелю, полученному от отобранного самца. Так, например, ранее такие самцы могли изредка наблюдаться у свиней породы "пьетрен", но генетически было непонятно, каким образом с наибольшей выгодой использовать эти признаки для селекционных программ.

Кроме того, настоящее изобретение относится к трансгенному животному, к его сперме или к происходящему от него эмбриону, содержащему синтетический, способный к родительскому импринтингу, QTL или его функциональный фрагмент, рассматриваемый в настоящем изобретении, то есть настоящее изобретение предусматривает введение предпочтительного рекомбинантного аллеля, например, введение локуса рецептора эстрогена, ассоциированного с повышенным размером помета, гомозиготному по нему животному, в область, ассоциированную с родительским импринтингом прародителя (например, отца гибридной свиноматки в том случае, если данная область была подвергнута родительскому импринтингу, а прародителем является хряк); введение предпочтительного ассоциированного с жирностью аллеля или аллеля, ассоциированного с мышечной массой, в область, подверженную родительскому импринтингу и т.п. Рекомбинантными аллелями являются такие аллели, которые представляют интерес или которые являются предпочтительными по материнской линии, либо, часто, такие аллели, которые оказывают противоположное влияние на аллели, полученные по отцовской линии. Так, например, у мясных животных, таких как свиньи, рекомбинантные аллели, ассоциированные со свойствами качества мяса, такими как внутримышечный жир или мышечная масса, могут быть фиксированы в женской линии, а рекомбинантные аллели, сцепленные с пониженным содержанием хребтового жира, могут быть фиксированы по мужской линии. Другими желательными комбинациями являются, например, плодовитость и/или молочность по женской линии и интенсивность роста и/или мышечная масса по мужской линии.

Ниже приводится более подробное описание настоящего изобретения, не ограничивающее его объема.

Подробное описание

ПРИМЕР 1: Интеркроссы "дикая свинья х крупная белая"

Методы

Выделение клона ВАС IGF2 и флуоресцентная in situ гибридизация (FISH). Праймеры IGF2

(F: 5'-GGCAAGTTCTTCCGCTAATGA-3' и

R: 5'-GCACCGCAGAATTACGACAA-3')

для ПЦР-амплификации части последнего экзона и 3'UTR конструировали на основе кДНК-последовательности IGF2 свиньи (Genbank Х56094). Указанные праймеры были использованы для скрининга библиотеки ВАС свиньи, и клон 253G10 выделяли. Неочищенную ВАС-ДНК получали как описано в литературе²⁴. ВАС-ДНК линеаризовали ферментом EcoRV и очищали с использованием (QIAGEN GmbH, Germany). Этот клон метили биотин-14-dATP с использованием системы для мечения GIBCO-BRL Bionic (BRL18246-015). Метафазные хромосомы свиньи были получены стандартными методами из стимулированных фитолаккой (Seromed) лимфоцитов. Предметные стекла выдерживали в течение двух дней при комнатной температуре, а затем оставляли при -20°С вплоть до использования. Анализ FISH осуществляли как описано в литературе²⁵. Конечная концентрация зонда в гибридизационной смеси составляла 10 нг/мкл. Повторяющиеся последовательности ингибировали стандартными концентрациями геномной ДНК свиньи. После пост-гибридизационной промывки биотинилированный зонд детектировали с использованием двух слоев авидин-ФИТЦ (Vector А-2011). Эти хромосомы подвергали контрастному окрашиванию 0,3 мг/мл DAPI (4,6-диамино-2-фенилиндол; Sigma D9542), который продуцировал картину, подобную G-бэндингу. Какого-либо пост-гибридизационного бэндинга не требовалось, поскольку хромосома 2 легко идентифицируется и без бэндинга. Всего было оценено 20 метафазных пластинок под флуоресцентным микроскопом Olympys BX-60, к которому была подсоединена видеокамера IMAC-CCD S30 и который был снабжен программным обеспечением ISIS 1.65 (Metasystems).

Последовательность, микросателлит и анализ на сцепление

Для прямого секвенирования было использовано около двух мкг линеаризованной и очищенной ВАС-ДНК с применением 20 пмоль праймеров и химического метода терминации цепи красителем BigDye Terminator Chemistry (Perkin-Elmer, USA). Секвенирование ДНК проводили с 3'-конца последнего экзона по направлению к 3'-концу UTR до тех пор, пока не был обнаружен микросателлит. Был сконструирован набор праймеров

(F: 5'-GTTTCTCCTGTACCCACACGCATCCC-3' и

R: 5'-флуоресцеин-CTACAAGCTGGGCTCAGGG-3')

для амплификации микросателлита IGF2, который имел длину 250 п.н. и находился приблизительно на 800 п.н. ниже от стоп-кодона. Этот микросателлит был амплифицирован с использованием флуоресцентно меченых праймеров и определяли генотип с использованием секвенатора АВ1377 и программного обеспечения GenScan/Gentyper (Perkin-Elmer, USA). Двухточечный и многоточечный анализ на сцепление проводили с использованием программного обеспечения Cri-Map²⁶.

Животные и фенотипические данные

Родословная интеркроссов включала двух самцов европейской дикой свиньи и восемь самок крупной белой, 4 самца F₁ и 22 самки F₁ и 200 особей F₂-потомства¹. F₂-животных умерщвляли при живом весе, составляющем по крайней мере 80 кг, или в возрасте максимум 190 дней. Затем собирали фенотипические данные по массе при рождении, интенсивности роста, отложению жира, конституции туши, веса внутренних органов и качества мяса; подробное описание фенотипических признаков приводится в работах Andersson et al.¹ и Andersson-Eklund et al.⁴.

Статистический анализ

Интервальное картирование на присутствие QTL осуществляли методом наименьших квадратов, разработанным для анализа кроссов, полученных путем скрещивания аутбредных линий²⁷. Этот метод основан на предположении, что две расходящиеся линии были фиксированы по альтернативным аллелям QTL. Имеется четыре возможных генотипа в F₂-поколении, если учитывать прародительское происхождение аллелей в каждом локусе. Это позволяет проводить отбор по трем эффектам: аддитивный эффект, доминантность и импринтинг². Последний эффект оценивается как различие между двумя типами гетерозигот, где одна из них приобретает аллель дикой свиньи по мужской F₁-линии, а другая приобретает его по женской F₁-линии. F-отношение вычисляют с использованием указанной модели (с 3 степенями свободы (ст. св.)) по отношению к редуцированной модели без QTL-эффекта для каждого сМ хромосомы 2. Наиболее вероятное положение QTL было получено как положение, дающее наиболее высокое отношение F. Пороги значимости для генома были получены эмпирически с помощью теста на пермутацию²⁸, как описано в литературе². Для определения значимости эффекта импринтинга QTL-модель, включающую эффект импринтинга, сравнивали с моделью без импринтинга (с 1 ст.св.).

Статистические модели также включали фиксированные эффекты и ковариации, которые были релевантными для соответствующих признаков; более подробное описание используемых статистических моделей см. Andersson-Eklund et al.⁴. Для вычисления фоновых генетических эффектов и материнских эффектов было включено семейство, т.е. женское потомство. Масса туши учитывалась как ковариант для дифференциации влияния QTL на коррелированные признаки, что означает, что все результаты, относящиеся к конституции животного, сравнивали при равных массах. Значение наименьших квадратов для каждого класса генотипов в локусе IGF2 оценивали в одноточечном анализе с использованием процедуры GLM SAS²⁹; при этом данная модель включала те же самые фиксированные эффекты и ковариации, которые были использованы в анализе интервального картирования. QTL обнаруживал явную зависимую от родительского происхождения экспрессию, а положение на карте совпадало с положением гена инсулин-подобного фактора роста II (IGF2), что указывало на то, что IGF2 является каузативным геном. В этом локусе также наблюдалось в высокой степени значимое нарушение сегрегации (избыток аллелей, происходящих от дикой свиньи). Эти результаты продемонстрировали важное влияние области IGF2 на пост-натальное развитие, и возможно, что присутствию отцовского экспрессированного QTL, сцепленного с IGF2, у человека и в организмах-моделях грызунов до сих пор не уделялось внимания из-за экспериментального конструирования или статистической обработки данных. Данное исследование также имеет большое значение для теоретической количественной генетики и для практического разведения свиней.

