Применение экстракта belamcanda chinensis в качестве подобного эстрогену орган-селективного лекарственного препарата, не имеющего утеротропного эффекта
Изобретение относится к фармацевтической промышленности и используется для селективного лечения и/или профилактики кардиоваскулярных заболеваний, в частности атеросклероза, также остеопороза, климактерический нарушений, особенно для предотвращения или смягчения приливов. Применение экстракта Belamcanda Chinensis для получения орган-селективного лекарственного препарата, не имеющего утеротропного эффекта или имеющего таковой, каким, по меньшей мере можно пренебречь, в качестве препарата, подобного эстрогену, причем экстракт служит для производства лекарственного препарата в готовой форме для селективного лечения и/или профилактики кардиоваскулярных заболеваний, в частности атеросклероза, также для селективного лечения и/или профилактики остеопороза, климактерических нарушений, особенно для предотвращения или смягчения приливов. Экстракт способствует эффективной профилактике и/или лечению кардиоваскулярных заболеваний, в частности атеросклероза, также остеопороза, климактерических нарушений, особенно для предотвращения или смягчения приливов. 3 з.п. ф-лы, 4 ил.
Настоящее изобретение относится к применению экстрактов Belamcanda chinensis в качестве действующего по типу эстрогена орган-селективного лекарственного препарата.
Образующийся в яичниках 17-β-эстрадиол (где бы эстрадиол ни упоминался далее, это всякий раз относится к физиологическому 17-β-эстрадиолу [далее также упоминаемому как Е2]), в организме обычно имеет функцию ускорения пролиферации. Помимо регулирования женского цикла, он, например, оказывает гомеостатическое влияние на костный метаболизм и предотвращает образование атеросклеротических бляшек на эндотелии сосудов.
Во время менопаузы из-за прекращения функции яичников происходит снижение уровня эстрадиола. Это вызывает ослабление процессов пролиферации и в гипоталамусе приводит к повышенной активности генератора импульсов ГтВГ (генератор импульсов гонадотропин высвобождающего гормона является таймером в гипоталамусе и поэтому отбивает такт периодической секреции ЛГ (лютеинизирующего гормона) стероидами, влияющими на ее амплитуду и частоту). В итоге, у женщин в климаксе простимулированная секреция ЛГ влечет за собой так называемые «приливы», которые ощущаются как раздражающие.
При отсутствии достаточно высокого уровня эстрадиола в крови активность остеокластов и, таким образом, разрушение костной массы преобладает, что сопровождается увеличением риска переломов костей. В то же время существует долгосрочный риск образования бляшек в сосудистой системе и, следовательно, возрастает риск инфарктов.
Экстракты Cimicifuga racemosa и Belamcanda chinensis хорошо известны в народной медицине, как способные смягчать перименопаузные и пост-менопаузные нарушения. До настоящего времени это объясняли тем фактом, что экстракты обоих растительных лекарственных веществ проявляют действие, подобное эстрогену, со всеми его положительными воздействиями на множество органов человеческого тела, в особенности на мозг, яичники, кости, сосудистую систему. В свою очередь, подобное эстрогену воздействие на матку, влагалище, ткани молочной железы и печени будет неблагоприятным.
В патенте DE 19652183 описано получение экстрактов из Cimicifuga racemosa для лечения эстроген-зависимых опухолей. Согласно патенту, на основе указанных экстрактов получены терапевтические препараты, оказывающие экстроген-подобное действие и ингибирующие пролиферацию опухолевых клеток.
Известно получение лекарственных препаратов на основе экстрактов из растений семейства Iridaceae, например посредством получения спиртовых эссенций с последующей экстракцией активных ингредиентов эфиром, как описано в JP 63-196522, для лечения язвенных заболеваний, или водных, а также спиртовых экстрактов из Belamcanda chinensis на основе низших и многоатомных спиртов, для предотвращения старения кожи, как показано в JP 07-138179.
Известно также, что одним из активных компонентов растительных экстрактов семейства Iridaceae является текторигенин, различные соединения которого, выделенные из растений Belamcanda chinensis, подробно описаны в JP 63-030417 для применения в качестве противоаллергенных препаратов.
