Способ получения коллагена из костной ткани

Изобретение относится к медицине, а именно к технологии выделения биологически активных веществ и получения биоматериалов из костной ткани. Сущность способа: после очистки кость распиливают на пластины толщиной от 0,1 до 2,0 см, промывают раствором 0,1 М фосфатного буфера с рН 5,8-6,0, переваривают в растворе активированного 0,125-0,325 % папаина при 60°С в течение 24 часов, пластины промывают пятью объемами воды при 60°С, обрабатывают при комнатной температуре в течение 10-24 часов раствором 0,4 Н щелочи, отмывают проточной водой, обрабатывают 3 % перекисью водорода в течение 4 часов, затем обезжиривают в смеси этанол : хлороформ в соотношении 1:2, меняя раствор на новый не менее 2 раз, проводят декальцинацию в 0,5-1,0 Н соляной кислоте, отмывают водой очищенной, затем этанолом и высушивают при комнатной температуре, фасуют и стерилизуют радиационным облучением. Использование способа позволяет получить высококачественный низкоантигенный костный коллаген с сохранной структурой.

 

Изобретение относится к медицине, а более конкретно к биохимии и технологии выделения биологических веществ, а также для изготовления биоматериалов, которые применяются в качестве пластического материала при оперативном замещении костных дефектов при деструкции костной ткани, удалении кист, опухолей, а также в качестве носителя активных веществ и лекарственных средств, в пластической хирургии при восстановлении объема органа или ткани.

Известен способ получения коллагена из костной ткани для использования в хирургической стоматологии. По этому способу кость механически очищают, размалывают до крошки, подвергают гидролизу в смеси раствора 0.4 Н гидроксида натрия и этанола в соотношении 1:1, нейтрализуют до рН 6.8-7.8, центрифугируют, осадок обрабатывают активированным 0.125% раствором папаина при 37°С, затем повторно гидролизуют смесью гидроксида натрия и этанола, диализуют против воды, замораживают и лиофилизируют - Патент РФ №2161976 от 20 января 2001, который выбран за прототип, поскольку наиболее близок по своему техническому решению к предлагаемому изобретению.

Недостатками указанного способа является то, что такая обработка прежде всего не обеспечивает сохранности структуры костного коллагена и полного освобождения данной ткани от антигенов - неколлагеновых белков, липидов, липопротеидов и других веществ, которые снижают его биосовместимость.

Задачей изобретения является повышение качества выделения коллагена из костной ткани и получения на его основе биоматериалов для использования в стоматологии, травматологии и ортопедии путем сохранения его структуры, снижения его антигенных свойств и повышения биосовместимости.

Техническим результатом, достигаемым при использовании изобретения, является получение сохранного по структуре коллагена из костной ткани, низкоантигенного материала, который может широко использоваться для получения ряда изделий медицинского назначения, таких как материалы для замещения костных дефектов, а также в качестве носителя биологически активных веществ и клеток, и являться основой для других изделий медицинского назначения.

Технический результат достигается тем, что после очистки кость распиливают на пластины толщиной от 0,1 до 2,0 см, помещают в раствор 0,1 М фосфатного буфера с рН 5,8-6,0, переваривают в растворе активированного 0,125-0,325% папаина при 60°С в течение 24 часов, пластины промывают пятью объемами воды при 60°С, обрабатывают при комнатной температуре в течение 10-24 часов раствором 0,4 Н щелочи, отмывают проточной водой, обрабатывают 3% перекисью водорода на магнитной мешалке в течение 4 часов, затем обезжиривают в смеси этанол : хлороформ в соотношении 1:2, меняя раствор на новый не менее 2 раз, проводят декальцинацию в 0.5-1Н соляной кислоте, отмывают водой очищенной, затем этанолом, высушивают при комнатной температуре, фасуют и стерилизуют радиационным облучением.

Материалом для получения костного коллагена и изделий на его основе может являться губчатая или кортикальная кость человека или позвоночных животных, например свиней, баранов, кур, гусей и т.д. Эта ткань в основном состоит из коллагена I и III типа и характеризуется низкой растворимостью и высокой устойчивостью к действию коллагеназы. Этот вид коллагена является наиболее распространенным в изделиях медицинского назначения, имплантируемых в ткани.

Технология приготовления таких биоимплантатов требует начальной механической обработки ткани, когда кость очищается от остатков мягких тканей и крови.

Существенным признаком изобретения является порядок обработки кости. После механической обработки ткань распиливают на пластины толщиной не менее 0,1 см и не более 2,0 см, поскольку эти размеры являются наиболее оптимальными при обработке данной ткани растворами.