IGF2 был идентифицирован как позиционный ген-кандидат для данного QTL, благодаря наблюдаемому сходству между хромосомой 2р свиньи и хромосомой 11p человека. Геномный клон IGF2 был выделен путем скрининга библиотеки ВАС свиньи. В FISH-анализе с использованием этого клона ВАС наблюдался сильный соответствующий сигнал на концевой части хромосомы 2р (фиг.1). Полиморфный микросателлит локализован в 3'UTR IGF2 у мышей (Genbank U71085), людей (Genbank S62623) и лошадей (Genbank AF020598). Возможное присутствие соответствующего свиного микросателлита исследовали путем прямого секвенирования 3'UTR IGF2 с использованием ВАС-клона. Комплексный микросателлит был идентифицирован на расстоянии примерно 800 п.н. ниже от стоп-кодона; при этом сравнение последовательностей показало, что этот микросателлит был идентичен ранее описанному анонимному микросателлиту, Swc9⁶. Были сконструированы ПЦР-праймеры и было обнаружено, что микросателлит (IGF2ms) является в высокой степени полиморфным по трем различным аллелям у двух родоначальников диких свиней и двух других из восьми родоначальников породы крупной белой. IGF2ms был полностью информативным в интеркроссе, поскольку родоначальник породы, а также родитель родоначальника, могли быть определены с достоверностью для каждого аллеля в каждом F₂-животном.

Анализ на сцепление с использованием родословной интеркроссов осуществляли с IGF2ms и микросателлитами Sw2443, Sw2623 и Swr2616, все из которых локализованы у дистального конца 2р⁷. IGF2 был сначала приписан 2р по высокой значимости lod-величины (например, Z=89,0; θ=0,003 по отношению к Swr2516). Многоточечные анализы, включающие использование ранее типированных маркеров хромосомы 2⁸, выявили нижеследующий порядок расположения локусов (расстояний на усредненной по полу карте Kosambi cM): Sw2443/Swr2516-0, 3-IGF2-14,9-Sw2623-10,3-Sw256. He наблюдалось рекомбинантов между Sw2443 и Swr2516, и предположение о проксимальной локализации IGF2 по отношению к этим локусам основано на одном рекомбинанте, дающем подтверждение lod-величины, равной 0,8 для указанного порядка. Наиболее дистальный маркер в более раннем исследовании QTL авторов настоящего изобретения, Sw256, локализован примерно на расстоянии 25 cM от дистального конца группы сцепления.

QTL-анализы на признаки конституции животного, жирности, качества мяса и интенсивности роста осуществляли с использованием новой карты хромосомы 2 с применением статистической модели тестирования на возможное присутствие эффекта импринтинга, ожидаемого для IGF2. Было получено явное подтверждение того, что экспрессированный отцовский QTL расположен на самом дальнем конце 2р (Фиг.2; Таблица 1). QTL оказывает очень большое влияние на содержание постного мяса в окороке и объясняет неожиданно обнаруженную 30% остаточную фенотипическую дисперсию в F₂-популяции. Было также отмечено большое влияние на площадь наиболее длинной спинной мышцы, на массу сердца и на толщину хребтового жира (подкожного жира). Наблюдалось умеренное влияние на один признак качества мяса, коэффициент отражения. QTL не оказывает большого влияния на брюшной жир, массу при рождении, рост, массу печени, почки или селезенки (данные не приводятся). Аллель в данном QTL у свиньи крупной белой породы, по сравнению с аллелем дикой свиньи, ассоциирован с большей мышечной массой и меньшей толщиной хребтового жира, что соответствует различию между этой породой и популяцией диких свиней. Сильно выраженный эффект импринтинга, наблюдаемый для всех ассоциированных с ним признаков, свидетельствует об участии одного каузативного локуса. Плейотропное влияние на массу скелетной мышцы и размер сердца является, очевидно, адаптивным с физиологической точки зрения, поскольку большая мышечная масса требует большего сердечного выброса. Явная экспрессия отцовского QTL была проиллюстрирована методом наименьших квадратов и эта экспрессия разделяет последующую популяцию на два класса по унаследованному от отца аллелю (Таблица 1). Заслуживает внимания тот факт, что имеется незначительная тенденция в направлении менее экстремальных значений для двух гетерозиготных классов, а в частности, для оцениваемого влияния на площадь самой длинной хребтовой мышцы. Это может быть случайностью, но может иметь и биологическое объяснение, заключающееся, например, в том, что происходит некоторая экспрессия унаследованного от матери аллеля, или в том, что присутствует сцепленнный, не подвергнутый импринтингу QTL с малым влиянием на рассматриваемые признаки.

Несомненно, что QTL, сцепленный с IGF2, и QTL, сцепленный с FAT1, на хромосоме 4^1,9 представляют собой два локуса с наибольшим влиянием на конституцию животного и на сегрегацию по жирности у интеркроссов, происходящих от дикой свиньи. IGF2-QTL контролирует, главным образом, мышечную массу, тогда как FAT1 оказывает большое влияние на отложение жира, включая брюшной жир, то есть признак, на который не влияет IGF2-QTL (фиг.2). Было показано, что отсутствует какое-либо значительное взаимодействие между двумя локусами и что эти локусы контролируют возникновение очень большой доли остаточной фенотипической дисперсии в F₂-поколении. Модель, включающая оба QTL, объясняет дисперсию в 33,1% для процентного содержания постного мяса в окороке, 31,3% для процентного содержания постного мяса и кости в хребте и 26,2% для средней глубины хребтового жира (по сравнению с моделью, включающей только эффекты хромосомы 2, Таблица 1). Указанные два QTL должны играть основную роль в селекционном ответе при отборе на увеличение постного мяса и мышечной массы у домашних свиней крупной белой породы.

В высокой степени значимое нарушение сегрегации наблюдалось в IGF2-области (избыток аллелей, происходящих от дикой свиньи), как показано в Таблице 1 (χ²=11,7, ст.св.=2, Р=0,003). Частота JGF2-аллелей, происходящих от дикой свиньи, составляла 59% в противоположность ожидаемым 50% и была вдвое большей у гомозигот "дикой свиньи", чем у гомозигот "крупной белой". Это отклонение наблюдалось в отношении всех трех локусов на дистальном конце, а поэтому не является ошибкой типирования. Этот эффект также наблюдался и в отношении других локусов, но степень такого нарушения снижалась в зависимости от расстояния до дистального конца хромосомы. У 12-недельных животных были взяты пробы крови для получения ДНК, и авторы настоящего изобретения убеждены, что указанное отклонение от ожидаемых менделевских соотношений присутствовало при рождении, поскольку число животных, потерянных до взятия проб, не было достаточным для индуцирования отклонения такой величины. Ни один из более чем 250 локусов, проанализированных в данной родословной, не обнаруживал аналогичного заметного нарушения сегрегации (L. Andersson, не опубликовано). Нарушение сегрегации не показывало эффекта импринтинга, поскольку частоты обоих реципрокных типов гетерозигот были идентичными (таблица 1). Это не исключает возможности, что QTL-эффекты и нарушение сегрегации контролируются тем же самым локусом. Указанное нарушение сегрегации может быть обусловлено мейотическим дрейфом, благоприятствующим экспрессии полученного от отца аллеля в процессе гаметогенеза, поскольку F₁-родители все осеменены самцами дикой свиньи. Другой возможностью является то, что нарушение сегрегации может быть вызвано кодоминантной экспрессией материнского и отцовского аллеля в некоторых тканях и/или во время критического периода развития эмбриона. Сообщалось, что экспрессия двухаллельного IGF2 происходит до определенной степени во время развития человека^10,11, при этом интересно отметить, что сильное влияние фона родительского вида на экспрессию IGF2 было недавно обнаружено у кроссов, полученных путем скрещивания Mus musculus и Mus spretus¹². Интересно также отметить, что у человека полиморфизм VNTR в гене инсулина, который очень тесно сцеплен с IGF2, ассоциируется с его весом при рождении¹³. Возможно, что сцепленный с IGF2 QTL у свиней оказывает незначительное влияние на массу при рождении, но в данных, полученных авторами изобретения, этот эффект является абсолютно незначимым (фиг.2) и отсутствуют какие-либо свидетельства об эффекте импринтинга.

