Способ определения устойчивости растений подсолнечника к фузариозной гнили корзинки

Изобретение относится к области сельского хозяйства, в частности для выведения форм подсолнечника, устойчивых к корзиночной фузариозной гнили. Приготовливают инокулюма, далее инокулируют репродуктивный орган растения и проводят визуальную оценку иммунологической реакции растения и дифференциацию устойчивости. При этом в качестве инокулюма используют водную суспензию из двух видов 15-дневных чистых культур гриба фузариума F.sporotrichiella и F.moniliforme в соотношении 1:1 с концентрацией 4500-5000 спор/мл. Инокуляции подвергают корзинку в фазу бутонизации путем инъекции приготовленной суспензии в количестве 0,05-0,1 мл в ткани корзинки с тыльной ее стороны ближе к ее краю. Визуальную оценку иммунологической реакции растения проводят в фазу созревания корзинки по распространению поражения на тыльной ее поверхности. Дифференциацию устойчивости проводят по степени поражения этой поверхности. К устойчивым относят те, у которых площадь поражения 0-15%, к среднеустойчивым - 16-35%, к восприимчивым - 36-70%, к сильновосприимчивым - 71-100% от всей площади тыльной поверхности корзинки. Изобретение позволяет обеспечить близкие к естественным оптимальные условия заражения корзинок подсолнечника, снизить трудозатраты, повысить удобства в работе при повышении точности определения устойчивости. 2 з.п. ф-лы.

 

Изобретение относится к области сельского хозяйства и может быть использовано в селекции подсолнечника, в частности в выведении форм подсолнечника, устойчивых к корзиночной фузариозной гнили.

Известно более 200 видов и разновидностей грибов рода Fusarium. Они поражают многие сельскохозяйственные культуры - лен, клещевину, пшеницу, сою, подсолнечник и другие культуры. В Краснодарском крае, в частности, подсолнечник поражают 21 вид и разновидность фузариума. На подсолнечнике этот патоген вызывает гниль корней, корзинки, увядание всего растения, пятнистость листьев. Наиболее вредоносной является гниль корзинки. Поражение растений подсолнечника фузариозом приводит к снижению урожая и качества семян. Существуют разные способы защиты подсолнечника от фузариоза: агротехнические, химические, биологические и другие. Наиболее эффективным способом защиты подсолнечника от фузариоза является селекция подсолнечника на устойчивость к этому патогену, в частности к фузариозной гнили корзинки. Способов определения устойчивости подсолнечника к фузариозной гнили корзинки нет. Известны способы определения устойчивости подсолнечника к фузариозу в отношении его корневой системы.

Известен способ оценки растений на устойчивость к фузариозу по а.с. СССР №1598828, А 01 Н 1/04, Бюл. №38, 1990 г, согласно которому у проростков испытуемых образцов отделяют кончики корней длиной 3-5 мм и помещают их в мацерирующий раствор, содержащий ферменты: пектиназу, целлюлазу, хлористый кальций, итаконовую кислоту и воду. После инкубирования под микроскопом подсчитывают количество протопластов. В качестве стандарта используют сорта с известной степенью устойчивости. Наибольшее количество протопластов выделяется у восприимчивых сортов, наименьшее - у устойчивых.

Недостатком известного способа является его относительная сложность и недостаточная точность.

Известен также способ определения устойчивости подсолнечника к фузариозу по патенту РФ №2206981, А 01 Н 1/04, Бюл. №18, 2003 г (прототип), согласно которому приготовляют инокулюм, в качестве которого используют 15-дневную культуру гриба фузариума, выращенную в чашках Петри. Проращивают семена испытуемых образцов во влажной среде и высаживают двухдневные проростки на отперфорированные крышки чашек Петри так, чтобы кончики корней проростков контактировали с патогеном, находящимся в чашке Петри. Проростки выдерживают над патогеном в течение 6 ч, после чего зараженные проростки выдерживают в контакте со стерильной водой во влажной камере в течение 3-х дней. Визуальную оценку иммунологической реакции осуществляют по распространению поражения на корневую шейку и гипокотиль. К восприимчивым относят те растения, у которых поражение распространилось по всему корню на корневую шейку и гипокотиль, а к устойчивым - те растения, у которых поражение не распространилось на верхнюю треть корня и корневую шейку и из здоровой верхней трети корня образовались боковые корешки.

Недостатком прототипа является то, что этот способ позволяет вести селекцию подсолнечника на устойчивость именно корневой его системы к фузариозу и другим гнилям, а также недостаточная точность и относительная громоздкость.

Настоящим изобретением решается задача расширения арсенала методов и средств для осуществления селекции подсолнечника на устойчивость к гнилям, и в частности - к фузариозной гнили корзинки, а также повышение точности определения устойчивости, упрощение способа, снижение трудозатрат.