Плохо, однако, то, что вплоть до настоящего времени не было доступно лекарство из лекарственных растений Belamcanda chinensis, которое можно было бы использовать в орган-селективной профилактике или в лечении в случаях эстрогенной недостаточности и которое при этом не оказывало бы неблагоприятного воздействия на матку, влагалище и другие органы.
Исходя из этого, задачей настоящего изобретения, таким образом, является получение растительных лекарственных веществ из Belamcanda chinensis с действием, подобным эстрогену, но при этом таких, которые бы являлись орган-селективными, без воздействия или со слабым воздействием на матку.
Задача решена путем получения на основе экстрактов Belamcanda chinensis подобного эстрогену орган-селективного лекарственного препарата, не имеющего утеротропного эффекта или имеющего таковой, каким, по меньшей мере, можно пренебречь.
В экспериментах как in-vitro, так и in-vivo к удивлению было обнаружено, что экстракты, получаемые из Belamcanda chinensis, органическими растворителями или сверхкритическим CO2, орган-селективно воздействуют на центральную нервную систему, костную систему и сосудистую систему при отсутствии воздействия на матку, т.е. при отсутствии так называемого утеропропного эффекта. Экстракты, используемые в соответствии с изобретением, таким образом, подходят для производства лекарственных препаратов в готовой рецептурной форме для селективного лечения и/или профилактики остеопороза.
Более того, такие экстракты подходят для производства лекарственных препаратов в готовой рецептурной форме для селективного лечения и/или профилактики кардиоваскулярных заболеваний, в особенности атеросклероза.
Более того, они подходят для получения лекарственных препаратов с готовой рецептурой для селективного лечения и/или профилактики пери-менопаузных и пост-менопаузных психовегетативных расстройств таких, как, например, приливы.
Более того, было обнаружено, что компонент текторигенин, который был выделен из Belamcanda schinensis, по существу вызывает тот же эффект, что и экстракт в целом.
Текторигенин
Помимо Belamcanda chinensis этот компонент был обнаружен в других представителях сем. Iridaceae, таких, как, например, Iris germanica, I. tectorum, I. illyrica, I. dichotoma.
| Порядок | Liliales |
| Семейство | Iridaceae |
| Род | Belamcanda |
| Виды | Belamcanda chinensis (Leman)DC.= |
| Pardanthus chinensis (L.) Ker-Gawler, а также | |
| Ixia chinensis L. (=Gemmingia chinensis | |
| (L.)O. Kuntze) |
Для получения экстрактов предпочтительно использовать корневища, стебли, листья и/или лепестки.
Фундаментальное фитохимическое описание Belamcanda chinensis и его составных частей дано в диссертации г-жи A.Nenninger (LMU Munchen, 1997), озаглавленной "Phytochemische und pharmakologische Untersuchungen von Belamcanda sinensis, einer Arzneipflanze der TCM und anderer Irisarten".
С лекарственными препаратами согласно изобретению впервые были получены лекарственные вещества из Belamcanda chinensis и других сем. Iridaceae, которые действуют как полные антагонисты рецепторов эстрогена в костях, кардиоваскулярной системе и мозге.
Дальнейшие преимущества и признаки настоящего изобретения будут ясны из описания экспериментальных данных со ссылками на фигуры, показывающие:
Фиг.1: сравнение органической и водной фаз Cimicifuga racemosa. График замещения типичного эстрогенового рецептора в опытах по связыванию лигандов. Концентрация стартового раствора 17.66 мг/мл с последующим разбавлением 1:2, 1:4 и т.д. до 1:64.
Фиг.2: ЛГ в сыворотке до и через 2 часа после внутривенного введения экстракта Belamcanda chinensis, E2 и наполнителя. Экстракт Belamcanda chinensis имеет аналогичную способность снижать повышенный уровень ЛГ в сыворотке как и E2.
