Способ определения токсичности водной среды (варианты), реагент для определения токсичности водной среды, применение mg2+ -атфазы плазматических мембран мозга животных
Владельцы патента RU 2266539:
Мензиков Сергей Арсентьевич (RU)
Попов Александр Александрович (RU)
Мензикова Ольга Викторовна (RU)
Союз защиты экологических прав населения Московской области (RU)
Изобретения относятся к экологии, токсикологии, санитарии и гигиене и могут быть использованы для наблюдения, контроля и анализа качества питьевой, природной и сточных вод. Способ определения токсичности водной среды заключается в определении изменения активности Mg2+-АТФазы плазматических мембран мозга животных, активированной ионами хлора и/или бикарбоната. Вариантом является способ определения токсичности водной среды, включающий смешение плазматических мембран мозга животных с пробой водной среды, доведенной до физиологических рН не содержащим фосфор буфером. Затем следует добавление раствора, содержащего трис-АТФ и источник ионов магния, а также источник/источники ионов хлора и/или бикарбоната, инкубацию с образованием фосфора неорганического и определение токсичности по содержанию фосфора неорганического. В способе используется реагент для определения токсичности водной среды, представляющий собой плазматические мембраны мозга животных, содержащие Mg2+-АТФазу, способную к активации ионами хлора и/или бикарбоната. Предложено применение Mg2+-АТФазы плазматических мембран мозга животных, активированной ионами хлора и/или бикарбоната, в качестве реагента для определения токсичности воды. Технический результат выражается в расширении функциональных возможностей способов и применения реактива, увеличении чувствительности, обеспечении возможности определения токсичности при более низких концентрациях различных классов токсических веществ и повышении надежности. 4 н. и 16 з.п. ф-лы, 6 табл.
Изобретения относятся к экологии, токсикологии, санитарии и гигиене и могут быть использованы для наблюдения, контроля и анализа качества питьевой, природной и сточных вод.
Разработано несколько достаточно чувствительных биохимических тест-методов, позволяющих оценить уровень загрязнения водоемов токсикантами. Из уровня техники известен способ определения токсичности воды (SU 1762232, G 01 N 33/48, опубликованный 15.09.1992), включающий инкубацию биологического тест-объекта и пробы воды с последующим определением токсичности. В качестве тест-объекта используют реагент, состоящий из исследуемой пробы воды, которую предварительно фильтруют и затем к 5 мл подготовленной пробы добавляют эритроцитарную массу в количестве, обеспечивающем концентрацию 200-250 клеток на 1 мкл (10 мкл эритроцитарной массы на 1 мл пробы). Определение токсичности проводят по реакции термогемолиза на спектрофотометре при длине волны 670 нм и сравнивают с контрольной пробой оценкой по формуле.
Получению требуемого технического результата препятствует сложность способа и длительность анализа, большая трудоемкость.
Наиболее близким аналогом, принятым за прототип для всех объектов изобретения, является способ определения токсичных веществ в воде (SU 1359741, G 01 N 33/48, опубликованный 15.12.1987), используемый в этом способе реагент и его назначение. Согласно указанному изобретению способ определения токсических веществ (в частности, для указанного способа - фосфороорганических пестицидов) включает отбор пробы, забуферирование ее до рН 7,5, введение холинэстеразы и субстрата - бутирилтиохолинбромида или бутирилтиохолиниодида, инкубирование с последующим колометрированием.
С существенными признаками первого объекта заявляемого изобретения совпадают такие признаки прототипа, как назначение, определение токсичности по изменению активности фермента. С существенными признаками второго объекта заявляемого изобретения совпадают такие признаки прототипа, как назначение, смешение фермента с пробой водной среды, предварительно забуференной до физиологических рН, добавление раствора, инкубацию с образованием продукта реакции и определение токсичности по содержанию продукта реакции. С существенными признаками третьего объекта заявляемого изобретения совпадают такие признаки прототипа, как назначение, вид вещества реагента - фермент. С существенными признаками четвертого объекта заявляемого изобретения совпадают такие признаки прототипа, как вид применяемого вещества по указанному назначению, а именно фермент.
Получению требуемого технического результата препятствует ограниченные функциональные возможности способа, т.к. этот метод позволяет определять уровень загрязнения воды только фосфорорганическими пестицидами.
