Способ приготовления биологически активного препарата из пантов
Владельцы патента RU 2268059:
Всероссийский научно-исследовательский институт пантового оленеводства (ВНИИПО) (RU)
Изобретение относится к производству фармакологических препаратов с выраженной биологической активностью и может быть использовано в косметической промышленности, бальнеологии, а также в медицине и ветеринарии. Сущность способа заключается в том, что способ включает ферментативный гидролиз измельченных до 100 мкм пантов, при этом перед ферментацией пантовую муку замешивают в двойном объеме воды, а через 1,5-2 часа добавляют ферментативный комплекс суспензии поджелудочной железы, полученной путем измельчения на гомогенизаторе поджелудочных желез крупного рогатого скота, из расчета 10% к массе муки. Гидролиз проводят в течение 6 часов при 38-40°С, а экстракцию водой в соотношении 1:5 в течение 6 часов и перед фильтрацией центрифугируют. Препарат не содержит агрессивных сред, присущих другим способам переработки пантового сырья. Использование способа позволяет получить сложную многокомпонентную смесь, включающую белки, аминокислоты, липиды, минеральные вещества, гормоны, вещества в комплексе, обладающие выраженной биологической активностью. 5 табл.
Изобретение относится к производству фармакологических препаратов с выраженной биологической активностью и может быть использовано в косметической промышленности, бальнеологии, а также в медицине и ветеринарии.
Известен способ получения спиртового экстракта пантов путем нагревания до 50°С 15% смеси пантовой муки (измельченные панты) в 50% этиловом спирте и выдержки при этой температуре в течение 3-х часов (см. Сборник научных трудов "Пантокрин", Горно-Алтайск, 1969, с. 18-20). Согласно биохимическим исследованиям спиртового экстракта пантов в нем превалировало содержание липидной фракции, составными частями которой являются жиры, фосфатиды, сульфатиды, цереброзиды, стерины и их производные. Однако из 43,35 г белка, содержащего в 100 г пантовой муки, в экстракт переходило всего 0,15 г (0,35%).
Известен способ гидролитической экстракции пантов в 6 н. соляной кислоте при 160°С в течение 24 часов со степенью извлечения белка всего 0,8%. Кроме этого, высокотемпературный режим разрушает биологически активные вещества, а кислотность предопределяет обязательное наличие операции по нейтрализации кислоты с последующим удалением солей. Следует отметить также, что при обработке кислотами и нагревании происходит необратимое разрушение белка - денатурация (см. Сборник научных трудов "Пантокрин", Горно-Алтайск, 1969, с.29-32).
Известен "Способ приготовления препарата для животных из растительного и животного сырья", включающий последовательное воздействие кислотного и ферментативного гидролиза с последующей фиксацией продукта спиртом и йодом. В качестве животного сырья в способе используют отходы фармпереработки пантов, а в качестве ферментов - пепсин и бычью желчь (см. патент PU 2086244, МКИ А 61 К 35/32). Препарат назван пантогидролизатом. Способ характеризуется многоступенчатостью, применением химикатов, которые после проведения реакции нейтрализации образуют соли, а в связи с тем, что препарат предназначен для внесения в корм животным, соли не выводятся, что не приемлемо при использовании для нужд человека. Процесс длителен (от 4 до 8 дней), а наличие кислотного гидролиза предопределяет необратимое разрушение белка. Кроме этого, при нагревании до 70-75° снижается растворимость белков, так видимое выпадение в осадок для альбумина наступает при 67°С, для глобулинов - 69°С, для фибриногена - 56°С.
Известен способ получения пантолизата, включающий кислотно-ферментативный гидролиз измельченных пантов в искусственном желудочном соке. Процесс ведут при температуре от 20 до 42°С. Однако использование кислоты обуславливает обязательное наличие операции нейтрализации с последующим удалением солей, а также необратимое разрушение белка (см. патент RU 2112396, МКИ A 23 j 1/10, A 23 j 3/34, А 61 К 35/32 - прототип).
Необходима разработка способа приготовления препарата из пантов, характеризуемого простотой и обеспечивающего высокое содержание биологически активных веществ, в частности белков, наследующих основные факторы биологической активности пантов, без использования агрессивных сред в виде кислот и щелочей.