Это исследование внесло значительный вклад в общую информацию о биологической важности локуса IGF2. Важная роль IGF2 для пренатального развития хорошо задокументирована с использованием анестезированных мышей¹⁴, а также исходя из его каузативной роли в синдроме Беквита-Видемана¹⁵. Настоящее изобретение продемонстрировало важную роль ТСР2-области также для постнатального развития. Следует особо подчеркнуть, что интеркроссы, полученные авторами от аутбредных популяций, являются особенно подходящими для детекции QTL, обладающих зависимым от родительского происхождения влиянием на многофакторный признак. Это обусловлено тем, что множественные аллели (или гаплотипы) являются сегрегирующими, и авторы изобретения могут определить, получает ли гетерозиготное F₂-животное аллель дикой свиньи от F₁-самца или самки. Вполне возможно, что в исследованиях, относящихся к человеку, или у интеркроссов, полученных от скрещивания имбредных популяций грызунов, не уделялось внимания сегрегации полученного от отца экспрессированного и сцепленного с IGF2 QTL, влияющего на такой признак, как ожирение, из-за соответствующего планирования эксперимента или статистической обработки данных. Эффект импринтинга не может быть обнаружен в интеркроссах между двумя инбредными линиями, поскольку в каждом локусе только два аллеля являются сегрегирующими. Следовательно, результаты, полученные авторами настоящего изобретения, имеют большое значение для дальнейших анализов на связь между генетическим полиморфизмом в области инсулин-IGF2 и диабетом типа I¹⁶, ожирением¹⁷ и дисперсией веса при рождении¹³ у человека, а также для генетического разделения комплексных признаков с использованием в качестве моделей инбредных грызунов. Большим толчком для генерирования интеркроссов между домашней свиньей и ее дикими предками было использование возможностей картирования и идентификации мажорных локусов, отвечающих за селекцию. Авторами настоящего изобретения было показано, что два отдельных QTL на хромосоме 2 (настоящее исследование) и хромосоме 4^1,2 объясняют до одной трети фенотипической дисперсии для признака содержания постного мяса у F₂-поколения. Это является большим отклонением от предположения, лежащего в основе классической бесконечно малой модели в теории количественной генетики, а именно, предположения, что указанные количественные признаки контролируются бесконечным числом локусов, каждый из которых имеет бесконечно малый эффект. Если большая доля генетического различия между двумя расходящимися популяциями (например, дикой свиньи и крупной белой) контролируется несколькими локусами, то можно предположить, что отбор должен приводить к быстрой фиксации аллелей QTL со значительными эффектами, приводящими к селекционному плато. Однако, это не наблюдалось в программах по разведению животных или в экспериментах по селекции, где были получены, в основном, хорошие персистентные продолжительные селекционные ответы, при условии, что эффективная численность популяции была достаточно большой¹⁸. Возможное объяснение этого парадокса состоит в том, что аллели QTL, контролирующие большую долю генетических различий между двумя популяциями, могут иметь несколько последовательных мутаций, и эти мутации могут присутствовать в том же самом гене и в нескольких тесно сцепленных генах, влияющих на тот же самый признак. Было подтверждено, что новые мутации вносят значительный вклад в продолжительный селекционный ответ¹⁹, но о геномном распределении таких мутаций ничего не известно.

Поиск одной каузативной мутации представляет собой парадигму для анализов на генетические дефекты у мышей и моногенетические нарушения у человека. Авторы настоящего изобретения высказали предположение, что это не может иметь место в случае локусов, в отношении которых ведется отбор для большого числа поколения домашних животных, приплода или природных популяций. Эта гипотеза предполагает присутствие множественных аллелей в мажорном QTL. Она нашла некоторое подтверждение в результате проведенной недавно авторами настоящего изобретения характеризации изменения цвета кожного покрова свиньи. Авторами настоящего изобретения было обнаружено, что оба аллеля для доминантной белой и для черно-пятнистой масти отличаются от соответствующих аллелей дикого типа по крайней мере двумя последовательными мутациями с фенотипическими эффектами в локусах KIT и MC1R, соответственно^20,21. В этой связи особенно интересным является тот факт, что в сопровождающем примере, авторами был идентифицирован третий аллель в сцепленном с IGF2 QTL. Влияния на мышечную массу трех аллелей выстраиваются в том же самом порядке, в котором они были обнаружены, то есть свиньи "пьетрен" являются более мускулистыми, чем свиньи крупной белой породы, которые, в свою очередь, имеют большее содержание нежирного мяса, чем дикая свинья.

Имеются все основания сделать вывод, что IGF2 является каузативным геном для рассматриваемого здесь локуса QTL. Во-первых, имеется абсолютное соответствие его локализации на карте (фиг.2). Во-вторых, было показано, что отцовский IGF2 экспрессируется у мышей, человека, а теперь и у свиней по тому же типу, что и QTL. Существует несколько других прошедших импринтинг генов, находящихся в близком соседстве с IGF2 у мышей и человека (Mash2, INS2, Н19, KVLQT1, TAPA1/CD81 и CDKN1C/p57^KIP2), но в тканях взрослого организма экспрессируется только отцовский IGF2²². Авторы настоящего изобретения полагают, что этот локус дает уникальную возможность для молекулярной характеристики QTL. Явная отцовская экспрессия может быть использована для исключения генов, не обнаруживающих этот тип наследования. Кроме того, присутствие аллельной серии должно уменьшать трудности идентификации между каузативными мутациями и сцепленным нейтральным полиморфизмом. Авторами настоящего изобретения было уже показано, что не существует различий в кодирующих последовательностях между аллелями IGF2 от свиней породы "Пьетрен" и свиней породы "крупная белая", что дает основание предположить, что указанные каузативные мутации присутствуют в регуляторных последовательностях. Очевидной ступенью является секвенирование всего гена IGF2 и его множественных промоторов из трех популяций. Недавно сделанное сообщение о том, что полиморфизм VNTR в промоторной области гена инсулина (INS) влияет на экспрессию IGF2²³, дало основание предположить, что указанные каузативные мутации могут находиться на значительном расстоянии от кодирующей последовательности IGF2.

Эти результаты имеют достаточно важное значение для промышленного разведения свиней. Они показали, что генетический импринтинг не является лишь объектом эзотерического академического обсуждения, а должен быть рассмотрен с точки зрения его практического применения в селекционных программах. Обнаружение трех различных аллелей у популяций пород "дикая свинья", "белая крупная" и "пьетрен" указывает на то, что в промышленных популяциях наблюдается сегрегация других аллелей в сцепленном с IGF2 QTL. Экспрессия отцовского QTL облегчает его детекцию с использованием больших семейств отцовских полусибсов, поскольку вкладом от самок можно пренебречь. QTL используют для повышения содержания постного мяса путем отбора с помощью маркеров внутри популяций или путем интрогрессии с помощью маркера, при которой одна популяция приобретает предпочтительные аллели от другой популяции.

ПРИМЕР 2: Интеркроссы "Пьетрен х крупная белая"

Методы

Материалы по родословной: Материал по родословной, используемый для картирования QTL, выбирали из ранее описанной родословной F₂-потомства "пьетрен × крупная белая", содержащей >1800 особей^6,7. Для сбора этого F₂-материала 27 хряков породы "пьетрен" скрещивали с 20 свиноматками породы "крупная белая" с получением F₁-поколения, включающего 456 особей. 31 F₁-хряка скрещивали с неродственными 82 F₁-свиноматками в 1984-1989 г., в результате чего получали всего 1862 особей F₂-потомства. F₁-хряков скрещивали, в среднем, с 7 свиноматками, а F₁-свиноматок скрещивали, в среднем, с 2,7 хряками. Среднее потомство на одного хряка составляло 60, а на одну свиноматку - 23.