Задачей изобретений является разработка новых биологических экспресс-методов и реагентов, позволяющих определять низкие концентрации различных токсических веществ в водной среде.
Технический результат, получаемый при реализации изобретений, выражается в расширении функциональных возможностей способа и применения реактива, увеличении чувствительности, обеспечении возможности определения токсичности при более низких концентрациях различных классов токсических веществ, например, ароматических углеводородов, хлорорганических и фосфорорганических соединений и солей тяжелых металлов в питьевой, природных и сточных водах, повышении надежности способа. Дополнительный технический результат выражается в упрощении и ускорении проведения тест-анализа. Кроме того, очевидным достоинством предлагаемого метода является доступность биологического материала для изготовления тест-объекта и возможность его использования в любой лаборатории, имеющей недорогостоящее оборудование. Заявленные способы, реагент и применение позволяют исследовать степень загрязнения природных водоемов или сточных вод промышленных предприятий на уровне ферментной системы, что позволяет установить степень токсичности образца, избежав трудноулавливаемого нивелирования токсичности веществ, нередко наблюдаемого при использовании в качестве биотеста целого организма.
Для достижения вышеуказанного технического результата в качестве первого объекта предложен способ определения токсичности водной среды, заключающийся в определении изменения активности Mg2+-АТФазы плазматических мембран мозга животных, активированной ионами хлора и/или бикарбоната.
Отличительными от наиболее близкого аналога являются такие признаки, как использование конкретного фермента - Mg2+-АТФазы плазматических мембран мозга животных, и активация его ионами хлора и/или бикарбоната.
Большинство методов определения активности ферментов основано на измерении концентрации фосфора неорганического Фн в пробе. К таким методам относятся, например, метод Ратбуна и Бетлах или метод Фиске и Суббароу, а также метод Чена. Методика выполнения вышеуказанных методов подробно раскрыта в литературе, например в [Болдырев А.А., Лопина О.Д., Рубцов А.М., И.А. Свинухова. Биохимия активного транспорта ионов и транспортные АТФазы. Издательство МГУ, 1983, 126 с.].
Разработаны также другие методы, позволяющие определить активность АТФаз.
Регенерирующая система. Целый ряд задач (при исследовании свойств фермента) позволяет решить применение регенерирующей системы, в которую входит фермент (ферменты), превращающий продукт исследуемой реакции в исходный субстрат, а также дополнительный субстрат для реакции регенерации. Наиболее часто при исследовании транспортных АТФаз для превращения АДФ в АТФ используют пируваткиназную регенерирующую систему пируваткиназа-фосфоенолпируват (ФЕП). Использование сопряженной системы ферментов позволяет вести непрерывную регистрацию активности фермента по уменьшению оптической плотности при 340 нм.
рН-метрия. Удобным методом определения ферментативной активности АТФаз является потенциометрический метод. В основе этого метода лежит регистрация скорости накопления протона (рК для Н2PO4' равно 6,8, т.е. в физиологических условиях диссоциирует 50% ионов Н2PO4). Закисление регистрируют в слабозабуференной среде инкубации. Потенциометрический метод позволяет избежать ряд методических трудностей, возникающих при регистрации АТФазной активности по возрастанию Фн в присутствии некоторых фармакологических веществ и, кроме того, также позволяет получить ответ достаточно быстро. Для этого метода необходимы рН-метр с электродом, термостатируемая ячейка, самописец, магнитная мешалка.
В частном случае выполнения изобретения по первому объекту изменение активности Mg2+-АТФазы плазматических мембран мозга животных, активированной ионами хлора и/или бикарбоната, определяют по содержанию фосфора неорганического, образуемого при инкубации раствора, полученного путем смешения пробы водной среды, доведенной до физиологических рН не содержащим фосфор буфером, с раствором, содержащим трис-АТФ и источник ионов магния, а также источник ионов хлора и/или бикарбоната.
Для достижения вышеуказанного технического результата в качестве второго объекта предложен способ определения токсичности водной среды, включающий смешение плазматических мембран мозга животных с пробой водной среды, доведенной до физиологических рН не содержащим фосфор буфером, добавление раствора, содержащего трис-АТФ и источник ионов магния, а также источник/источники ионов хлора и/или бикарбоната, инкубацию с образованием фосфора неорганического и определение токсичности по содержанию фосфора неорганического.