Цель изобретения - обеспечить оптимальные условия и надежность заражения корзинок подсолнечника и приблизить эти условия и оценку иммунитета растений к естественным, обеспечить одновременное проведение визуальной оценки устойчивости растений, дифференциации устойчивости и в целом уборки подсолнечника, использовать более простой метод заражения.

Технический результат достигается тем, что в известном способе определения устойчивости подсолнечника к фузариозу, включающем выращивание 15-дневной культуры гриба фузариума в чашках Петри для приготовления инокулюма, инокуляцию органа растения, визуальную оценку иммунологической реакции растения, согласно изобретению инокулюм приготовляют в виде водной суспензии из двух видов чистой культуры гриба фузариума Fusarium sporotrichiella и Fusarium moniliforme в соотношении 1:1, инокуляции подвергают репродуктивный орган растения - корзинку в фазу бутонизации путем инъекции приготовленной суспензии с концентрацией 4500-5000 спор/мл в количестве 0,05-0,1 мл в ткани корзинки с тыльной ее стороны ближе к ее краю, визуальную оценку иммунологической реакции растения проводят в фазу созревания корзинки по распространению поражения на тыльной ее поверхности, а также проводят дифференциацию устойчивости по степени поражения этой поверхности, относя к устойчивым те, у которых площадь поражения 0-15%, к среднеустойчивым - 16-35%, к восприимчивым - 36-70% и сильновосприимчивым - 71-100% от всей площади тыльной поверхности корзинки. При этом инъекцию инокулюма в ткани корзинки осуществляют в частности с помощью медицинского шприца или безигольного инъектора ("пистолета") на глубину 1-10 мм.

Сопоставительный анализ заявляемого технического решения с прототипом позволяет сделать вывод, что заявляемый способ определения устойчивости растений подсолнечника к фузариозной гнили корзинки отличается от известного условиями осуществления операции инокуляции:

а) формой используемого инокулюма: в прототипе - "твердый" гриб фузариума, а в заявляемом способе - водная суспензия из двух видов чистой культуры гриба фузариума F.sporotrichiella и F.moniliforme в соотношении 1:1;

б) органом растения, подвергаемым действию инокулюма в прототипе, являются корешки проростков, а в заявляемом изобретении - корзинки;

в) методом заражения: в прототипе - через контакт кончиков корешков с грибом, а в заявляемом изобретении - путем инъекции патогенной суспензии в ткани корзинки.

Кроме того, заявляемый способ отличается от прототипа порядком выполнения операции инокуляции во времени: в прототипе - в фазу 2-х дневных проростков, в заявляемом изобретении - в фазу бутонизации; а также сроком выполнения операции визуальной оценки иммунологической реакции растения: в прототипе - в фазу 5-ти дневных проростков, а в заявляемом изобретении - в фазу созревания корзинки.

Таким образом, заявляемый способ соответствует критерию патентоспособности НОВИЗНА.

Исследуя уровень техники в процессе проведения патентного поиска по всем видам сведений, общедоступных в печати, не обнаружили тождественных заявляемому способу решений, а заявляемый способ определения устойчивости растений подсолнечника к фузариозной гнили корзинки, включающий заявленную совокупность признаков, для специалиста в области селекции подсолнечника явным образом не следует из известного на сегодня существующего уровня техники.

Исследованиями было выявлено, что популяция фузариоза на корзинке подсолнечника включает 9 его видов. Доминирующими и наиболее патогенными видами фузариоза, поражающими корзинку в поле, т.е. в естественных условиях, являются F.sporotrichiella и F.moniliforme, частота их встречаемости варьирует от 32 до 45% от общего количества видов фузариоза на корзинке. Виды F.sporotrichiella и F.moniliforme присутствуют одновременно и в равных количествах в тканях пораженной фузариозом корзинки, причем заражение происходит аэрогенным путем в фазу бутонизации. Также выявлена оптимальная для заражения корзинки фузариозной гнилью концентрация водной суспензии инокулюма и другие необходимые условия, близкие к естественным, которые позволяют повысить точность определения устойчивости растений подсолнечника к фузариозу. Именно заявляемая совокупность признаков необходима и достаточна для достижения вышеуказанной цели. На основании этого можно сделать вывод о соответствии заявляемого изобретения критерию патентоспособности ИЗОБРЕТАТЕЛЬСКИЙ УРОВЕНЬ.

Заявляемое техническое решение соответствует и критерию патентоспособности ПРОМЫШЛЕННАЯ ПРИМЕНИМОСТЬ, т.к. оно может быть использовано в сельском хозяйстве. И, кроме того, в описании изобретения представлены средства и методы, с помощью которых возможно осуществление технического решения в том виде, как оно охарактеризовано в независимом пункте формулы изобретения.