Фенотипические данные:

(i) Сбор данных: У F₂-поколения было зарегистрировано всего 21 различный фенотип^6,7. Этими фенотипами являются:

- пять признаков роста: масса при рождении (г), масса после отъема (кг), масса молодняка (кг), масса после откорма (кг) и среднесуточный прирост массы (ССПМ; кг/день; за период от начала выращивания молодняка до конца откорма);

- два параметра измерения пропорции туловища: длина туловища (см) и оценка экстерьера (0-10 баллов; см. ссылку 6);

- десять измерений конституции туши, полученные путем рассечения охлажденных туш через 24 часа после убоя. Эти измерения включают измерение мышечной массы: % окорока (масса окорока/масса туши), % спинной части (масса спинной части/масса туши), % лопаточной части (масса лопаточной части/масса туши), % мясной части (% окорока +% спинной части +% лопаточной части); и измерение жирности: средняя толщина хребтового жира (ТХЖ; см), % хребтового жира (масса хребтового жира/масса туши), % свиной грудинки (масса свиной грудинки/масса туши), % свиной щековины (масса щековины/масса туши), и "% жирной фракции" (% хребтового жира +% грудинки +% листового жира +% щековины);

- четыре измерения качества мяса: рН_LD1 (самой длинной спинной мышцы (Longissimus dorsi, через 1 час после убоя), рН_LD24 (Longissimus dorsi, через 24 часа после убоя), pH_G1 (Gracillis, через 1 час после убоя), рН_G24 (Gracillis, через 24 часа после убоя).

(ii) Обработка данных: Отдельные фенотипы предварительно корректировали на фиксированные эффекты (самец, самка, генотип CRC, пол, сезон года, факт рождения) и коварианты (размер помета, масса при рождении, масса при отъеме, масса молодняка, масса после откорма), которые оказывают значительное влияние на соответствующий признак. Параметры, включенные в данную модель, были отобраны путем ступенчатой регрессии.

Определение генотипа маркера: Пары праймеров, используемые для ПЦР-амплификации микросателлитных маркеров, были описаны в литературе¹⁹. Определение генотипа с помощью маркеров осуществляли, как описано ранее²⁰. Генотипы в локусах CRC и MyoD определяли стандартными методами, описанными выше^1,12, LAR-тест на SNP Igf2 проводили, как описано Baron и др.²¹ с использованием пары праймеров для ПЦР-амплификации

(5'-CCCCTGAACTTGAGGACGAGCAGCC-3';

5'-ATCGCTGTGGGCTGGGTGGGCTGCC-3')

и серии из трех праймеров для LAR-стадии

(5'-FAM-CGCCCCAGCTGCCCCCCAG-3';

5'-HEX-CGCCCCAGCTGCCCCCCAA-3'; 5'-CCTGAGCTGCAGCAGGCCAG-3').

Конструирование карты: Карты маркеров конструировали с использованием версий TWOPOINT, BUILD и CHROMIC пакета программ CRIMAP²². Для использования этого программного пакета семейства полных сибсов, родственных по отцу или матери, были разъединены и независимо обработаны. При этом некоторая потенциально полезная информация не учитывалась, что давало, однако, несмещенные оценки частоты рекомбинации.

Картирование QTL:

(i) Картирование QTL по Менделю: Стандартное картирование QTL осуществляли с использованием многоточечного метода максимального правдоподобия. Используемая модель предполагала одну сегрегацию QTL на хромосому и фиксацию альтернативных аллелей QTL в соответствующих родительских линиях, "пьетрен" (Р) и "крупная белая" (LW). Исходя из того факта, что родительское происхождение F₁-хромосом не могло быть определено, то для выявления отсутствия генотипов родительской генерации необходимо разработать специальную программу для анализа. При использовании традиционной стратегии "интервального картирования" гипотетический QTL перемещают по маркерной карте с использованием определенных пользователем стадий. В каждом положении правдоподобие (L) данных родословной вычисляли следующим образом:

Р или правая хромосома Р), имеется всего 2^r комбинаций для г родителей F1.

i-ого потомства F2, по четырем возможным генотипам QTL:

Р/Р, P/LW, LW/P и LW/LW.

Р(G/M_i, θ, ϕ)M_i: генотип маркера i-того F2-поколения и его F1-родителей, (ii): вектор частоты рекомбинации между смежными маркерами и между гипотетическим QTL и его фланкирующими маркерами, и (iii): θ - рассматриваемая комбинация маркер - QTL-фаза у F1-родителей. При подсчете этой вероятности предполагается, что частота рекомбинации и фаза сцепления маркера у F1-родителей являются известными. Оба эти параметра определяли с использованием CRIMAP в фазе построения карты (см.выше).

P(y_i/G)y_i) - вероятность для i-го потомства с учетом рассматриваемого генотипа QTL. Эта вероятность вычисляется исходя из нормальной функции плотности.

G - фенотипическое среднее для рассматриваемого QTL-генотипа (PP, PL, LP или LL), а σ² - остаточная дисперсия, при этом считается, что σ² одинакова для всех четырех QTL-генотипических классов. Величины μ_PP, μ_PL=μ_LP, μ_LL, и σ², максимизирующие L, были определены с использованием стандартной программы оптимизации GEMINI²³. Правдоподобие, полученное при этой альтернативной гипотезе H₁, сравнивали с правдоподобием, полученным при нулевой гипотезе Н_о отсутствия QTL, при которой фенотипические средние по четырем QTL-генотипическим классам должны быть идентичными. Разница между логарифмами соответствующих правдоподобий дает логарифм величины отношения вероятностей (lod-величину), что позволяет получить данные о предпочтительности QTL в соответствующем положении на карте.

(ii) Порог значимости: Согласно Lander & Botstein²⁴, пороговые значения логарифма величины отношения вероятности (T), ассоциированные с выбранным по геному уровнем значимости, вычисляли следующим образом:

,

где С соответствует числу хромосом (=19), G соответствует длине генома в Морганах (=29), а χ² ₂(4,6T) означает "один минус интегральная функция распределения для распределения хи-квадрат с 2 степенями свободы (ст.св.)". Предполагается, что одна точка 21n(LR) имеет распределение хи-квадрат с двумя степенями свободы, поскольку авторы проводили подбор как по аддитивной, так и по доминантной компоненте. Для учета того факта, что авторы проводили анализ по множеству признаков, уровни значимости корректировали с применением поправки Бонферони, соответствующей эффективному числу независимых признаков, которое было проанализировано. По оценке, проводимой методом, описанным Spelman и др., это эффективное число составляло 16²⁵. Тем не менее, это позволило авторам установить порог lod-величины, ассоциированный с экспериментальным допустимым уровнем значимости 5%, равный 5,8. В попытке подтвердить идентифицированный QTL в независимом образце был использован тот же самый метод, однако с установлением С=1, G=25 cM, и с поправкой 4,5 для данного анализа независимых признаков (поскольку в этом образце анализировали только шесть признаков). Это давало порог lod-величины, ассоциированный с ошибкой типа I 5%, равный 2.

(iii) Тестирование для прошедшего импринтинг QTL: Для проведения теста на прошедший импринтинг QTL авторы настоящего изобретения предположили, что только аллели QTL, передаваемые родителем данного пола, должны влиять на фенотип, а аллели, передаваемые другим родителем, являются "нейтральными". Правдоподобие родословных данных при этой гипотезе вычисляли с использованием уравнения 1. Однако, для вычисления P(y_i/G) фенотипическое среднее по четырем QTL-генотипам было установлено при μ_PP=μ_PL=μ_P и μ_PL=μ_LL=μ_L для теста на QTL, для которого эспрессируется только отцовский аллель, и при μ_PP=μ_LP=μ_p и μ_PL=μ_LL=μ_L для теста на QTL, для которого эспрессируется только материнский аллель. В этой системе обозначений предполагается, что первый нижний индекс относится к отцовскому аллелю, а второй нижний индекс относится к материнскому аллелю. Гипотеза Н_о определена как нулевая гипотеза и предполагает отсутствие QTL, гипотезу H₁ проверяют на присутствие QTL, наследуемого по закону Менделя; гипотезу H₂ проверяют на присутствие отцовского экспрессированного QTL; а гипотезу Н₃ проверяют на присутствие материнского экспрессированного QTL.

ОТ-ПЦР: Полную РНК экстрагировали из скелетной мышцы по методу Chirgwin и др.²⁶. ОТ-ПЦР осуществляли с использованием набора для ПЦР Gen-Amp PCR (Per kin-Elmer). ПЦР-продукты очищали с использованием набора для очистки QiaQuick PCR Purification kit (Qiagen) и секвенировали с помощью реакции секвенирования по методу обрыва цепи с использованием красителя Dye terminator Cycle Sequencing Ready Reaction (Perkin-Elmer) и автоматического секвенатора АВ1373.