Фиг.3 влияние Cimicifuga racemosa и E2 на вес матки (Фиг.3а) и уровни ЛГ в крови (Фиг.3b) у овариэктомированных крыс после семидневного подкожного введения (среднее значение +СВ3, n=8*, р<0.05 в сравнении с кремофором в качестве наполнителя);
Фиг.3а) масса матки;
Фиг 3b) концентрации ЛГ в крови;
Фиг.4а) влияние Cimicifuga racemosa и Е2 у овариэктомированных крыс после семидневного подкожного введения (среднее значение +СВ3, n=8*, р<0.05 в сравнении с кремофором в качестве наполнителя) на экспрессию мРНК для Е2-рецептора α в преоптической зоне гипоталамуса;
Фиг.4b) экспрессия мРНК для IGF1 и С3 в матке овариэктомированных крыс после семидневного подкожного введения и
Фиг.4с) экспрессия мРНК для коллагена 1 (Coll 1) и остеокальцина в кости овариэктомированных крыс после 7 суток подкожного введения.
Экспериментальное подтверждение подобного эстрогену воздействия Cimicifuga racemosa и Belamcanda chinensis
Подобное эстрогену селективное воздействие было продемонстрировано по стадиям по порядку на сериях тест-систем различной степени сложности.
1. Эксперименты in vitro
1.1. Эксперименты in vitro на Cimicifuga racemosa
Распознавание эстрогеноподобной структуры компонентов антителами, направленными против 17-β-эстрадиола (=Е2) показано in vitro.
Экстракт Cimicifuga racemosa выпаривали над остатком. Вещества, имеющие разные полярности, обогащали фазовым разделением между дихлорметаном и водой. Сродство к связыванию компонентами обеих фаз было определено in vitro на эстрогенных рецепторах из матки свиньи. Цитозольные эстрогенные рецепторы из матки свиньи выделяли в соответствии с обычной методикой и использовали в экспериментах по замещению лигандов.
При этом было обнаружено, что эстрогеноподобные структуры, например, из Cimicifuga racemosa, по природе своей не гидрофильны, а липофильны, поскольку их можно извлекать из экстракта органическими растворителями. Вещества, присутствующие в органически экстрагированной фазе, имели сродство с антителами в десять раз более сильное, чем вещества, остающиеся в водной фазе.
Различия между двумя фазами в сериях опытов со связыванием с рецепторами эстрадиола были еще больше. Сродство связывающих веществ к эстрадиолу должно быть достаточно высоким, чтобы обеспечить селективно-конкурентное взаимодействие с рецептором эстрадиола в свободном от клеток препарате. В пределах данной тест-системы водная фаза не обладала активностью, тогда как органическая фаза имела очень сильное связывание с рецептором.
Результаты представлены на Фиг.1.
1.2. Исследования in vitro Belamcanda chinensis
По результатам других исследований известно, что экстракты Belamcanda chinensis также имеют компоненты, которые распознаются антителами, направленными против 17-β-эстрадиола, и связываются с рецептором 17-β-эстрадиола (cf. Nenninger loc. cit.). Обнаружено, что эти экстракты оказывают подобное эстрогену различное воздействие на разные системы органов и, в частности, отсутствие у них утеротропного эффекта.
2. Эксперименты in vivo: подтверждение эстрогенного воздействия на овариэктомированную крысу
Связывание с рецептором Е2 очень селективно; однако, невозможно сказать, ускоряются или ингибируются последущие процессы внутри клетки, т.е. является ли вещество агонистом или антагонистом. Это свойство может быть определено только в подходящих клеточных системах или на целом животном.
Овариэктомированная крыса является признанной моделью пост-менопаузной женщины, у которой прекращается выработка эстрадиола. В результате внешнего поступления 17-β-эстрадиола или веществ, имеющих подобное эстрогену воздействие, происходит восстановление эстроген-чувствительных анатомо-морфологических параметров, таких как увеличение веса матки и распространение ороговевших клеток, т.е. бляшковых эпителиальных клеток в эпителии влагалища, или гормональные изменения, такие, как снижение уровня ЛГ в крови обработанных животных.
Все описанные далее эксперименты проводили на овариэктомированных крысах Sprague-Dawley (далее, "овэ крысы"), имеющих вес от 240 до 280 г.