Отличительными от наиболее близкого аналога являются такие признаки как использование фермента - плазматических мембран мозга животных, добавление раствора, содержащего трис-АТФ и источник ионов магния, а также источник/источники ионов хлора и/или бикарбоната, что обеспечивает при инкубации образование фосфора неорганического, по содержанию которого и определяют токсичность.
В частном случае выполнения изобретения по второму объекту может быть дополнительно проведено преинкубирование после смешения плазматических мембран с пробой водной среды, доведенной до физиологических рН не содержащим фосфор буфером.
В частном случае выполнения изобретения по второму объекту дополнительно используют контрольную пробу с чистой средой, доведенной до физиологических рН не содержащим фосфор буфером, которую смешивают с плазматическими мембранами мозга животных, добавляют раствор трис-АТФ и источник ионов магния, а также источник/источники ионов хлора и/или бикарбоната соответственно составу раствора для пробы водной среды, инкубируют с образованием фосфора неорганического, определяют содержание фосфора неорганического в контрольной пробе, а определение токсичности водной среды по содержанию фосфора неорганического проводят с учетом содержания фосфора неорганического в контрольной пробе. При этом может быть дополнительно проведено преинкубирование после смешения плазматических с контрольной пробой, доведенной до физиологических рН не содержащим фосфор буфером.
В частном случае выполнения изобретения по второму объекту в качестве источника ионов хлора используют соли хлора. Причем в качестве солей хлора может быть использован натрий хлористый или холин хлористый.
В частном случае выполнения изобретения по второму объекту в качестве источника ионов бикарбоната используют соль бикарбоната. Причем в качестве соли бикарбоната используют натрия бикарбонат.
В частном случае выполнения изобретения по второму объекту ионов магния используют соли магния, например, сульфат магния или ацетат магния.
В частном случае выполнения изобретения по второму объекту содержание фосфора неорганического определяют путем измерения экстинкции окрашенных растворов на спектрофотометре.
В частном случае выполнения изобретения по второму объекту степень токсичности рассчитывают по отношению содержания фосфора неорганического в пробе с водной средой к содержанию фосфора неорганического в контрольной пробе.
В частном случае выполнения изобретения по второму объекту после смешения плазматических мембран мозга животных с пробой водной среды, доведенной до физиологических рН не содержащим фосфор буфером, полученный раствор разделяют на две части: основную и фоновую, в основную часть добавляют раствор, содержащий трис-АТФ и источник ионов магния, а также источник/источники ионов хлора и/или бикарбоната, в фоновую часть добавляют раствор, содержащий трис-АТФ и источник ионов магния, а определение токсичности водной среды по содержанию фосфора неорганического проводят с учетом фонового содержания фосфора неорганического.
В частном случае выполнения изобретения по второму объекту после смешения плазматических мембран мозга животных с пробой водной среды и контрольной пробой, доведенных до физиологических рН не содержащим фосфор буфером, полученные растворы разделяют на соответствующие две части: основную и фоновую, в основные части пробы водной среды и контрольной пробы добавляют раствор, содержащий трис-АТФ и источник ионов магния, а также источник/источники ионов хлора и/или бикарбоната, в фоновые части пробы водной среды и контрольной пробы добавляют раствор, содержащий трис-АТФ и источник ионов магния, а определение токсичности водной среды по содержанию фосфора неорганического проводят с учетом фонового содержания фосфора неорганического в водной среде и контрольной пробе. При этом определение степени токсичности рассчитывают, в частности, по отношению разности содержания фосфора неорганического в пробе с водной средой и фонового содержания фосфора неорганического в пробе с водной средой к разности содержания фосфора неорганического в контрольной пробе и фонового содержания фосфора неорганического в контрольной пробе.
Для достижения вышеуказанного технического результата в качестве третьего объекта предложен реагент для определения токсичности водной среды, представляющий собой плазматические мембраны мозга животных, содержащие Mg2+-АТФазу, способную к активации ионами хлора и бикарбоната.
Отличительными от наиболее близкого аналога являются такие признаки, как использование конкретного фермента -Mg2+-АТФазы плазматических мембран мозга животных и ее способность к активации ионами хлора и/или бикарбоната.