В примере 2 авторы изобретения описывают идентификацию QTL, оказывающего большое влияние на мышечную массу и на отложение жира при картировании свиной хромосомы 2р1.7. QTL явно обнаруживал родительский импринтинг, что давало все основания предполагать о присутствии локуса Igf2.

Интеркроссы "пьетрен × крупная белая", имеющие 1125 F₂-потомков, получали как описано в литературе^6,7. Породы "пьетрен" и "крупная белая" отличаются рядом экономически важных фенотипов. Пьетрены славятся своей исключительно высокой мышечной массой и постностыо мяса⁸ (фиг.2), тогда как порода "крупная белая" известна своими высокими показателями роста. Для всего F₂-потомства были проведены измерения двадцати одного различного фенотипа по (i) показателю роста (5), (ii) мышечной массе (6), (iii) отложению жира (6) и (iv) качества мяса (4).

Для картирования QTL, ответственного за генетическое различие между этими породами, авторы настоящего изобретения с использованием микросателлитных маркеров сканировали весь геном на исходном образце, взятом от 677 F₂-особей. Анализ хромосомы 2 свиньи с использованием многоточечного алгоритма ML, выявил высокое значение lod-величины (вплоть до 20) для шести из 12 измерений фенотипов по мышечной массе и отложению жира на дистальном конце короткого плеча хромосомы 2 (фиг.3а). Для остальных шести фенотипов были получены положительные значения lod-величины, однако они не достигали порога значимости для генома (=5%). Для подтверждения этих результатов остальные образцы 355 F₂-потомства были генотипированы по пяти наиболее дистальным маркерам 2р и был проведен анализ QTL на данные признаки, в результате чего в первом анализе были получены самые высокие значения lod-величины. lod-Величины варьировались от 2,1 до 7,7, что явно подтверждало присутствие главного QTL в этой области. В таблице 2 представлены соответствующие ML-оценки для трех генотипических средних, а также соответствующая остаточная дисперсия.

"Роспись" разнонаправленной хромосомы позволила установить соответствие между SSC2p и HSA11pter-q13^9,10. Для картирования хромосомы человека в этой области имеются по крайней мере два серьезных гена-кандидата: миогенный основной фактор "спираль-петля-спираль", MyoD, карта для HSA11p15.4, и Igf2, карта HSA11p15.5. MyoD является хорошо известным ключевым регулятором миогенеза и одним из первых миогенных маркеров, необходимых для переключения в процессе развития¹¹. Ранее описанный полиморфизм амплифицированной последовательности в свином гене MyoD¹² обнаруживал сегрегацию в исследуемом авторами F₂-материале, который был полностью генотипирован по этому маркеру. Анализ на сцепление указывает на положение гена MyoD в интервале SW240-SW776 (вероятности >1000), а следовательно не накрывает значение lod-2 и выходит за пределы доверительного интервала для QTL (фиг.1). Известно, что Igf2 способствует усилению как пролиферации, так и дифференцировки миобластов in vitro¹³, и вызывает гипертрофию мышц при сверхэкспрессии in vivo. Исходя из опубликованной кДНК-последовательности¹⁴ печени взрослой свиньи, авторами настоящего изобретения были сконструированы пары праймеров, которые позволили им амплифицировать всю кодирующую последовательность Igf2 с 222 п.н. лидерной последовательности и 280 п.н. трейлерной последовательности, происходящей от кДНК скелетной мышцы взрослой свиньи. Секвенирование ОТ-ПЦР-продуктов, полученных от свиней пород "пьетрен" и "крупная белая", свидетельствовало о том, что кодирующие последовательности были идентичны для обеих этих пород и опубликованной последовательности. Однако, в лидерной последовательности, соответствующей экзону 2 человека, была обнаружена транзиция G-A (фиг.4). Для указанного единичного нуклеотидного полиморфизма (SNP) авторами настоящего изобретения был разработан тест-скрининг, основанный на реакции лигирования-амплификации (LAR), что позволило им определить генотип имеющегося у них материала по родословной. Исходя из полученных данных, было показано, что Igf2 локализован совместно с микросателлитным маркером с SWC9 (=0%), а следовательно он локализован приблизительно в 2 сантиморганах от наиболее вероятного положения QTL и находится в 95%-ном доверительном интервале для QTL (фиг.1). Последующий анализ последовательностей продемонстрировал, что микросателлитный маркер SWC9 фактически расположен в 3'UTR гена Igf2. При рассмотрении всех имеющихся данных сравнительного картирования для локусов PGA и FSH эти результаты дают основание предположить о наличии интерстициальной инверсии хромосомного сегмента, содержащего MyoD, но не Igf2, который остается телометрическим в обоих видах.

Следовательно, Igf2 является сильным позиционным аллелем, обладающим наблюдаемым QTL-эффектом. Известно, что у человека и мыши Igf2 должен подвергаться импринтингу и экспрессироваться исключительно из отцовского аллеля в нескольких тканях¹⁵. Анализ кДНК скелетной мышцы свиней, гетерозиготных по SNP и/или по SWC9, показал, что тот же самый импринтинг наблюдается в этой ткани также у свиньи (фиг.4). Следовательно, если Igf2 ответственен за наблюдаемый эффект и если известно, что экспрессируется только отцовский аллель Igf2, то можно предположить, что (i) отцовский аллель, переданный хряками F1 (Р или LW), должен влиять на фенотип F2-потомства,

(ii) материнский аллель, переданный свиноматками F1 (Р или LW), не должен влиять на фенотип F2-потомства и (iii) правдоподобие этих данных должно быть очень высоким для модели бимодальной (1:1) F2-популяции, отсортированной по унаследованному отцовскому аллелю по сравнению со стандартной "менделевской" моделью тримодальной (1:2:1) F2-популяции. Программы по картированию QTL были адаптированы так, чтобы можно было проверить соответствующие гипотезы. Н_о означает нулевую гипотезу, предполагающую отсутствие QTL, H₁ проверяют на присутствие "менделевского" QTL, H₂ проверяют на присутствие экспрессированного отцовского QTL, а Н₃ проверяют на присутствие экспрессированного материнского QTL.

Полученные результаты систематизированы на фиг.3. На фиг.3а, 3b и 3с соответственно показаны кривые lod-величины, соответствующие log₁₀ (Н₂/Н₀), log₁₀ (Н₃/Н_о) и log₁₀ (H₂/H₁). Как можно видеть, в высокой степени значимые lod-величины были получены при проверке гипотезы о присутствии экспрессированного отцовского QTL, тогда как при исследовании хромосом, переданных свиноматками, не было получено никаких данных, свидетельствующих о сегрегации QTL. Кроме того, гипотеза о присутствии экспрессированного отцовского QTL является значительно более правдоподобной (log₁₀(H₂/H₁)>3), чем гипотеза о присутствии "менделевского" QTL по всем оцениваемым признакам. Тот факт, что та же самая тенденция наблюдалась для всех признаков, свидетельствует о том, что, по всей вероятности, один и тот же ген, прошедший стадию импринтинга, ответственен за эффекты, наблюдаемые для различных признаков. В таблице 2 представлены фенотипические средние ML для потомства F2, отсортированного по унаследованному отцовскому аллелю QTL. Следует отметить, что, при осуществлении этих анализов с моделью "менделевского" QTL, аллели свиней породы "пьетрен" и "крупная белая", очевидно, ведут себя по аддитивному типу, то есть гетерозиготный генотип обнаруживал фенотипическое среднее, точно соответствующее срединной точке между двумя гомозиготными генотипами. В случае импринтинга QTL можно сделать совершенно точные предсказания, поскольку половина гетерозиготного потомства будет, как ожидается, иметь аллель Р, унаследованный от отца, а другая половина будет иметь аллель LW.