Способ осуществляют следующим образом.

Начинают с того, что за 15 дней до бутонизации корзинок подсолнечника (срок бутонизации для сортов различных групп спелости разный и наступает на 32-38 день от начала всходов) начинают выращивание гриба фузариума в чашках Петри по общеизвестной методике для приготовления инокулюма, используя для этого два вида чистой культуры гриба фузариума F.sporotrichiella и F.moniliforme в соотношении 1:1. Из выращенной 15-дневной культуры патогена готовят водную суспензию инокулюма с концентрацией 4500-5000 спор/мл. Инокулируют корзинки подсолнечника путем "внутримышечной" инъекции приготовленной суспензии в количестве 0,05-0,1 мл в ткани корзинки с тыльной ее стороны ближе к ее краю. В фазу созревания корзинки осуществляют визуальную оценку иммунологической реакции растения по распространению поражения на тыльной ее поверхности, дифференцируя устойчивость по площади поражения этой поверхности: к устойчивым относят те, у которых площадь поражения 0-15%, к среднеустойчивым - 16-35%, к восприимчивым - 36-70% и к сильновосприимчивым - 71-100% от всей площади тыльной поверхности корзинки. При этом инъекцию инокулюма в ткани корзинки осуществляют, в частности, с помощью медицинского шприца или безигольного инъектора ("пистолета") на глубину, в частности, 1-10 мм.

Пример осуществления способа.

Опыт проводили в условиях Краснодарского края. Осенью года, предшествующего году проведения опыта, из пораженных фузариозом корзинок и семян выделяли чистые культуры видов F.sporotrichiella и F.moniliforme по общепринятой методике. Для этого брали пораженные фузариозом ткани корзинки с включенными в нее пораженными семенами, закладывали на влажную камеру и держали там до появления мицелия, который пересевали на питательную среду (картофельный агар). Через 13-15 дней под микроскопом определяли видовой состав и патогенные свойства гриба Fusarium. Из конидий доминирующих и наиболее патогенных видов F.sporotrichiella и F.moniliforme выращивали чистые культуры этих видов по общепринятой методике и для хранения их пересевали на "косой" агар в пробирки. Полученные чистые культуры F.sporotrichiella и F.moniliforme хранили в зимний период в холодильнике. Весной семена испытуемых сортов высевали в поле в оптимальные для развития растений сроки. Так как известно, что фаза бутонизации наступает на 32-38 день от начала всходов (в зависимости от группы скороспелости сорта), то фиксировали срок всходов и за 15 дней до фазы бутонизации корзинок подсолнечника начинали выращивание двух видов гриба фузариума F.sporotrichiella и F.moniliforme в отдельных чашках Петри по вышеуказанной методике. Затем готовили инокулюм из 15-дневных чистых культур этих видов фузариума F.sporotrichiella и F.moniliforme в соотношении 1:1 в виде водной суспензии по общепринятой методике: путем смыва дистиллированной водой конидий чистых культур патогена. Подсчет конидий осуществляли в камере Горяева также по общепринятой методике. Для этого к утолщенному предметному стеклу камеры с нанесенной на него сеткой осторожно притирали специальное покровное стекло так, чтобы по его краям появились цветные полосы интерференции, свидетельствующие о плотном прилегании покровного стекла к камере. Суспензию вносили под стекло, а затем под микроскопом подсчитывали количество спор в пяти больших квадратах и определяли среднее. Плотность спор в исходной суспензии вычисляли по формуле: N=a×50000, где а - среднее количество спор в одном большом квадрате. Концентрацию приготовленной суспензии доводили стерильной водой до 5000 спор/мл (достаточное количество инфекционного материала для заражения).

Инокуляцию корзинки проводили в утренние часы в фазу "бутонизации" (в фазу развития подсолнечника, наиболее восприимчевую к заражению корзинки фузариозом). Инъекцию патогенной суспензии осуществляли с помощью медицинского шприца в количестве 0,05 мл (одна капля) "внутримышечно" в ткани корзинки с тыльной ее стороны ближе к краю (как происходит заражение в естественных условиях) на глубину 1 мм.

В качестве контроля корзинки подсолнечника инокулировали тем же способом, но вместо патогена использовали дистиллированную воду. Определение устойчивости растений подсолнечника к фузариозной гнили корзинки осуществляли в фазу созревания. Для этого визуально делили тыльную поверхность корзинки на 8 секторов и также визуально определяли площадь поражения. Дифференциацию устойчивости проводили по величине площади пораженной поверхности по отношению к общей площади тыльной поверхности корзинки, относя к устойчивым те, у которых площадь поражения 0-15%; к среднеустойчивым - 16-35%; к восприимчивым - 36-70%; к сильновосприимчивым - 71-100%.