В частном случае выполнения изобретения по третьему объекту реагент получают путем гомогенизации мозга животных с не содержащим фосфор буфером с физилогическим рН с последующим центрифугированием при скорости от 40 до 167 об/сек и отделением надосадочной жидкости, ее повторным центрифугированием при скорости от 300 до 3000 об/сек, добавлением основной среды и ресуспендированием.
Для достижения вышеуказанного технического результата в качестве четвертого объекта предложено применение Mg2+-АТФазы плазматических мембран мозга животных, активированной ионами хлора и/или бикарбоната, в качестве реагента для определения токсичности воды.
Отличительными от наиболее близкого аналога являются такие признаки, как применение конкретного фермента - Mg2+-АТФазы плазматических мембран мозга животных, активированной ионами хлора и/или бикарбоната.
Технический результат достигается тем, что для получения белка, обладающего Mg2+-АТФазной активностью, используют мозг животных с различным уровнем организации от беспозвоночных до позвоночных животных (моллюски, рыбы или кролики). В мозге животных этот белок содержится в максимальном количестве, он высокочувствителен к реагентам, и его функциональные свойства легко поддаются регистрации.
В клетках мозга животных АТФ содержится в наибольшем количестве. АТФ (аденозинтрифосфорная кислота) участвует во многих реакциях, катализируемых ферментами АТФазами, осуществляющими метаболизм всех видов соединений. Во всех живых клетках АТФ, находящаяся в ядре клетки, выступает в качестве депо для хранения и переноса химической энергии. Химическая природа этих превращений проста - происходит гидролиз АТФ, сопровождаемый освобождением энергии. Происходящий процесс: Н2O+АТФ→АДФ+Фн
Транспортные АТФазы (в частности исследуемая нами Cl-, HCO3- АТФаза) ускоряют гидролиз АТФ и используют выделяющуюся энергию для транспорта анионов через мембраны клеток.
Способ, реагент и применение позволяют оценить степень загрязнения пробы водной среды по ее воздействию на предварительно приготовленный из мозга животных белковый препарат (плазматические мембраны), содержащий фермент - Mg2+-АТФазу. Механизм нейротоксического действия ароматических углеводородов и, в частности, инсектицидов, состоит в нарушении белковых ансамблей ионных каналов нервных клеток. Mg2+-АТФ-гидролазная реакция плазматических мембран, активированных ионами, демонстрирует прямую сопряженность данного фермента с рецептор/канальными ансамблями, отражает их энергозависимость и, кроме того, при действии токсических лигандов изменяет свою активность абсолютно идентично изменению кинетики скорости ионных потоков. Изобретение основано на исследовании функциональных свойств рецепторных белков, управляющих ионными каналами при действии токсических веществ без непосредственного изучения транспортной функции того или иного иона, а только по Mg2+-АТФазной активности плазматических мембран, которая в отличие от Mg2+-АТФаз других клеточных органелл отражает не только энергетическое, но конформационное состояние рецепторно/канального ансамбля мозга животных.
Способ определения токсичности воды осуществляется следующим образом.
Для получения плазматических мембран, которые содержат фермент - Mg2+-АТФазу, применяют следующие этапы. Декапитируют достаточное количество половозрелых животных для получения от 10 до 100 г мозга. Мозг, по мере вычленения, помещают в стакан, охлаждаемый в ледяной бане. Помещают от 10 до 100 г мозга в ступку или гомогенизатор Поттера и добавляют от 20 до 200 мл основной среды, представленной не содержащим фосфор буфером с физиологическим рН от 10-2 до 10-1 М. Тщательно гомогенизируют ткань при температуре от 4 до 10°С. К гомогенату добавляют от 80 до 800 мл основной среды, поддерживая температуру от 4 до 10°С, размешивают его в течение 5-15 мин. Распределяют гомогенат поровну между центрифужными пробирками объемом от 5 до 100 мл и проводят центрифугирование на лабораторной центрифуге в течение времени от 10 до 70 мин при скорости от 40 до 160 об/сек, используя угловой ротор или ротор с подвесными стаканами. Надосадочную жидкость центрифугируют повторно при 300-3000 об/сек в течение от 0,5 до 2 часов. Надосадочную жидкость осторожно сливают, ее остаток удаляют из перевернутого стакана с помощью фильтровальной бумаги. В стакан добавляют от 1 до 100 мл основной среды (буфера) и ресуспендируют осадок путем пропускания его через иглу. Суспензию разливают по пробиркам объемом от 0,5 мл до 2 мл и замораживают в морозильной камере при температуре не выше -20°С для хранения. Образцы хранят в морозильной камере. Активность фермента в этих условиях сохраняется в течение 60 суток.