Следовательно, эти данные подтверждают гипотезу авторов о передаче прошедшего импринтинг гена, экспрессированного исключительно от отцовского аллеля. Тот факт, что идентифицированный сегмент хромосомы точно совпадает с подвергнутым импринтингу доменом, обнаруженным у человека и мыши, со всей очевидностью указывает на присутствие ортологичной области у свиней. При картировании этого домена, было зарегистрировано по крайней мере семь прошедших импринтинг генов (Igf2, Ins2, H19, Mash2, p57^KIP2, K_VLQTL1 и TDAG51) (см. 15 и Andrew Feinberg, личное сообщение). Из этих генов были экспрессированы только отцовские Igf2 и Ins2. Хотя авторы настоящего изобретения не могут исключить тот факт, что наблюдаемый QTL-эффект обусловлен еще неидентифицированным, прошедшим импринтинг геном, присутствующим в этой области, однако его влияние на миогенез, наблюдаемое in vitro и in vivo¹³, со всей очевидностью указывает на участие Igf2. В частности, мышечная гипертрофия, наблюдаемая у трансгенных мышей со сверхэкспрессией Igf2 от мышцеспецифического промотора, подтверждает эту гипотезу (Nadia Rosenthal, личное сообщение). Следует отметить, что недавно было показано, что аллельные варианты INS VNTR ассоциируются с весом при рождении у человека¹⁶, и было показано, что тот же самый VNTR влияет на уровень экспрессии Igf2¹⁷.

Наблюдение того же самого QTL-эффекта у интеркроссов "крупная белая × дикая свинья" свидетельствует о существовании серии по крайней мере из трех различных функциональных аллелей. Более того, предварительные данные, полученные исходя из сегрегационного анализа, проводимого с помощью маркеров, указывают на остаточную сегрегацию в этом локусе в популяции "пьетрен" (данные не приводятся). Частота этой серии аллелей не может быть оценена при индетификации каузального полиморфизма, который, если учесть количественную природу наблюдаемого эффекта, вряд ли представляет собой большую альтерацию генов, а скорее представляет собой незначительные регуляторные мутации.

Влияние идентифицированного QTL на мышечную массу и отложение жира является действительно значительным и достигает той же величины, которая сообщалась для локуса CRC^6,7, хотя, очевидно, оно не связано с негативным эффектом по отношению к качеству мяса. Авторами настоящего изобретения было показано, что оба эти локуса объясняют примерно 50% различие пород "пьетрен" и "крупной белой" по мышечной массе и постности мяса. Данные о эффекте родительского происхождения, характеризующем этот локус, дают возможность для его оптимального использования в селекционных программах. Действительно, в настоящее время половина потомства, получаемого от широко распространенных промышленных кроссбредных хряков "пьетрен × крупная белая", наследует нежелательный аллель крупной белой породы, что приводит к значительным экономическим потерям.

QTL, описанный в настоящей работе, является вторым примером гена, влияющего на развитие мышц у тех видов крупного рогатого скота, которые обнаруживают неменделевский характер наследования. Действительно, авторами настоящего изобретения было ранее показано, что локус каллипига (связанный с качественным признаком удвоения мышц) характеризуется полярной сверхдоминантностью, при которой только гетерозиготные особи наследуют мутацию CLPG в результате экспрессии отцовского фенотипа удвоения мышц⁵. Это свидетельствует о том, что эффекты родительского происхождения, обнаруживаемые генами, ответственными за продуктивные признаки у крупного рогатого скота, могут быть относительно общими.

ПРИМЕР 3: Конструирование сравнительной последовательности IGF2 и фланкирующих локусов у свиней.

Настоящее изобретение относится к картированию прошедшего импринтинг QTL, оказывающего значительное влияние на мышечную массу в локусе IGF2 свиньи, и к использованию QTL в качестве инструмента при селекции с помощью маркера. Для точной "настройки" указанного инструмента в целях его использования при селекции с помощью маркеров, а также для дополнительной идентификации каузальных мутаций, авторами настоящего изобретения была дополнительно генерирована сравнительная последовательность, охватывающая всю последовательность IGF2 свиньи, а также последовательности фланкирующих генов.

Для этого авторы скринировали библиотеку ВАС свиньи с использованием зондов и идентифицировали два ВАС. Было обнаружено, что BAC-PIGF2-1 содержат гены INS и IGF2, а ВАС-PIGF2-2 содержат гены IGF2 и Н19. NotI-карта, а также относительное положение этих двух ВАС показано на фиг.5. BAC-PIGF2-1 секвенировали методом "дробового ружья" с использованием стандартных процедур и автоматических секвенаторов. Полученные последовательности собирали с использованием стандартного программного обеспечения, в результате чего получали всего 115 "контигов". Соответствующие последовательности представлены на фиг.6. Аналогичные исследования были проведены путем сравнения "контигов" свиней и ортологичных последовательностей человека. Значительная гомология наблюдалась для 18 контигов и эти результаты представлены на фиг.7.

Для BAC-PIGF2-2 NotI-фрагмент с 24 т.п.н., который не присутствовал в BAC-PIGF2-1, субклонировали и секвенировали методом с использованием транспозона EZ::TN и автоматических секвенаторов ABI. Полученные последовательности собирали с использованием программного продукта Phred-Phrap-Consed, в результате чего получали семь различных контигов (фиг.8). Последовательности контигов подвергали сопоставительному анализу с соответствующей ортологичной последовательностью человека с использованием программного пакета GCG для сравнения и построения точечных кривых. Соответствующие результаты представлены на фиг.9.

ПРИМЕР 4: Идентификация полиморфизма ДНК-последовательностей в IGF2 и фланкирующих локусах

Исходя из сравнительной последовательности, полученной как описано в Примере 1, авторы настоящего изобретения снова секвенировали часть IGF2 и фланкирующие локусы от геномной ДНК, выделенной из особей породы "пьетрен", "крупная белая" и "дикая свинья", что позволило идентифицировать полиморфизм ДНК-последовательности, как показано на фиг.10.

Описание чертежей

Фиг.1: Кривые статистического теста, полученные в анализах хромосомы 2 на QTL у интеркроссов дикая свинья/крупная белая. Графики представляют собой кривые отношения F при проверке гипотез на один QTL в данном положении хромосомы для указанных признаков. Карта маркеров с расстояниями между маркерами в сантиморганах в Kosambi представлена по оси X. Горизонтальные линии обозначают значимость для генома (Р<0,5) и предполагаемые уровни для признака постного мяса в окороке; аналогичные пороги значимости были получены и для других признаков.

Фиг.2: Свинья породы "пьетрен", характеризующаяся мышечной гипертрофией.

Фиг.3: Кривые lod-величин, полученные в случае картирования интеркроссов "пьетрен × крупная белая" для шести фенотипов, определяющих мышечную массу и отложение жира на хромосоме 2 свиньи. Показаны наиболее вероятные положения генов Igf2 для MyoD, определенных путем анализа на сцепление по отношению к карте микросателлитных маркеров. Н_о означает нулевую гипотезу, предполагающую отсутствие QTL, H₁ проверяют на присутствие "менделевского" QTL, H₂ проверяют на присутствие экспрессированного отцовского QTL, а Н₃ проверяют на присутствие экспрессированного материнского QTL. 3а: log₁₀ (H₁/H₀), 3b: log₁₀ (Н₂/Н₀), 3с: log₁₀ (Н₃/Н₀).

Фиг.4: А. Структура человеческого гена Igf2 по данным, представленным в ссылке 17, сопоставлялась с кДНК-последовательностью печени взрослой свиньи, описанной в п.16. Показано положение транзиции nt241(G-A) и микросателлита Swc9. В. Для иллюстрации моноаллельной (отцовской) экспрессии Igf2 в скелетной мышце и в печени 10-недельного плода были использованы соответствующие маркеры. ПЦР-амплификация полиморфизма nt241(G-A) и микросателлита Swc9 из геномной ДНК явно указывала на гетерозиготность плода, тогда как в кДНК печени (nt241(G-A) и Swc9) и в кДНК мышцы (Swc9) был обнаружен только отцовский аллель. Отсутствие ОТ-ПЦР-продукта для nt241(G-А) в фетальной мышце указывает на отсутствие в данной ткани мРНК, включающей экзон 2. Родительское происхождение фетальных аллелей было определено из генотипов хряков и свиноматок (данные не приводятся).

Фиг.5: NotI-рестрикционная карта указывает на относительное положение BAC-PIGF2-1 (включающие гены INS и IGF2) и BAC-PIGF2-2 (включающие гены IGF2 и Н19).

Фиг.6: Нуклеиновокислотные последовательности контигов 1-115, происходящие от BAC-PIGF2-1, которые были секвенированы методом "дробового ружья" с использованием стандартных процедур и автоматических секвенаторов.