Определяли основные хозяйственно-ценные показатели семян, полученных от зараженных растений: массу 1000 семянок, масличность, урожайность, жирно-кислотный состав, энергию прорастания, всхожесть, а также диаметр корзинок. Эти показатели сравнивали с показателями семян, полученных от контрольных растений (не заражаемых). Показатели семян растений, отнесенных к устойчивым, совпадали с показателями семян контрольных растений, показатели же семян растений, отнесенных к среднеустойчивым, были несколько ниже, а показатели семян восприимчивых и сильновосприимчивых растений были значительно ниже, чем у контрольных (приблизительно в два раза). Семена с отобранных устойчивых растений высевали на следующий год, получали от них здоровое потомство и вовлекали в последующий селекционный процесс по методу B.C.Пустовойта.

Использование инокулюма в виде "водной суспензии чистой кульлуры гриба фузариума" обеспечивает простоту и легкость введения патогена в ткани корзинки и благоприятные условия для его действия там, так как в суспензии присутствует вода - один из необходимых факторов "работы" патогена, то есть обеспечивает надежность заражения корзинки, а следовательно, повышает точность определения устойчивости.

Приготовление инокулюма "из двух видов чистой культуры гриба фузариума F.sporotrichiella и F.moniliforme в соотношении 1:1", также повышает точность определения устойчивости растений подсолнечника к фузариозу, так как было выявлено, что наиболее доминирующими и патогенными видами его, поражающими корзинку в естественных условиях, являются именно эти два вида F.sporotrichiella и F.moniliforme.

Использование водной суспензии с концентрацией 4500-5000 спор/мл в количестве 0,05-0,1 мм является оптимальной инфекционной нагрузкой и обеспечивает необходимое и достаточное количество спор гриба для достоверного заражения корзинки. Концентрация менее 4500 спор/мл может не обеспечить достоверного заражения, а более 5000 спор/мл не будет соответствовать количественному уровню действия патогена в естественных условиях и не будет "работать" на повышение точности определения устойчивости, а приведет к искажению оценки и повышению трудозатрат.

Проведение инокуляции корзинки в фазу бутонизации "с тыльной ее стороны ближе к ее краю" и "оценки иммунологической реакции растения в фазу созревания корзинки" обеспечивает приближение к естественным условиям заражения и оценки, что повышает точность определения устойчивости и упрощает способ, так как дает возможность одновременно провести и оценку, и отбор, и уборку без дополнительных затрат.

Дифференциация устойчивости "по величине пораженной поверхности относительно общей поверхности тыльной стороны корзинки" упрощает способ, не делает его громоздким, как известные.

В целом вся совокупность существенных признаков заявленного изобретения обеспечивает оптимальные условия заражения корзинок подсолнечника и приближает их, а также оценку иммунитета растений к фузариозной гнили корзинок к естественным, снижает трудозатраты, повышает удобства в работе, т.е. достижение поставленной цели, что, в свою очередь, обеспечивает повышение точности определения устойчивости растений подсолнечника к фузариозу, расширяет арсенал методов и средств для осуществления селекции подсолнечника на устойчивость к гнилям, т.е. решение поставленной задачи.

1. Способ определения устойчивости растений подсолнечника к фузариозной гнили корзинки, включающий выращивание 15-дневной культуры гриба фузариума в чашках Петри для приготовления инокулюма, инокуляцию органа растения, визуальную оценку иммунологической реакции растения, отличающийся тем, что инокулюм приготавляют в виде водной суспензии из двух видов чистой культуры гриба фузариума Fusarium sporotrichiella и Fusarium moniliforme в соотношении 1:1, инокуляции подвергают репродуктивный орган растения - корзинку в фазу бутонизации путем инъекции приготовленной суспензии с концентрацией 4500-5000 спор/мл в количестве 0,05-0,1 мл в ткани корзинки с тыльной ее стороны ближе к ее краю, визуальную оценку иммунологической реакции растения проводят в фазу созревания корзинки по распространению поражения на тыльной ее поверхности, а также проводят дифференциацию устойчивости по степени поражения этой поверхности, относя к устойчивым те, у которых площадь поражения 0-15%, к среднеустойчивым - 16-35%, к восприимчивым - 36-70% и к сильновосприимчивым -71-100% от всей площади тыльной поверхности корзинки.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что инъекцию инокулюма в ткани корзинки осуществляют с помощью медицинского шприца или безигольного инъектора ("пистолета").

3. Способ по пп.1 и 2, отличающийся тем, что инъекцию осуществляют на глубину 1-10 мм.