При определении токсичности водной среды отбирают пробу. Размораживают часть плазматических мембран, например, объемом 0,5 мл. Исследуемую пробу воды доводят до рН 5,5-9,0 любым не содержащим фосфор буфером, используемым в энзимологии, и разливают в стеклянные пробирки по 0,5 мл в каждую. Выбирают любой не содержащий фосфор буфер, применяемый в энзимологии, с концентрацией от 10-2 до 10-1 M с pH 6,0-9,0. Выбор буфера, не содержащего фосфор, обусловлен тем, что в результате протекания биохимической реакции выделяется фосфор неорганический, и фосфор, содержащийся в буфере, будет мешать определению содержания фосфора неорганического, выделяющегося при гидролизе.
Для приготовления контрольной пробы воды в пробирки вносят буфер, приготовленный на дистиллированной воде в том же объеме, как исследуемые образцы.
Плазматические мембраны вносят по 5 (до 50) мкл в каждую пробирку. Проводят преинкубацию плазматических мембран в течение 10-30 мин при комнатной температуре. Затем в каждую пробирку добавляют смесь, содержащую трис-АТФ (3·10-4-5·10-3 М), и источник ионов магния, например, MgSO4 (5·10-4-5·10-3 М). Трис-АТФ является буфером, используемым в биохимии для создания щелочной среды при исследовании белковых структур. Трис-АТФ добавляют к растворенной в воде АТФ, чтобы нейтрализовать кислую среду, которую создает в инкубационной среде АТФ. При добавлении Трис-АТФ создают рН среды раствора АТФ, близкую к 7,0, т.е. к физиологическим значениям, т.к. фермент оптимально функционирует только при физиологических значениям рН среды инкубации.
Для определения фонового содержания фосфора неорганического в присутствии Mg2+-АТФазы в несколько пробирок из вышеприведенных с исследуемой пробой воды и в несколько пробирок с буфером, приготовленным на дистиллированной воде, вносят хлорид натрия (5·10-3-10-2 М) и/или бикарбонат натрия (2·10-3-5·10-3 М). В пробы для определения фонового содержания фосфора неорганического дополнительно вводят анионы хлора Cl- и/или бикарбоната HCO3 - для активации фермента Mg2+-АТФазы. Все пробирки встряхивают и помещают в водяную баню на 5-60 мин и выдерживают там при температуре, соответствующей стандартным условиям протекания биохимических реакций. После инкубирования во все пробирки предпочтительно добавляют по 0,5 мл 10% раствора трихлоруксусной кислоты для остановки реакции.
Определяют содержание фосфора неорганического, который образуется в результате протекания реакции при инкубации, любым методом, например методом Чена. Для определения содержания фосфора неорганического во все пробирки вносят реагенты в следующей последовательности: 1,5 мл дистиллированной воды + 1,8 мл смеси (1 часть 30% Н2SO4+2 части Н2Oдист.+1 часть 5% аммония молибденовокислого) + 0,2 мл 0,25% хлористого олова и аккуратно перемешивают. Через 15 мин измеряют экстинцию окрашенных растворов (Е) на спектрофотометре при длине волны 650 нм.