Фиг.7: Сходство между контигами свиней, показанными на фиг.6 и ортологичными последовательностями у человека.

Фиг.8. Нуклеиновокислотные последовательности контигов 1-7, происходящие от BAC-PIGF2-2 (24 т.п.н. - NotI-фрагмент, который отсутствовал в BAC-PIGF2-1), которые были субклонированы и секвенированы методом с использованием транспозона EZ::TN и автоматических секвенаторов ABI.

Фиг.9: Сходство между контигами свиней, показанными на фиг.8, и ортологичными последовательностями у человека.

Фиг.10: Полиморфизм ДНК-последовательности в IGF2 и фланкирующих локусах от геномной ДНК, выделенной из особей пород "пьетрен", "крупная белая" и "дикая свинья". Библиография

Литература, цитируемая в примере 1

1. Andersson, L. et al., Genetic mapping of quantitative trait loci for growth and fatness in pigs. Science, 263, 1771-1774 (1994).

2. Knott, S.A. et al., Multiple marker mapping of quantitative trait loci in a cross between outbred wild boar and Large White pigs. Genetics, 149, 1069-1080 (1998).

3. Edfors-Lilja, I. et al., Mapping quantitative trait loci for immune capacity in the pig. Journal of Immunology, 161, 829-835 (1998).

4. Andersson-Eklund, L. et al., Mapping quantitative trait loci for carcass and meat quality traits in a wild boar x Large White intercross. Journal of Animal Science, 76, 694-700 (1998).

5. Fronicke, L., Chowdhary, В.Р., Scherthan, H. & Gustavsson, I. A comparative map of the porcine and human genomes demonstrates ZOO-FISH and gene mapping-based chromosomal homologies. Mamm.Genome, 7, 285-290 (1996).

6. Alexander, L.J. et al., Physical assignments of 68 porcine cosmids and lambda clones containing microsatellites. Mammalian Genome, 7, 368-372 (1996).

7. Rohrer, G.A. et al., A comprehensive map of the porcine genome. Genome Research, 6, 371-391 (1996).

8. Marklund, L. et al., A comprehensive linkage map of the pig based on a wild pig-Large White intercross. Anim. Genet., 27, 255-269 (1996).

9. Marklund, L., Nyström, P.E., Stern, S., Andersson-Eklund, L. & Andersson, L. Quantitative teait loci for fatness and growth on pig chromosome 4. Heredity, In press (1998).

10. Ohlsson, R., Hedborg, F., Holmgren, L., Walsh, С. & Ekstrom, T.J. Overlapping patterns of IGF2 and H19 expression during numan development: biallelic IGF2 expression correlates with a lack of H19 expression. Development, 120, 361-368 (1994).

11. Ekström, T.J., Cui, H., Li, X. & Ohlsson, R. Promoter-specific IGF2 imprinting status and its plasticity during human liver development. Development, 121, 309-316 (1995).

12. Hemberger, M. et al., H19 and Igf2 are expressed and differentially imprinted in neuroectoderm-derived cells in the mouse brain. Dev.Genes Evol., 208, 393-402 (1998).

13. Dunger, D.B. et al., Association of the INS VNTR with size at birth. Nature Genetics, 19, 98-100 (1998).

14. DeChiara, T.M., Robertson, E.J. & Efstratiadis, A. Paretal imprinting of the mouse insulin-like growth factor II gene. Cell, 64, 849-859 (1991).

15. Sun, F.L., Dean, W.L., Kelsey, G., Allen, N.D. & Reik, W. Transactivation of Igf2 in a mouse model of Beck-with-Wiedemann syndrome. Nature, 389, 809-815 (1997).

16. Davies, J.L. et al., A genome-wide search for human type 1 diabetes susceptibility genes. Nature, 371, 130-136 (1994).

17. O'Dell, S.D. et al., Apal polymorphism in insulin-like growth factor II (IGF2) gene and weight in middle-aged males. International Journal of Obesity, 21, 822-825 (1997).

18. Falconer, D.S. & Mackay, T.F.C. Introduction to Quantitative Genetics, (Longman, England, 1996).

19. Hill, W.G. Rates of change in quantitative traits from fixation of new mutations. Proc.NatI.Acad.Sci.USA, 79, 142-145 (1982).

20. Marklund S. et al., Molecular basis for the dominant white phenotype in the domestic pig. Genome Research, 8, 826-833 (1998).

21. Kijas, J.M.H. et al., Melanocortin receptor 1 (MC1R) mutations and coat color in the pig. Genetics, In press (1998).

22. Beechey, C.V., personal communication (1998).

23. Paquette, J., Giannoukakis, N., Polychronakos, C., Vafiadis, P. & Deal, C. The INS 5' variable number of tandem repeats is associated with IGF2 expression in humans. Journal of Biological Chemistry, 273, 14158-14164 (1998).

24. Sambrook, J., Fritsch, E.F. & Maniatis, T. Molecular cloning: A laboratory manual., (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1989).

25. Chowdhary, В.P., de la Sena, C., Harbitz, I., Eriksson, L. & Gustavsson, I. FISH on metaphase and interphase chromosomes demonstrates the physical order of the genes for GPI, CRC and LIFE in pigs. Cytogenetics Cell Genetics, 71, 175-178 (1995).

26. Green, P., Falls, К. & Crook, S. Documentation for CRI-MAP, version 2.4., (Washington University School of Medicine, St.Louise, МО, 1990).

27. Haley, C.S., Knott, S.A. & Elsen, J.M. Mapping quantitative trait loci in crosses between outbred lines using least squares. Genetics, 136, 1195-1207 (1994).

28. Churchill, G.A. & Doerge, R.W. Empirical threshold values for quantitative trait mapping. Genetics, 138, 963-971 (1994).

29. Anonymous. SAS version 6.10, (SAS Institute Inc., Cary, NC, 1990).

Литература, цитируемая в примере 2

1. Fuji, J.; Otsu, К.; Zorzato, F.; Deleon, S.; Khanna, V.K.; Weiler, J.E.; O'Brien, P.J.; MacLennan, D.H. (1991). Identification of a mutation in the porcine ryanodine receptor associated with malignant hyperthermia. Science, 253: 448-451.

2. MacLennan, D.H. & Phillips, M.S. (1993). Malignant hyperthermia. Science, 256: 789-794.

3. Grobet, L; Royo Martin, L.J.; Poncelet, D.; Pirottin, D.; Brouwers, В.; Riquet, J.; Schoeberlein, A.; Dunner, S.; Menissier, F.; Massabanda, J.; Fries, R.; Hanset, R.; Georges, M. (1997). A deletion in the myostatin gene causes double-muscling in cattle. Nature Genetics, 17: 71-74.

4. Andersson, L.; Haley, C.S.; Ellegren, H.; Knott, S.A.; Johansson, M.; Andersson, K.; Andersson-Eklund, L., Edfors-Lilja, I., Fredholm, M.; Hansson, I.; Hákansson, J.; Lundström, K. (1994). Genetic mapping of quantitative trait loci for growth and fatness in pigs. Science, 263: 1771-1774.

5. Cockett, N.; Jackson, S.; Shaw, Т.; Farnir, F.; Berghmans, S.; Snowder, G.; Nielsen, D.; Georges, M. (1996). Polar overdominance at the ovine callipyge locus. Science 273: 236-238.

6. Hanset, R.; Dasnois, C.; Scalais, S.; Michaux, C.; Grobet, L. (1995). Genetypes at the locus for halothane sensitivity and performance in a Pietrain x Large White F2. Genet.Sel.Evol., 27: 63-76.

7. Hanset, R.; Dasnois, C.; Scalais, S.; Michaux, C.; Grobet, L. (1995). Introgression into the Pietrain genome of the normal allele at the locus for halothane sensitivity. Genet.Sel.Evol., 27: 77-88.

8. Olivier, L.; Lauvergne, J.J. (1967). A study of the inheritance of the muscular hypertrophy of the Pietrain pig: preliminary results. Annales de Medecine Veterinaire, 111: 104-109.

9. Rettenberger, C.; Klett, C.; Zechner, U.; Kunz, J.; Vogel, W.; Hameister, H. (1995). Visualisation of the conservation of synteny between humans and pigs by heterologous chromosome painting. Genomics, 26: 372-378.