Сущность способа заключается в том, что ферментативный гидролиз измельченных пантов (пантовая мука со степенью размола не более 100 мкм) проводят без использования агрессивных сред в виде кислот и щелочей путем предварительного замачивания пантовой муки водой на 1,5-2 часа (частичный гидролиз) с последующим введением в суспензию ферментативного комплекса суспензии поджелудочной железы. Ферментативный комплекс суспензии поджелудочной железы представляет собой размолотые на гомогенизаторе поджелудочные железы (в свежем или замороженном виде) крупного рогатого скота и содержит ферменты трипсиноген (претрипсин), трипсин А и В, хитотрипсин, карбоксипептидазу и эластазу, расщепляющие белки до аминокислот, аминопепсидазу, расщепляющую полипептиды, амилазу (диастазу), инвертазу и лактазу, превращающие сложные углеводы в простые.
Ферментативный комплекс вводится из расчета 10% к массе пантовой муки, при этом гидролиз проводят в течение 6 часов при 38-40°С, затем полученный гидролизат экстрагируют водой в соотношении 1:5 в течение 6 часов и перед фильтрацией центрифугируют.
Пример. Пантовую муку (размолотые консервированные панты) со степенью размола не более 100 мкм, для обеспечения гомогенной влажной массы, замешивают при комнатной температуре в двойном (массовом) объеме дистиллированной воды. Через 1,5-2 часа прибавляют к полученной суспензии ферментный комплекс суспензии поджелудочной железы (СПЖ) из расчета 10% к массе суспензии. Ферментный комплекс суспензии поджелудочной железы (СПЖ) готовят из поджелудочных желез (в свежем или замороженном виде) крупного рогатого скота путем гомогенизации. После тщательного перемешивания субстрат помещали в термостат и в течение 6 часов выдерживали при температуре 38-40°С. По окончании срока ферментации к субстрату добавляли воду из расчета соотношения субстрата и воды 1:5 и экстрагировали в течение 6 часов на установке РК 5 М с последующим центрифугированием и фильтрацией.
Анализ данных проведенных исследований по испытанию различных способов экстракции пантов показал, что на выход в экстракт биологически активных веществ оказывает влияние природа экстрагента и его концентрация. Так при экстракции пантов водным раствором в экстракт переходит до 50% белковой фракции. При использовании в качестве экстрагента 40% этилового спирта выход белковой фракции составил 44,7%, при 70%-ном спирте - 35,5% белков. Экстракция белковых компонентов слабыми растворами спирта (ниже 30%) приводит к тому, что при охлаждении экстракта происходит желирование. Кроме этого, уже при применении 50% спирта начинает наблюдаться частичная денатурация белка, а под действием низких температур (например, в процессе приготовления готовой формы препарата) - выпадение в осадок. Сравнительный выход экстрактивных веществ в (%) из пантов в зависимости от способа экстракции (вида экстрагента) приведен (в пересчете на абсолютно сухое вещество) в таблице 1.
| Таблица 1 | |||
| Показатели | Способ экстракции | ||
| Водный экстракт | 40% раствором этинола | 70% раствором этинола | |
| Выход экстрактивных веществ | 17,2 | 13,41 | 11,68 |
| в том числе: белковая фракция | 8,08 | 5,99 | 4,15 |
| зола | 0,34 | 0,26 | 0,23 |
| липидная фракция | 0,08 | 0,15 | 0,40 |
| Прочие составляющие | 8,5 | 7,01 | 6,9 |
В целях определения оптимального времени режимов ферментации пантового сырья через каждые 2 часа проводили отбор проб с последующей экстракцией и аминокислотным анализом по схеме, отраженной в таблице 2.
| Таблица 2 | |||||
| Время экстракции, час | Время ферментации, час | ||||
| 2 | 4 | 6 | 8 | 10 | |
| 2 | + | + | + | + | + |
| 4 | + | ++ | ++ | ++ | ++ |
| 6 | ++ | ++ | +++ | +++ | +++ |
| 8 | +++ | +++ | +++ | +++ | +++ |
| + - + + + рост степени экстракции |
Как видно из таблицы 2, после 6 часов экстрагирования субстрата ферментированного в течение 2, 4, 6, 8 или 10 часов результат практически не изменялся, т.е. показатели аминокислотного состава экстрактов увеличивались по мере увеличения время экстракции до 6 часов. Оптимальный режим процесса, таким образом, характеризовался шестью часами ферментации при шестичасовой экстракции. Динамика накопления свободных (св.) аминокислот (г/100 г белка) в пантовом субстрате в зависимости от продолжительности ферментации при воздействии ферментативного комплекса (СПЖ) и 6-часовой экстракции приведена в таблице 3.