Далее вычисляют процент активности Mg2+-АТФазы по формуле:
А - активность фермента Mg2+-АТФазы,
Еоп.Cl/HCO3 - средняя арифметическая экстинкция исследуемой пробы воды в присутствии Mg2+-АТФазы, активированной ионами хлора и/или бикарбоната;
Eоп.Mg-АТФ - средняя арифметическая экстинкция исследуемой пробы воды для определения фонового содержания фосфора неорганического в присутствии Mg2+-АТФазы;
Еконт.Cl/HCO3 - средняя арифметическая экстинция контрольного образца в присутствии Mg2+-АТФазы, активированной ионами хлора и/или бикарбоната;
Еконт.Mg-АТФ - средняя арифметическая экстинкция контрольного образца для определения фонового содержания фосфора неорганического в присутствии Mg2+-АТФазы;
По полученным данным оценивают уровень токсичности исследуемого образца водной среды, например, по 10-балльной шкале табл.1.
| Таблица 1. | |
| Активность фермента, % | Токсичность образца, балл |
| 90-100 | 1 |
| 80-90 | 2 |
| 70-80 | 3 |
| 60-70 | 4 |
| 50-60 | 5 |
| 40-50 | 6 |
| 30-40 | 7 |
| 20-30 | 8 |
| 10-20 | 9 |
| 0-10 | 10 |
Чем выше балл, тем токсичнее исследуемый образец.
Заявленный способ определения токсичности воды и реагент для определения токсичности воды подтверждаются следующими примерами.
Пример 1. Применение плазматических мембран мозга животных для определения степени токсичности водного образца, содержащего хлорорганический инсектицид -4-этилбициклофосфат.
Активность Mg2+-АТФазы измеряют по содержанию Фн, образующегося в ходе реакции, следующим образом.
Размораживают часть плазматических мембран (объем 0,5 мл). Берут 4 группы пробирок, по 4 пробирки в каждой. В 1 группу пробирок (контрольную) вносят по 0,5 мл буфера рН 7,4, а в каждую следующую группу пробирок по 0,5 мл проб анализируемой воды, содержащей 4-этилбициклофосфат, приготовленный на буфере ХЕПЕС-трис, рН 7,4 в концентрации соответственно 10-5 М; 5·10-6 M; 10-6 М. Плазматические мембраны вносят во все пробирки по 5-50 мкл. Преинкубирование плазматических мембран с буфером и 4-этилбициклофосфатом проводят в течение 10-20 мин при комнатной температуре. Во все пробирки добавляют по 300 мкл смеси, содержащей 7·10-4 М трис-АТФ и 7·10-4 М MgSO4. Кроме того, в 3 и 4 пробирку каждой группы вносят 10-2 М хлорида натрия и/или 2·10-З M бикарбоната натрия для получения фонового содержания фосфора неорганического. Пробирки встряхивают и помещают на 30 мин в водяную баню с температурой 37°С. После инкубации в каждую пробирку предпочтительно внести по 0,5 мл 10% трихлоруксусной кислоты для остановки реакции. Во всех пробирках проводят выявление содержания фосфора неорганического окрашиванием по методу Чена. Для этого в каждую пробирку вносят реагенты в следующей последовательности: 1,5 мл дистиллированной Н2O+1,8 мл смеси (1 часть 30% H2SO4+2 части Н2Oдист.+1 часть 5% аммония молибденовокислого) + 0,2 мл 0,25% хлористого олова и аккуратно перемешивают. Через 15 мин измеряют экстинцию окрашенных растворов (Е) на спектрофотометре при длине волны 650 нм.
Результаты представлены в табл.2:
| Табл.2. | ||
| Группа пробирок и концентрация 4-этилбициклофосфата, М | EMg-АТФ | ECl/HCO3 |
| I контрольная группа - Отсутствие 4-этилбициклофосфата | 1-0,200 2-0,210 Средняя - 0,205 | 3-0,330 4-0,340 Средняя - 0,335 |
| II опытная группа- Присутствие 10-6 М 4-этилбициклофосфата | 5-0,210 6-0,210 Средняя - 0,210 | 7-0,300 8-0,290 Средняя - 0,295 |
| III опытная группа- присутствие 5·10-6 М 4-этилбициклофосфата | 9-0,220 10-0,230 Средняя - 0,225 | 11-0,270 12-0,260 Средняя - 0,265 |
| IV опытная группа- присутствие 10-5 М 4-этилбициклофосфата | 13-0,230 14-0,240 Средняя - 0,235 | 15-0,250 16-0,240 Средняя - 0,245 |
Складывают результаты измерения, высчитывают средние значения (см. таблицу 2) и по формуле определяют активность фермента в процентах.