10. Goureau, A.; Yerle, M.; Schmitz, A.; Riquet, J.; Milan, D.; Pinton, P.; Frelat, G.; Gellin, J. (1996). Human and porcine correspondence of chromosome segments using bidirectional chromosome painting. Genomics, 36: 252-262.

11. Yun, К.; Wold, В. (1996). Skeletal muscle determination and differentiation: story of a core regulatory network and its context. Current Opinion in Cell Biology, 8: 877-889.

12. Knoll, A.; Nebola, M.; Dvorak, J.; Cepica, S. (1997). Detection of a Ddel PCR RFLP within intron 1 of the porcine MYOD1(MYF3) locus. Animal Genetics, 28: 308-322.

13. Florini, J.R.; Ewton, D.Z.; McWade, F.J. (1995). IGFs muscle growth and myogenesis. Diabetes Review, 3: 73-92.

14. Catchpole, I.R.; Engström, W. (1990). Nucleotide sequence of a porcine insulin-like growth factor II cDNA. Nucleic Acids Research, 18 (21): 6430.

15. Feil, R.; Moore, T.F.; Oswald, J.; Walter, J.; Sun, F.; Reik, W. (1997). The imprinted insulin-like growth factor 2 gene. Pp70 In Genomic Imprinting. Eds. Reik & Surani. IRL Press at Oxford University Press.

16. Dunger, D.B.; Ong, K.K.L.; Huxtable, S.J.; Sherriff, A.; Woods, K.A.; Ahmed, M.L.; Golding, J.; Pembrey, M.E.; Ring, S.; the ALSPAC study team, Bennet, S.T.; Todd, J.A.; (1998). Association of the INS VNTR with size at birth. Nature Genetics, 19: 98-100.

17. Paquette J, Giannoukakis N, Polychronakos C, Vafiadis P, Deal C. (1998). The INS 5' variable number of tandem repeats is associated with IGF2 expression in humans. J. Biol.Chem., 273 (23): 14158-14164.

18. Andersson-Eklund, L.; Marklund, L.; Lundström, K.; Haley, C.S.; Andersson, K.; Hansson, I.; Moller, M.; Andersson, L. (1998). Mapping Quantitative Trait Locu for carcass and meat quality traits in a Wild Boar x Large White intercross. J.Anim.Sci., 76: 694-700.

19. Rohrer, G.A.; Alexander, L.J.; Hu Z.; Keele, J.W.; Smith, T.P.; Beattie, C.W. (1996). A comprehensive map of the porcine genome. Genome Research, in the press.

20. Georges, M.; Nielsen, D.; MacKinnon, M.; Moshra, A.; Okimoto, R.; Pasquino, А.Т.; Sargeant, L.S.; Sorensen, A.; Steele, M.R.; Zhao, X.; Womack, J.E.; Hoeschele, I. (1995). Mapping quantitative trait loci controlling milk production by exploiting progeny testing. Genetics, 139: 907-920.

21. Baron, H.; Fung, S.; Aydin, A.; Bahring, S.; Luft, F.C.; Schuster, H. (1996). Oligonucleotide ligation assay (OLA) for the diagnosis of familial hypercholesterolemia. Nat.Biotechnol., 14 (10): 1279-1282.

22. Lander, E.; Green, P. (1987). Construction of multi-locus genetic linkage maps in humans. Proceedings of National Academy of Science (USA), 84: 2363-2367.

23. Lalouel, J.M. (1983). Optimization of functions. Contrib.Epidemiol.Biostat., 4: 235-259.

24. Lander, E.S. & Botstein, D. (1989). Mapping mendelian factors underlying quantitative traits using RFLP linkage maps. Genetics, 121: 185-199.

25. Spelman, R.L.; Coppieters W.; Karim L.; van Arendonk JAM.; Bovenhuis H. (1996). Quantitative trait loci analysis for five milk production traits on chromosome six in the dutch Holstein-Friesian population. Genetics, 144: 1799-1808.

26. Chirgwin, J.M.; Przybyla, A.E.; MacDonald, R.J.; Rutter, W.J. (1979). Isolation of biologically active ribonucleic acid from sources enriched in ribonuclease. Biochemistry 18: 5294-5299.

1. Способ отбора домашнего животного на наличие желательных генотипических свойств, включающий тестирование указанного животного на наличие прошедшего родительский импритинг локуса количественных признаков (QTL), заключающийся в следующем: выбор домашнего животного из группы, взятие генетического материала у животного, скрининг генетического материала на наличие прошедшего родительский импритинг локуса количественных признаков (QTL), отбор животного при положительном результате скрининга.

2. Способ по п.1, дополнительно включающий тестирование образца нуклеиновой кислоты указанного животного на наличие прошедшего родительский импритинг локуса количественных признаков (QTL).

3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что у свиньи указанный QTL локализован на хромосоме 2.

4. Способ по п.2 или 3, отличающийся тем, что указанный QTL картирован примерно в положении 2р1.7.

5. Способ по пп.1-4, отличающийся тем, что указанный QTL включает, по крайней мере, часть гена инсулин-подобного фактора роста-2 (IGF2).

6. Способ по любому из пп.1-5, отличающийся тем, что у свиньи указанный QTL включает маркер, охарактеризованный как nt241 (G-A) или Swc9, как показано на фиг.4.

7. Выделенная или рекомбинантная нуклеиновая кислота, используемая в способе по п.1, для отбора племенного животного или убойного животного, имеющего нужные генотипические свойства и возможные фенотипические свойства, содержащая прошедший родительский импритинг локус количественных признаков (QTL) или ее производный функциональный фрагмент.

8. Выделенная или рекомбинантная нуклеиновая кислота, используемая в способе по п.1, для отбора племенного животного или убойного животного, имеющего нужные генотипические свойства и возможные фенотипические свойства, включающая синтезированный, прошедший родительский импритинг локус количественных признаков (QTL), производный, по крайней мере, от одной хромосомы или ее функционального фрагмента.

9. Нуклеиновая кислота по п.7 или 8, по крайней мере, частично производная от хромосомы Sus scrofa.

10. Нуклеиновая кислота по п.9, отличающаяся тем, что указанная нуклеиновая кислота, по крайней мере, частично происходит от хромосомы 2 Sus scrofa, а предпочтительно примерно в положении 2р1.7, как было установлено при картировании.

11. Нуклеиновая кислота по любому из пп.7-10, отличающаяся тем, что указанный QTL ассоциирован с потенциальной мышечной массой и/или с отложением жира у указанного животного.

12. Нуклеиновая кислота по любому из пп.7-11, отличающаяся тем, что указанный QTL включает, по крайней мере, часть гена инсулин-подобного фактора роста-2 (IGF2).

13. Нуклеиновая кислота по любому из пп.7-12, отличающаяся тем, что отцовский аллель указанного QTL способен к преимущественной экспрессии.

14. Нуклеиновая кислота по любому из пп.7-13, отличающаяся тем, что материнский аллель указанного QTL способен к преимущественной экспрессии.

15. Нуклеиновая кислота по п.7, отличающаяся тем, что указанные свойства ассоциированы с мышечной массой и/или отложением жира.

16. Нуклеиновая кислота по п.15, используемая для отбора животного, такого как свинья.

17. Нуклеиновая кислота по п.16, отличающаяся тем, что указанное животное является гомозиготным по аллелю, присутствующему в прошедшем родительский импритинг QTL, предпочтительно локализованному в хромосоме 2 Sus scrofa, в положении 2р1.7, как было установлено при картировании.

18. Нуклеиновая кислота по п.16 или 17, отличающаяся тем, что указанный QTL ассоциирован с потенциальной мышечной массой и/или с отложением жира у указанной свиньи, и/или тем, что указанный QTL включает, по крайней мере, часть аллеля инсулин-подобного фактора роста-2 (IGF2).

19. Нуклеиновая кислота по любому из пп.8-13, встроенная в трансгенное животное.

20. Нуклеиновая кислота по любому из пп.16-19, отличающаяся тем, что указанное животное является самцом.

21. Нуклеиновая кислота по любому из пп.16-20, отличающаяся тем, что указанное животное продуцирует сперму или эмбрион.

22. Нуклеиновая кислота по п.21, отличающаяся тем, что указанную сперму или эмбрион используют для размножения животных, предназначенных для убоя.