| Таблица 3 | ||||||||
| Аминокислота | Продолжительность ферментации, час | |||||||
| 2 | 4 | 6 | 8 | |||||
| Св. | Полн. | Св. | Полн. | Св. | Полн. | Св. | Полн. | |
| Незаменимые, г/100 г белка | 10,1 | 21,22 | 10,41 | 20,83 | 17,6 | 33,8 | 14,51 | 36,4 |
| Изолейцин | 0,6 | 1,6 | 0,6 | 1,6 | 1,7 | 4,1 | 0,5 | 1,5 |
| Лейцин | 2,1 | 3,9 | 2,1 | 3,7 | 4.4 | 7,4 | 3,0 | 8,3 |
| Лизин | 2,1 | 3 | 2,3 | 3,1 | 1,3 | 2,7 | 2,7 | 7,7 |
| Метионин + цистин | 0,73 | 1,22 | 0,73 | 1,18 | 1,4 | 1,9 | 1,15 | 1,3 |
| Тирозин + фенилаланин | 1,7 | 5,2 | 1,5 | 5,4 | 4,8 | 7,5 | 3,0 | 7,6 |
| Треонин | 1,6 | 2,3 | 1,4 | 2,4 | 1,1 | 3,2 | 1,0 | 3,2 |
| Триптофан | 0,07 | 0,9 | 0,08 | 0,25 | 0,5 | 1,1 | 0,06 | 0,8 |
| Валин | 1,2 | 3,1 | 1,7 | 3,2 | 2,4 | 5,9 | 3,1 | 6,0 |
| Заменимые, г/100 г белка | 6,5 | 64,8 | 12,8 | 64,6 | 17,0 | 59,1 | 17,2 | 56,2 |
| Аланин | 0,7 | 7,6 | 1,5 | 7,7 | 2,4 | 6,3 | 2,3 | 6,8 |
| Аспарагиновая кислота | 0,2 | 6,9 | 0,9 | 6,7 | 1,8 | 10,5 | 3,2 | 9,6 |
| Гистидин | 1,4 | 7,9 | 1,2 | 7,6 | 1,5 | 3,9 | 1,6 | 4,9 |
| Глицин | 0.2 | 12,0 | 2,6 | 12,2 | 0,8 | 7,9 | 2,6 | 8,4 |
| Глутаминовая кислота | 0,9 | 13,9 | 2,2 | 138 | 3,9 | 11,8 | 3,8 | 14,6 |
| Пролин | 0,1 | 7,7 | 1,5 | 7,5 | 1,1 | 7,4 | 0,9 | 3,3 |
| Серин | 0,5 | 2,7 | 0,6 | 2,8 | 1,8 | 4,9 | 1,3 | 3,7 |
| Итого: | 16,6 | 86,2 | 23,21 | 85,43 | 34,6 | 92,9 | 31,71 | 92,6 |
| E/N | 1,44 | 0,31 | 0,78 | 0,31 | 0,91 | 0,54 | 0,80 | 0,62 |
Из приведенных табличных данных видно, что степень конверсии белка в субстрат возрастает в процессе ферментации в течение 6 часов. Результат восьмичасовой деятельности процесса ферментации, вероятно в связи с обратимостью процесса, был ниже в среднем на 9,4%, а четырехчасовая ферментация обеспечила 67 % выход белковой фракции по отношению к шестичасовому процессу.
Устойчивость белков очень различна. Гидролиз приводит к распаду полипептидных связей с образованием свободных аминокислот. Ферменты, разрушающие пептидные связи (протеазы) обладают обычно селективным действием, так что при гидролизе с участием фермента могут образовываться вместо отдельных аминокислот высокомолекулярные продукты.
Наибольшая сбалансированность аминокислотного состава (E/N - 0,91) достигалась также в результате ферментативного гидролиза пантовой муки в течение 6 часов.
При дальнейшем увеличении времени ферментации (до 10 часов) изменения в обогащении гидролизата свободными аминокислотами не значительны.