По полученной активности фермента, выраженной в процентах, оценивают степень токсичности водного образца по 10-балльной шкале, результаты представлены в табл.3:
| Табл.3 | ||
| Концентрация бициклофосфата, М | Активность фермента, % | Балл токсичности |
| 10-6 М | 65,4 | 4 |
| 5·10-6 М | 30,8 | 7 |
| 10-5 М | 7,7 | 10 |
Пример 2. Применение плазматических мембран мозга животных для определения степени токсичности водного образца, содержащего ароматический углеводород - фенол.
По полученной активности фермента, выраженной в процентах, оценивают степень токсичности водного образца по 10-балльной шкале, результаты представлены в табл.4
| Табл.4 | ||
| Концентрация фенола, М | Активность фермента, % | Балл токсичности |
| 10-5 М | 91 | 1 |
| 5·10-5 M | 65 | 4 |
| 10-4 М | 2 | 10 |
Пример 3. Применение плазматических мембран мозга животных для определения степени токсичности водного образца, содержащего фосфорорганическое соединение - карбафос.
По полученной активности фермента, выраженной в процентах, оценивают степень токсичности водного образца по 10-балльной шкале, результаты представлены в табл.5:
| Табл.5 | ||
| Концентрация карбафоса, М | Активность фермента, % | Балл токсичности |
| 10-4 М | 97 | 1 |
| 5·10-4 M | 17 | 9 |
| 10-3 М | 0 | 10 |
Пример 4. Применение плазматических мембран мозга животных для определения степени токсичности водного образца, содержащего тяжелые металлы - Zn2+.
По полученной активности фермента, выраженной в процентах, оценивают степень токсичности водного образца по 10-балльной шкале, результаты представлены в табл.6:
| Табл.6 | ||
| Концентрация Zn2+, M | Активность фермента, % | Балл токсичности |
| 10-5 М | 95 | 1 |
| 5·10-5 M | 53 | 5 |
| 10-4 М | 1 | 10 |
Из приведенных примеров видно, что заявленный способ, применение и реагент позволяют определять низкие концентрации различных классов токсических веществ, содержащихся в водной среде. Например, определяемые концентрации ароматических углеводородов составляют от 10-5 M, концентрации хлорорганических примесей составляют ниже 10-6 M, фосфорорганических соединений 10-4 М, а ионы тяжелых металлов от 10-5 М.
Использование заявленного способа определения токсичности водной среды позволяет дешево, эффективно и с высокой степенью надежности оценить загрязненность воды по 10-балльной системе. Активность фермента плазматических мембран в условиях заморозки сохраняется в течение 60 суток. Поэтому плазматические мембраны являются доступным биологическим материалом для реализации способа определения токсичности воды и получения реагента в любой момент. Измерение экстинции окрашенных растворов проводят на спектрофотометре, который возможно использовать в любой лаборатории, имеющей недорогостоящее оборудование. В связи с тем что заявленные способ и реагент исследуют степень загрязнения природных водоемов или сточных вод промышленных предприятий на уровне ферментной системы, это позволяет установить степень токсичности образца, избежав трудноулавливаемого нивелирования токсичности веществ, нередко наблюдаемого при использовании в качестве био-теста целого организма.
1. Способ определения токсичности водной среды, заключающийся в определении изменения активности Mg2+-АТФазы плазматических мембран мозга животных, активированной ионами хлора и/или бикарбоната.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что изменение активности Mg2+-АТФазы плазматических мембран мозга животных, активированной ионами хлора и/или бикарбоната, определяют по содержанию фосфора неорганического, образуемого при инкубации раствора, полученного путем смешения пробы водной среды, доведенной до физиологических рН не содержащим фосфор буфером, с раствором, содержащим трис-АТФ и источник ионов магния, а также источник ионов хлора и/или бикарбоната.
3. Способ определения токсичности водной среды, включающий смешение плазматических мембран мозга животных с пробой водной среды, доведенной до физиологических рН не содержащим фосфор буфером, добавление раствора, содержащего трис-АТФ и источник ионов магния, а также источник/источники ионов хлора и/или бикарбоната, инкубацию с образованием фосфора неорганического и определение токсичности по содержанию фосфора неорганического.