2.1. Однократное применение Belamcanda chinensis
Проявление действия экстракта Belamcanda chinensis, действующего по типу эстрадиола, происходит очень быстро. Даже после однократного в/в введения наполнителя, эстрадиола и экстракта Belamcanda chinensis овэ крысам пульсативность прекращается как под действием Е2, так и под действием Belamcanda chinensis. При оценке степени усовершенствования лекарственного препарата происходит достоверное снижение уровня ЛГ в сыворотке как в сравнении с предыдущими уровнями, так и в сравнении с обрабатываемыми кремафором контрольными животными. Кремафор является эмульгатором на основе полиэтоксилированных производных касторового масла.
Результаты представлены на Фиг.2.
В матке животных через шесть часов после введения экстракта Belamcanda chinensis экспрессия маточных генов VEGF, IGF 1 и С3 не менялась по сравнению с контролем, тогда как введение эстрадиола вызвало четкое увеличение экспрессии генов этих трех эстроген-регулируемых белков. На конститутивно экспрессируемый ген ССО ни одна из этих обработок не оказала достоверного влияния.
Эти находки указывают на то, что компоненты Belamcanda chinensis вызывают ингибирование генератора импульсов ГтВГ в эстроген-рецептивных структурах гипоталамуса и, таким образом, имеют эстроген-агонистический эффект. При этом гипофизарная секреция ЛГ значительно ингибируется как компонентами Belamcanda chinensis, так и эстрадиолом. В противоположность эстрадиолу, компоненты Belamcanda chinensis не имеют утеротропного действия. Эстрадиол существенно регулирует экспрессию генов VEGF, IGF 1 и С3 в сторону увеличения - действие, которое не наблюдается у Belamcanda chinensis.
Проведение активных опытов по влиянию в/в инъекций экстракта Belamcanda chinensis
24 крысам (т.е. по 8 животных в группе) под эфирной анестезией за день до начала эксперимента в яремную вену имплантировали катетер. В день эксперимента отобрали 6 проб крови с интервалом в 10 мин. Сразу после отбора шестой пробы 62.5 мг (5%) экстракта Belamcanda chinensis или 10 мкг 17-β-эстрадиола (Е2) или раствор (5%) кремофора в изотоническом NaCl, 1 мл, соответственно, вводили внутривенно и в течение еще 2 ч с 10-ти минутным интервалом отбирали пробы крови. Через 6 ч после внутривенного введения животных обезглавили, отобрали кровь, вырезали яичники, взвесили и подвергли глубокой заморозке в жидком азоте.
2.2. Однократное применение текторигенина
После однократного введения текторигенина было определено его влияние во времени на уровень ЛГ в крови и подобная эстрадиолу иммунореактивность. Концентрация текторигенина в крови животных, определенная с помощью Е2-РИА через 20 мин, соответствует эквивалентам примерно 100 пикограммов эстрадиола.
Текторигенин иницирует быстрое снижение ЛГ. Кинетика снижения ЛГ, полученная под действием текторигенина до 60 мин вслед за в/в введением, прекрасно соотносится с таковой эстрадиола, но затем не приводит к дальнейшему снижению, а вновь медленно возрастает.
Проведение: ОВЭ-крысы имели катетеры, помещенные в наружную яремную вену под эфирной анестезией за 24 ч до начала эксперимента в соответствии с методикой Harms & Ojega (Harms PG and Ojega SR: A rapid and simple procedure for chronic cannulation of the rat jugular vein. J. Appl. Physiol. (1974) 36: 391-392). Конец трубки помещали в кожный карман на шее. С тем чтобы при отборе проб крови не надо было трогать животных, катетер удлинили с помощью силиконовой трубки. Катетер и трубку промыли раствором Рингера, содержащего 50 IU (международных единиц) гепарина/мл.
Пробы крови, каждая по 100 микрограмм, отбирали у животных с 10-минутными интервалами, а отобранный объем возмещали раствором Рингера/с гепарином. После отбора 6-й пробы внутривенно вводили по 1.0 мл соответствующего тестируемого раствора. В качестве тестируемых растворов использовали: 2% кремофор (= раствор наполнителя), текторигенин 7 мг/мл наполнителя, 17-β-эстрадиол 10 мкг/мл наполнителя. Кровь с 10 минутными интервалами брали еще в течение 140 мин.
Пробы крови, полученные таким образом, помещали в сосуд для реакций Eppendorf объемом 0.5 мл с 10 мл гепарин-Losung (5000 международных единиц/мл, Liquemin), центрифугировали в течение 10 мин при 10000*g и плазму хранили при -20°С до проведения радиоиммунологических анализов.