Минимальный размер пластин толщиной от 0,1 см и максимальный 2,0 см определены нами опытным путем. Так при увеличении толщины пластины возникают трудности с доступностью фермента и других элюэнтов к активным местам субстрата, а также при отмывке таких пластин от применяемых по технологии растворов. При уменьшении толщины пластин имеются серьезные проблемы с сохранением целостности костного коллагена в процессе его обработки.

После нарезки ткань промывают 2-кратным объемом 0,1 М фосфатного буфера с рН 5,8 до 6,0. Отмывка в буфере предшествует перевариванию ферментом и создает оптимальные условия для последующего действия фермента папаина при данных значениях рН, сохраняя нативную структуру костного коллагена.

В нативном состоянии волокна костного коллагена «защищены» от действия протеолитических агентов слоем гидроксиапатита и поэтому при переваривании ферментом в условиях повышения температуры до 60°С коллагеновые волокна не подвергаются деструкции и сохраняют свою структуру. В то же время в костной ткани имеются активные места для воздействия фермента, способного эффективно разрушать неколлагеновые белки, протеогликаны и гликопртеины.

В зависимости от структуры костной ткани и ее толщины берется различная концентрация фермента. Так при толщине губчатой кости в 0,1 см для переваривания достаточно концентрации 0,125% активированного папаина, а при толщине губчатой кости 2,0 см или в случае обработки кортикальной кости концентрация папаина увеличивается до 0,325%.

Оптимальное действие папаина на костную ткань при переваривании белков и протеогликанов составляет 24 часа при 60°С. При этом из костной ткани удаляется максимальное количество неколлагеновых белков и протеогликанов. Нами экспериментально установлено, что через 24 часа из 1 кг костей в перевар выделяется около 2 г гликоза-миногликанов, что практически равно теоретически рассчитанному количеству сГАГ для данного типа ткани (Стейси М., Баркер С. Углеводы живой ткани. М., Мир,1965, с.-35-38).

Отмывку костных пластин после переваривания их ферментом проводят пятью объемами воды при 60°С. Эта операция оказывается достаточной, позволяет отмыть все продукты реакции субстрата с ферментом и удалить сам фермент.

Окончательное разрушение неколлагеновых белков достигается после обработки недекальцинированной кости щелочью.

Обработку костной ткани 0,4 Н Na ОН (гидроксидом натрия) проводят в течение от 10 до 24 часов при комнатной температуре. Щелочь наиболее эффективный агент разрушающий белки, находящиеся на поверхности костной структуры, а также вирусные частицы, которыми может быть контаминирована костная ткань. Минеральная составляющая кости не позволяет раствору 0,4 Н щелочи активно воздействовать на структуру костного коллагена даже после 24 часового воздействия. Эта стадия должна проводится при комнатной температуре - 18°С, т.к. при меньшей температуре эффективность воздействия значительно снижается, а при повышении температуры структура коллагена может разрушаться.

Губчатую кость с размером пластин 0,1 см обрабатывают в течение 10 часов, так как за это время белковые молекулы, находящиеся на поверхности коллагеновых волокон, полностью разрушаются, а более толстые пластины и кортикальную кость обрабатывают в течение 24 часов, после этого времени белок в смывах не обнаруживается.

Обработку материала проводят с перемешиванием на магнитной мешалке, что позволяет обеспечить лучшую доступность растворов к местам их воздействия.

После обработки щелочью пластины отмывают водой в пяти сменах и далее обрабатывают их 3 % перекисью водорода в течение 4 часов.

Такая обработка, во-первых, позволяет удалить остатки неколлагеновых белков и, во-вторых, разрушить ряд других соединений, таких как пигменты, липиды, трудно растворимые соли и т.д. Данный эффект очевиден при обработке пластин с максимальным размером толщины 2,0 см. Для лучшей доступности раствора такую обработку также следует проводить на магнитной мешалке.

После отмывки перекиси водорода костные пластинки подвергаются обезжириванию и декальцинации.

В отличие от всех известных способов получения костного материала к обезжириванию и декальцинации в настоящем способе приступают только после обработки кости ферментом, щелочью и перекисью постольку, поскольку из полученной недекальцинированной кости уже удалены основные антигены, а костный коллаген, благодаря покрывающему практически каждое костное волокно защитному слою гидроксиапатита, остается практически не измененным.