4. Способ по п.3, отличающийся тем, что дополнительно используют контрольную пробу с чистой средой, доведенной до физиологических рН не содержащим фосфор буфером, которую смешивают с плазматическими мембранами мозга животных, добавляют раствор трис-АТФ и источник ионов магния, а также источник/источники ионов хлора и/или бикарбоната соответственно составу раствора для пробы водной среды, инкубируют с образованием фосфора неорганического, определяют содержание фосфора неорганического в контрольной пробе, а определение токсичности водной среды по содержанию фосфора неорганического проводят с учетом содержания фосфора неорганического в контрольной пробе.
5. Способ по п.3 или 4, отличающийся тем, что в качестве источника ионов хлора используют соли хлора.
6. Способ по п.5, отличающийся тем, что в качестве солей хлора используют натрий хлористый или холин хлористый.
7. Способ по п.3 или 4, отличающийся тем, что в качестве источника ионов бикарбоната используют соль бикарбоната.
8. Способ по п.7, отличающийся тем, что в качестве соли бикарбоната используют натрия бикарбонат.
9. Способ по п.3 или 4, отличающийся тем, что в качестве источника ионов магния используют соли магния.
10. Способ по п.9, отличающийся тем, что в качестве источника соли магния используют сульфат магния или ацетат магния.
11. Способ по п.3, отличающийся тем, что дополнительно проводят преинкубирование после смешения плазматических мембран с пробой водной среды, доведенной до физиологических рН не содержащим фосфор буфером.
12. Способ по п.4, отличающийся тем, что дополнительно проводят преинкубирование после смешения плазматических мембран с контрольной пробой, доведенной до физиологических рН не содержащим фосфор буфером.
13. Способ по п.3 или 4, отличающийся тем, что содержание фосфора неорганического определяют путем измерения экстинкции окрашенных растворов на спектрофотометре.
14. Способ по п.4, отличающийся тем, что степень токсичности рассчитывают по отношению содержания фосфора неорганического в пробе с водной средой к содержанию фосфора неорганического в контрольной пробе.
15. Способ по п.3, отличающийся тем, что после смешения плазматических мембран мозга животных с пробой водной среды, доведенной до физиологических рН не содержащим фосфор буфером, полученный раствор разделяют на две части, основную и фоновую, в основную часть добавляют раствор, содержащий трис-АТФ и источник ионов магния, а также источник/источники ионов хлора и/или бикарбоната, в фоновую часть добавляют раствор, содержащий трис-АТФ и источник ионов магния, а определение токсичности водной среды по содержанию фосфора неорганического проводят с учетом фонового содержания фосфора неорганического.
16. Способ по п.4, отличающийся тем, что после смешения плазматических мембран мозга животных с пробой водной среды и контрольной пробой, доведенных до физиологических рН не содержащим фосфор буфером, полученные растворы разделяют на соответствующие две части, основную и фоновую, в основные части пробы водной среды и контрольной пробы добавляют раствор, содержащий трис-АТФ и источник ионов магния, а также источник/источники ионов хлора и/или бикарбоната, в фоновые части пробы водной среды и контрольной пробы добавляют раствор, содержащий трис-АТФ и источник ионов магния, а определение токсичности водной среды по содержанию фосфора неорганического проводят с учетом фонового содержания фосфора неорганического в водной среде и контрольной пробе.
17. Способ по п.16, отличающийся тем, что степень токсичности рассчитывают по отношению разности содержания фосфора неорганического в пробе с водной средой и фонового содержания фосфора неорганического в пробе с водной средой к разности содержания фосфора неорганического в пробе с водной средой к разности содержания фосфора неорганического в контрольной пробе и фонового содержания фосфора неорганического в контрольной пробе.
18. Реагент для определения токсичности водной среды, представляющий собой плазматические мембраны мозга животных, содержащие Mg2+-АТФазу, способную к активации ионами хлора и бикарбоната.
19. Реагент по п.18, отличающийся тем, что получен путем гомогенизации мозга животных с не содержащим фосфор буфером с физиологическим рН с последующим центрифугированием при скорости от 40 до 167 об/с, и отделением надосадочной жидкости, ее повторным центрифугированием при скорости от 300 до 3000 об/с, добавлением основной среды и ресуспендированием.
20. Применение Mg2+-АТФазы плазматических мембран мозга животных, активированной ионами хлора и/или бикарбоната, в качестве реагента для определения токсичности воды.