РИА для ЛГ и пролактина основаны на антисыворотке, контрольные и иодирующие препараты от фирмы NIH (Bethesda, Maryland, USA). Концентрации эстрадиола и перекрестно реагирующих изофлавонов измеряли при помощи РИА из DPC, Bad Nauheim.
2.3. Влияние экстракта Belamcanda chinensis после введения в течении 7 суток
Влияние неоднократного введения эстрадиола, экстракта Belamcanda chinensis и наполнителя на общую массу, массу матки, гормональный уровень и активацию генов матки и кости было исследовано на овариэктомированных крысах после ежедневного подкожного введения в течение 7 суток.
Средние массы тел животных, получавших кремофор и Belamcanda chinensis, не различались, тогда как животные, получавшие Е2, были достоверно легче. Также достоверно не различались массы маток животных, получавших кремофор и Belamcanda chinensis, тогда как те, которые получали Е2, более чем утроили массу маток.
Уровни сывороточного ЛГ у животных, получавших Belamcanda chinensis, снижались незначительно, но достоверно по сравнению с контрольными кремофорными, снижение под действием эстрадиола было более выраженным.
В маточном экстракте мРНК экстрадиол достоверно повышал экспрессию генов VEGF до 149% по сравнению с контролем после одной недели введения. Под действием экстракта Belamcanda chinensis экспрессия слегка, но недостоверно, возрастала. Не была затронута экспрессия не эстроген-регулируемых основных генов, на примере цитохром С оксидазы (=ЦСО).
В экстракте головки бедренной кости была определена экспрессия генов коллаген-1А1, остеокальцина, IGF1 и TGF β-мРНК. Эстрадиол, так же как и Belamcanda chinensis, достоверно ингибирует экспрессию всех 4 генов, не оказывая влияния на ген ЦСО.
Различие в действии эстрадиола и Belamcanda chinensis становится ярко выраженным после семидневной обработки. Экстракт Belamcanda chinensis имеет эстрадиол агонистическое влияние на гипофизарную секрецию ЛГ путем ингибирования генератора импульсов ГтВГ и на генную экспрессию четырех эстроген-регулируемых генов в кости. В отличие от этого, эстрогенное воздействие на матку отсутствует: ни масса матки, ни эстроген-зависимый ген VEGF не подвергаются влиянию экстракта Belamcanda chinensis. В отличие от этого эстрадиол вызывает раздувание матки и активацию гена VEGF.
Проведение подострых опытов по влиянию ежедневного подкожного введения в течение 7 суток:
8-ми животным из каждой опытной группы (всего 24) ежесуточно с 8:00 до 9:00 подкожно вводили 62.5 мг экстракта Belamcanda chinensis, 10 мкг эстрадиола или растворителя (кремафор 5%, 1 мл), соответственно. Через 6 ч после последнего введения, животных обезглавливали и у каждого животного отбирали аорту, матку, головку левой бедренной кости, очищали и замораживали в жидком азоте.
В пробах крови определяли ЛГ и иммунореактивность эстрадиола.
2.4. Повторное применение Cimicifuga racemosa
He ранее 14 суток после овариэктомии животным подкожно вводили соответствующие тестируемые вещества в дозах 62.5 мг Cimicifuga racemosa на крысу, или 8 мкг эстадиола на крысу один раз в день утром в течение 7 суток. Оба вещества были растворены в 5% кремофоре, контрольные животные получали только наполнитель.
Вслед за обезглавливанием животных мозг, матку и бедро препарировали для регенерации мРНК. Концентрацию ЛГ в крови животных определяли с помощью РИА. Экспрессию эстроген-регулируемых генов в вышеназванных органах определяли с помощью полуколичественного анализа RT-PCR.
Матки животных, обработанных эстрадиолом, были более чем в три раза больше по массе, чем таковые животных, обработанных Cimicifuga racemosa и наполнителем, которые по существу не отличались по своим средним значениям. Это означает, что компоненты Cimicifuga racemosa не влияют на матку животных. Это же справедливо для влагалища, где не происходит ороговения эпителиальных тканей у животных, получавших Cimicifuga racemosa и наполнитель, в прямую противоположность животным, получающим эстрадиол.