В костной ткани содержится значительное количество липидов и их соединений с белками и углеводами. В обработанных ферментом костных пластинах липиды находятся как в свободном состоянии, так и в виде соединений с сахарами - липополисахаридов, которые являются активными антигенами и могут обуславливать различные воспалительные осложнения. Именно для удаления липидов в способ введена обработка костных пластин в смеси хлороформа и этилового спирта в соотношении 1:2 на стадии, когда основная строма материала уже очищена от других ее составляющих. Материал обрабатывают в смеси не менее двух раз, поскольку это позволяет обеспечить полноценный выход липидов из плотной части ткани (кортикальная кость), что определяется по содержанию липидов в 1 г ткани по сухому весу.

После обезжиривания костные пластины отмывают водой и проводят декальцинацию в 0,5-1 Н соляной кислоте (HCl).

Как правило, тонкие пластины губчатой кости обрабатывают 0,5 Н HCl, а более толстые - до 0,3 см в 1Н HCl, до полного исчезновения ионов Са^+-. Обработку материала проводят с перемешиванием на магнитной мешалке, что позволяет обеспечить лучшую доступность раствору.

После этого полученный костный коллаген отмывают в пяти сменах воды очищенной, затем этанолом, высушивают при комнатной температуре, фасуют и стерилизуют.

Получение материала контролируется на каждой стадии обработки и включает основные методики принятые для данного типа материалов.

Отсутствие протегликанов определяли спектрофотометрически по окрашиванию 1,9-диметиленовым синим при длине волны 535 нм по методу Farndel.

Выход белка определяли фармакопейным методом по Lowry спектроскопически при длине волны 400 нм и наличие остатков коллагена в смывах - методом определения оксипролина по Кьельдалю.

Наличие соли при декальцинации определяли качественной реакцией на Са⁺⁺.

Контроль на липиды делали по окраске суданом.

После высушивания и стерилизации ставили контрольные измерения на содержание в материале неколлагеновых белков по сравнению с прототипом.

Так в материале, обработанном по способу описанному в прототипе, определяется 4-5% неколлагеновых белков, а по предлагаемому способу только 1-2% по сухому весу материала. Таким образом, предлагаемый способ позволяет снизить антигенность материала в 2 раза по сравнению с прототипом.

Сохранность структуры костного коллагена определяли путем исследования гистологических срезов, электронно-микроскопически и методом сканирующей микроскопии. С помощью данных методов было установлено, что пористо-волокнистая структура костного коллагена имеет типичный вид без каких-либо изменений и нарушений.

Таким образом, предлагаемый способ обработки ткани позволяет снизить антигенность материала, сохранить его структуру и повысить его качественные характеристики, обуславливающие его биосовместимость.

Краткая технология получения материала.

Прошедшую ветеринарный контроль кость свиньи очищают от мышц и сухожилий, распиливают на пластины толщиной 2,0 см и помещают в раствор 0,1 М фосфатного буфера с рН 5,8-6,0 на 2-3 часа, буфер сливают и пластины помещают на 24 часа в раствор активированного 0,325% папаина в термостат при 60°С. Надосадок сливают, после чего пластины промывают пятью объемами воды при 60°С и помещают на 24 часа в 0,4 Н раствор щелочи на магнитную мешалку, пластины отмывают и помещают в 3 % перекись водорода на магнитную мешалку на 4 часа. Затем материал обрабатывают смесью этанол : хлороформ в соотношении 1:2 и меняют данный раствор на новый не менее 2 раз. После отмывки этанолом пластины помещают в 0,1 Н соляную кислоту, отмывают кислоту водой и промывают пластины очищенной водой и этанолом. Материал высушивают, фасуют и стерилизуют радиационным способом.

Приведенные выше действия приводят к снижению антигенности и сохранности структуры коллагена.

После обработки костный коллаген проходит количественный и качественный анализ, как описано выше.

Для лучшего понимания сущности изобретение поясняется примерами конкретного исполнения.

Пример 1.

Донорскую кость человека, прошедшую необходимые контрольные анализы, механически очищают от мышц и сухожилий, распиливают на пластины толщиной 0,1 см, помещают в раствор 0,1 М фосфатного буфера с рН 5,8-6,0 на 2-3 часа, после чего буфер сливают и пластины переносят в раствор активированного 0,125% папаина при 60°С в термостат на 24 часа, затем надосадок сливают, пластины промывают пятью объемами воды при 60°С и помещают на 24 часа в 0,4 Н раствор щелочи при комнатной температуре на магнитную мешалку, пластины промывают водой и обрабатывают 3 % перекисью водорода на магнитной мешалке в течение 4 часов, отмывают и помещают их в смесь этанол : хлороформ в соотношении 1: 2, меняя раствор на новый не менее 2 раз, отмывают этанолом и проводят декальцинацию в 0.5 Н соляной кислоте, кислоту отмывают, материал промывают очищенной водой, высушивают и фасуют.