Исследование образцов экстракта на спектрометре Н-ЯМЗ-500 мГц при температуре 30°С показало, что экстракт представляет собой многокомпонентную смесь, в состав которой входят вещества с энергией смещения 8,41-6,47, характерной для свободных аминокислот, пептидов и низкомолекулярных белков. В диапазоне 4,0-3,72 представлены ароматические аминокислоты и пептиды, а в диапазоне 3,5-1,0 - спирты и липиды.
Анализ полученных при ионообменной хромотографии белковых фракций показал наличие спектра белковых компонентов с широким диапазоном молекулярных масс, две основные полосы спектра соответствовали белкам с молекулярной массой 15000 и 30000 дальтон.
Посредством обращеннофазовой хромотографии в экстракте выявлено 39 низкомолекулярных пептидов.
Обнаружение в составе экстракта биологически активной фракции, содержащей комплексы нуклеотидов с пептидами, связанной с гормональной активностью, привело к идентификации в нем значительного количества нуклеотидных компонентов (таблица 4).
| Таблица 4 | |||||||||||
| Нуклеотиды | |||||||||||
| Урацилнуклеотиды | Мочевая кислота | Ксантин | Гипоксантин | Гуаниннуклеотиды | Адениннуклеотиды | ||||||
| мг/г | % | мг/г | % | мг/г | % | мг/г | % | мг/г | % | мг/г | % |
| 71,8 | 68,0 | 1,5 | 1,4 | 5,6 | 5,3 | 18,6 | 17,8 | 6,9 | 6,5 | 0,8 | 1,0 |
Нуклеотиды являются регуляторами метаболизма, посредниками действия многих гормонов. Эти вещества участвуют в образовании генетического аппарата и оказывают стимулирующее действие на защитные функции организма, обладают противоопухолевым действием.
Для анализа липидного состава проводили экстракцию липидов по Фолчу. Тонкослойная хромография выявила фосфолипид, совпадающий по своей подвижности с фосфотидилхолином из яичного желтка, его содержание составило 0,06 мкмоль/мл. Хромотография нейтральных липидов выявила вещество с подвижностью эфиров холестерина (менее 0,01 мкмоль/мл), триглицеридов 0,84 мкмоль/мл и свободных жирных кислот (0,5 мкмоль/мл).
Кроме этого, в экстракте обнаружены гормоны, данные по содержанию которых представлены в таблице 5.
| Таблица 5 | |||||
| Трийодтрионин Т3, нм/л | Тироксин Ти, нМ | Кортизол нМ/л | Эстрадиол нМ/л | Прогестерон нМ/л | Тестостерон нМ/л |
| 5,84 | 67,0 | 74,42 | 0,76 | 0,48 | 61,35 |
Методом эмиссионной атомной спекроскопии выявлено присутствие значительных количеств кальция, натрия, магния и следы алюминия, кремния, меди, железа и марганца. Хелатные комплексы органических веществ с металлами переменной валентности, входящими в состав золы пантов, способны образовывать системы высокой биологической активности, среди них можно отметить роль магния, железа, меди, кобальта, йода и калия.
В результате исследований химического состава препарата из пантов, полученного заявленным способом, установлено, что препарат "пантолизат" представляет сложенную многокомпонентную смесь, включающую белки и аминокислоты, липиды, углеводы, минеральные вещества, гормоны и другие вещества, в комплексе обладающие выраженной биологической активностью.
Заявленный способ прост в применении, характеризуется низкой энерго-материалоемкостью и доступностью используемых составляющих при высоком выходе биологически активных веществ без использования агрессивных средств и может быть использован для производства косметических средств, а также в ветеринарии, медицине и бальнеологии.
Способ приготовления биологически активного препарата из пантов, включающий ферментативный гидролиз измельченных пантов и фильтрацию гидролизата, отличающийся тем, что используют пантовую муку со степенью размола не более 100 мкм, при этом перед ферментацией муку замешивают при комнатной температуре в двойном объеме дистиллированной воды, через 1,5-2 ч добавляют ферментативный комплекс суспензии поджелудочной железы из расчета 10% к массе муки и перемешивают, а гидролиз проводят в течение 6 ч при 38-40°С, затем полученный гидролизат экстрагируют водой в соотношении 1:5 в течение 6 ч и перед фильтрацией центрифугируют.
