Многоразовые экстракорпоральные колонки, загруженные конъюгатами лиганд-дибиотин

Изобретение относится к области молекулярной токсикологии и экстракорпоральной терапии. Сущность изобретения составляет экстракорпоральное устройство, в котором располагается раствор, содержащий реагент, представляющий собой биотины, трехфункциональносшитые через линкеры с токсинсвязывающей частью. Биотинсвязывающие части присоединены к эффекторным молекулам для целенаправленного удаления из кровяного русла токсинов. Технический результат - высокая селективность детоксикации крови. 3 н. и 17 з.п.ф-лы, 5 ил.

 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к способу модификации экстракорпорального устройства и к способу экстракорпорального извлечения токсичного материала из жидкостей организма млекопитающего в связи с диагностикой или лечением состояния или заболевания млекопитающего, причем применяются реагенты данных способов, обладающие способностью извлекать токсичный материал из жидкостей организма млекопитающего, и к экстракорпоральному устройству, включающему указанный реагент.

Известный уровень техники

Токсичные материалы могут поступать в кровь людей в результате несчастных случаев, в результате болезненных состояний, в результате бактериальных или вирусных инфекций или в результате введения веществ, предназначенных для лечения определенных заболеваний (например, при терапии рака). Многие из данных токсичных материалов могут действительно вызывать значительное повреждение в тканях организма, таких как почки, печень, легкие и костный мозг, и могут быть даже фатальными. Желательно удалять такие материалы из крови как можно быстрее. Хотя организм располагает защитными механизмами для удаления нежелательных токсичных материалов, данные способы могут быть неэффективными во многих случаях. Так, определенные токсичные материалы наилучшим образом удаляются из крови посредством экстракорпорального устройства. Примером такого устройства является почечное диализное устройство, когда увеличение токсичных материалов в крови вызвано нарушением функционирования почек. Другие медицинские применения, в которых может быть применено экстракорпоральное устройство, включают: 1) удаление радиоактивных материалов, 2) удаление токсичных уровней металлов, 3) удаление токсинов, продуцируемых бактериями или вирусами, 4) удаление токсичных уровней лекарств и 5) удаление целых клеток (например, раковых клеток, специфических гематопоэтических клеток, например В, Т или NK клеток) или удаление бактерий и вирусов.

Для того чтобы экстракорпоральное устройство функционировало для удаления токсина, оно должно содержать связанное с ним химическое вещество, которое обладает высоким связывающим сродством к токсичному материалу, подлежащему удалению из крови. Вместо того, чтобы данное химическое вещество было прямо связано с матриксом колонки в экстракорпоральном устройстве, предпочтительно, чтобы оно было связано посредством другой пары молекул. Данная структура связывания применяется для того, чтобы токсинсвязывающая часть была более доступна в крови, и для того, чтобы сделать устройство более обще применимым в отношении множества токсичных материалов. Применяют материал матрикса колонки, который обеспечивает значительную площадь поверхности, и при этом не ограничивает скорость прохождения через него крови (Nilson, R. et. al. патент ЕРС 567514). Матрикс колонки содержит белок (авидин или стрептавидин), связанный с ним так, что он обладает высоким сродством к другой молекуле (например, биотину). Данная колонка модифицирована для использования в конкретном медицинском применении путем конъюгации части, которая обладает высоким сродством к токсичному материалу, с двумя молекулами биотина, таким образом, что может быть легко достигнуто присоединение к матриксу колонки. Данный улучшающий реагент содержит две молекулы биотина вместо одной, поскольку данная конфигурация придает большую степень стабильности матриксу колонки.

Хотя специфичные для опухоли иммуноконъюгаты избирательно связываются с опухолевыми клетками, для достижения достаточно высокой концентрации в ткани-мишени больного требуется исходная высокая концентрация токсичного в отношении клеток иммуноконъюгата в кровяном русле. Поскольку для оптимальной терапии рака требуется высокая концентрация цитотоксического материала в крови и других неопухолевых тканях, в большинстве случаев это ведет к поражению тканей и/или к образованию повреждения в чувствительных и живых тканях, подобных костному мозгу. Хотя иногда для того чтобы обойти потенциально летальные эффекты применяют пересадку костного мозга, такая трансплантация является как чрезвычайно дорогой, так и характеризуется высоким риском для больного. Даже в случаях, когда трансплантация костного мозга является эффективной, другие чувствительные органы, подобные печени, почкам, селезенке, легким и т.д., могут быть необратимо повреждены. Наиболее эффективный способ предотвращения повреждения тканей и костного мозга токсичными материалами крови заключается в резком снижении количества данного токсичного материала в крови. Конечно, это должно осуществляться таким образом, чтобы сохранялся терапевтический уровень токсичного материала в ткани, подлежащей лечению (например, опухоли).

Меченные радиоизотопами антитела исследовали в отношении терапии рака на протяжении нескольких десятилетий. Введение меченных радиоизотопами антител приводит к появлению токсичного материала в крови. Были предложены различные способы для быстрого удаления меченных радиоизотопами антител из кровяного русла после того, как опухоль накапливала достаточное количество иммуноконъюгата для постановки диагноза или для терапии. Некоторые из примененных способов включают усиление свойственного организму механизма выведения посредством образования иммунных комплексов. Повышенный клиренс из крови меченных радиоизотопами антител может быть получен путем применения молекул, которые их связывают, таких как другие моноклональные антитела (Klibanov et. al., J. Nucl. Med. 29, 1951-1956, 1988; Marshall et al. Br. J. Cancer 69, 502-507, 1994; Sharkey et al. Bioconjugate Chem. 8, 595-604, 1997), авидин/стрептавидин (Sinitsyn et al., J. Nucl. Med. 30, 66-69, 1989; Marshall et. al., Br. J. Cancer, 71, 18-24, 1995) или соединения, содержащие гликозил, которые удаляются рецепторами на клетках печени (Ashwell and Morell, Edv. Enzymol. 41, 99-128, 1974). Еще одни способы включают удаление иммуноконъюгатов из кровотока с помощью экстракорпоральных способов (смотри обзорную статью Schriber, G.J. & Kerr, D.E., Current Medical Chemistry, 1995, Vol.2, pp 616-629).