Проводят контроли на наличие протеогликанов, белка и липидов.

Обработанный таким образом материал высушивают при комнатной температуре, лиофилизируют, упаковывают и стерилизуют радиационным способом.

Аналогично обрабатывают и кости животных толщиной 0,1 см.

Материалы применяют для замещения костных дефектов при хирургических вмешательствах в стоматологии, ортопедии и травматологии. В экспериментальных и научных целях костный коллаген может быть насыщен биологически активными веществами, а также может быть носителем клеток (стволовых, эмбриональных и дугах видов клеток).

Пример 2.

Прошедшую необходимый ветеринарный контроль губчатую кость свиньи механически очищают от мышц и сухожилий, распиливают на пластины толщиной 1,0 см, помещают в раствор 0,1 М фосфатного буфера с рН 5,8-6,0 на 2-3 часа, после чего буфер сливают и пластины переносят в раствор активированного 0,225% папаина при 60°С в термостат на 24 часа, затем надосадок сливают, пластины промывают пятью объемами воды при 60°С и помещают на 24 часа в 0,4 Н раствор щелочи при комнатной температуре на магнитную мешалку, пластины промывают и обрабатывают 3 % перекисью водорода на магнитной мешалке в течение 4 часов, затем их помещают в смесь этанол : хлороформ в соотношении 1:2, меняя раствор на новый не менее 2 раз, отмывают этанолом, проводят декальцинацию в 0.9 Н соляной кислоте и вновь промывают очищенной водой.

Проводят контроли на наличие протеогликанов, белка и липидов.

Обработанный таким образом материал высушивают при комнатной температуре, лиофилизируют, упаковывают и стерилизуют радиационным способом.

Материалы применяют для замещения костных дефектов при хирургических вмешательствах в стоматологии, ортопедии и травматологии. В экспериментальных и научных целях костный коллаген может быть насыщен биологически активными веществами, а также может быть использован в качестве носителя клеток.

Пример 3.

Прошедшую необходимый ветеринарный контроль кортикальную кость свиньи механически очищают от мышц и сухожилий, распиливают на пластины толщиной 2,0 см, помещают в раствор 0,1 М фосфатного буфера с рН 5,8-6,0 на 2-3 часа, после чего буфер сливают и переносят пластины в раствор активированного 0,325% папаина при 60°С в термостат на 24 часа, затем надосадок сливают, пластины промывают пятью объемами воды при 60°С и помещают на 24 часа в 0,4 Н раствор щелочи при комнатной температуре на магнитную мешалку, промывают пластины и обрабатывают 3 % перекисью водорода на магнитной мешалке в течение 4 часов, помещают их в смесь этанол : хлороформ в соотношении 1:2, меняя раствор на новый не менее 2 раз, отмывают этанолом и проводят декальцинацию в 1,0 Н соляной кислоте, вновь промывают очищенной водой и высушивают.

Проводят контроли на наличие протеогликанов, белка и липидов.

Обработанный таким образом материал высушивают при комнатной температуре, лиофилизируют, упаковывают и стерилизуют радиационным способом.

Материалы применяют для замещения костных дефектов при хирургических вмешательствах в стоматологии, ортопедии и травматологии. В экспериментальных и научных целях костный коллаген может быть насыщен биологически активными веществами, а также может быть использован в качестве носителя клеток.

Использование предлагаемого способа позволяет получить высококачественный низкоантигенный костный коллаген с сохранной структурой. Применение такого биоматериала значительно повышает его биосовместимомть и снижает безопасность его применения, особенно при длительном нахождении имплантатов, изготовленных на его основе, в организме.

Способ получения коллагена из костной ткани, включающий очистку, обработку ферментом папаином и раствором щелочи, нейтрализацию, обезжиривание, деминерализацию и высушивание, отличающийся тем, что после очистки кость распиливают на пластины толщиной от 0,1 до 2,0 см, промывают раствором 0,1 М фосфатного буфера с рН 5,8-6,0, переваривают в растворе активированного 0,125-0,325 % папаина при 60°С в течение 24 ч, пластины промывают 5-ю объемами воды при 60°С, обрабатывают при комнатной температуре в течение 10-24 ч раствором 0,4 Н щелочи, отмывают проточной водой, обрабатывают 3 %-ной перекисью водорода в течение 4 ч, затем обезжиривают в смеси этанол: хлороформ в соотношении 1:2, меняя раствор на новый не менее 2 раз, проводят декальцинацию в 0,5-1,0 Н соляной кислоте, отмывают водой очищенной, затем этанолом и высушивают при комнатной температуре, фасуют и стерилизуют радиационным облучением.