Уровни ЛГ животных, получавших наполнитель, оставались высокими, однако, достоверно снижались под действием как эстрадиола, так и Cimicifuga racemosa.
Результаты представлены на Фиг.3а) и 3b).
| Масса матки (сырой) | Кремофор (контроль) | Cimicifuga racemosa | Е2 |
| Число животных | 8 | 8 | 8 |
| Средние значения (мг) | 185.6 | 192.3 | 702.1 |
| СО | 18.81 | 22.53 | 94.97 |
| СВ3 | 6.65 | 7.97 | 68.92 |
| Концентрации ЛГ в крови | Кремофор (контроль | Cimicifuga racemosa | Е2 |
| Число животных | 8 | 8 | 8 |
| Средние значения (нг/мл) | 16.9 | 12.5 | 7.83 |
| СО | 3.99 | 3.4 | 5.57 |
| СВ3 | 1.41 | 1.2 | 1.97 |
В качестве другого маркера эстрогенного влияния была измерена активация мРНК эстроген-стимулируемых белков. В данной работе измерения проводили на тканях из матки, из кости (бедреная) и из преоптической зоны гипоталамуса.
В гипоталамусе как Cimicifuga racemosa, так и Е2 стимулировали экспрессию мРНК для эстрогенного рецептора α (Фиг.4а). В костной ткани Cimicifuga racemosa тоже ведет себя как эстроген и снижает по аналогии с эстрадиолом экспрессию мРНК для костно-специфического коллагена 1 и для генов остеокальцина (Фиг.4 b).
Напротив, не наблюдали влияния Cimicifuga racemosa на эстроген-регулируемые гены в матке. Только эстрадиол повышает мРНК для IGF и комплиментарного фактора С3 (Фиг.4с).
Эти находки доказывают, что компоненты Cimicifuga racemosa селективно воздействуют на отдельные органы: экстракт действует эстрогеноподобно на гипоталамус (экспрессия Е2 рецептора а, высвобождение ЛГ) и на кости, что доказано экспрессией генов для коллагена 1 и остеокальцина. Однако, в отличие от эстрадиола, Cimicifuga racemosa не влияет на матку, поскольку проявляется отсутствие влияния на массу матки и экспрессию генов IFG1 и С3.
Экспериментами, проведенными in vivo и in vitro, продемонстрировано, что экстракты Cimicifuga racemosa и Belamcanda chinensis оказывают подобное эстрогену действие. Было обнаружено, что экстракты из названных лекарственных веществ действуют орган-селективно на центральную нервную систему, кости и сосуды, но не на матку и, таким образом, отлично подходят для профилактики и лечения эстрогенной недостаточности без отрицательного влияния на эндометрий.
Идентичные эффекты были достигнуты при использовании текторигенина, содержащегося в Belamcanda chinensis.
Таким образом, впервые стали доступными лекарственные препараты с действием, подобным эстрогену, но без утеротропного эффекта.
Подобные лекарственные препараты могут быть использованы для лечения и/или профилактики кардиоваскулярных заболеваний, особенно атеросклероза, остеопороза и пери- и пост-менопаузных психовегетативных расстройств, таких как, например, приливы.
Известны оральный, внутривенный и подкожный способы употребления.
1. Применение экстракта Belamcanda Chinensis для получения орган-селективного лекарственного препарата, не имеющего утеротропного эффекта, или имеющего таковой, каким, по меньшей мере можно пренебречь, в качестве препарата, подобного эстрогену.
2. Применение по п.1, отличающееся тем, что экстракт служит для производства лекарственного препарата в готовой форме для селективного лечения и/или профилактики кардиоваскулярных заболеваний, в частности атеросклероза.
3. Применение по п.1, отличающееся тем, что экстракт служит для производства лекарственного препарата в готовой форме для селективного лечения и/или профилактики остеопороза.
4. Применение по п.1, отличающееся тем, что экстракт служит для производства лекарственного препарата в готовой форме для селективного лечения и/или профилактики климактерических нарушений, в частности для предотвращения или смягчения приливов.