Экстракорпоральные способы, применяемые для удаления лекарственного агента из кровяного русла, особенно привлекательны, поскольку токсичный материал быстро удаляется из организма. Применение данных способов в контексте иммунотерапии было описано ранее (Henry СА, 1991, Vol.18, pp.565; Hofheinze D et al., Proc. Am. Assoc. Cancer. Res. 1987 Vol.28, pp 391; Lear J K, et al. Radiology 1991, Vol.179, pp.509-512; Johnson Т.К. et. al. Antibody Immunoconj. Radiopharm. 1991, Vol.4, pp.509; Dienhart D.G., et al. Antibody Immunoconj. Radiopharm. 1991, Vol.7, pp.225; DeNardo G.L. et al. J. Nucl. Med. 1993, Vol.34, pp 1020-1027; DeNardo S.G. et. al. J. Nucl. Med. 1992, Vol.33, pp.862-863; DeNardo G.L. J. Nucl. Med. 1992, Vol.33, pp.863-864 и патент США номер 5474772; патент Австралии 638061 и патент ЕРО 90 914303.4, на имя Maddock.

Для достижения большей эффективности очистки крови и для обеспечения обработки цельной крови, а не плазмы крови, как указано в цитируемых выше способах, лекарственные агенты (например, специфичное в отношении опухоли моноклональное антитело, несущее агенты, вызывающие гибель клеток, или радионуклиды для выявления локализации опухоли) биотинилировали и удаляли с помощью адсорбента на основе авидина на матриксе колонки. В ряде публикаций представлены данные, показывающие, что данная методология является и эффективной, и практичной для клиренса биотинилированных и меченных радионуклидами специфичных в отношении опухоли антител (Norrgren К, et. al. Antibody Immunoconj. Radiopharm. 1991, Vol.4, pp 54; Norrgren К, et. al. J. Nucl. Med. 1993, Vol.34, pp.448-454; Garkavij M, et. al. Acta Oncologica 1996, Vol.53, pp.309-312; Garkavij M, et. al. J. Nucl. Med. 1997, Vol.38, pp.895-901. Данные методологии также описаны в патентной заявке США No. 08/090047; патенте ЕРС 567514 и 08/434889).

Помимо длительного времени циркуляции, ведущего к нежелательной экспозиции токсичного иммуноконъюгата со здоровой тканью, вклад в низкий терапевтический показатель вносит также неадекватное проникновение в опухолевую ткань и неспецифичная задержка и метаболизм в органах. В силу данных проблем интенсивно исследовались многоступенчатые, основанные на антителах подходы к доставке радионуклидов. Основная концепция включает, во-первых, введение направляющей части, специфичной для повреждения, которая помимо связывания, специфичного для повреждения, также обладает отличительной способностью связываться с вводимым затем радиоактивным диагностическим агентом или терапевтическим агентом. Путем разделения двух данных событий можно обеспечить медленное проникновение в ткань нерадиоактивного/нецитотоксичного антитела в течение времени, достаточного для аккумуляции в опухолевой массе, в то время как для более быстрого проникновения в ткань мог бы быть выбран агент, несущий радионуклид/цитотоксин. Однако необходимым условием является то, что первый (и предпочтительно также последний) может быть быстро выведен из кровяного русла.

В большинстве из данных многоступенчатых подходов применяются связывающие части авидина/стрептавидина и биотина. Авидин представляет собой 67 кДа гликопротеин, обнаруживаемый в белке яйца и в тканях птиц и амфибий. Он состоит из 4 нековалентно связанных субъединиц. Каждая субъединица способна связать одну молекулу биотина. Авидин имеет высокую изоэлектрическую точку (pI>10) благодаря наличию 36 аминокислотных остатков лизина, что обеспечивает неспецифическое связывание с клеточными мембранами. Стрептавидин (SAv), продуцируемый Streptomyces avidinii, является близко родственным авидину. Он проявляет высокое сродство к биотину, но отличается по аминокислотному составу, а также по свободному заряду (pI 6,5) и не гликозилирован. Благодаря отсутствию сахарных групп SAv обладает несколько меньшей молекулярной массой, равной 60 кДа, и его фармакокинетика и биораспределение in vivo существенно отличаются от таковых авидина. В то время как внутривенно вводимый меченный радиоизотопами авидин быстро удаляется из крови и интенсивно накапливается в печени, меченный радиоизотопами SAv обладает значительно более длительным временем пребывания в кровяном русле и характеризуется меньшей аккумуляцией в органах (Pimm MV et al. Nucl. Med. Comm.1988 Vol.9, 931-941; Schechter В et al., Eur. J. Biochem. 1990, Vol.189, 327-331; Rosebrough SF, Nucl. Med. Biol. 1993, Vol.20, 663-668).

Другая часть связывающей пары - биотин представляет собой витамин и является членом В-комплекса, который важен для синтеза аминокислот и жирных кислот с нечетным количеством атомов углерода. Биотин обнаруживается преимущественно внутриклеточно обычно связанным с ферментом и действует в качестве кофактора в реакциях карбоксилирования. Биотин часто находится в виде лизин-биотинового аддукта (биоцитина) в пище и при метаболическом обмене белка. Связь между лизином и биотином разрушается ферментом плазмы - биотинидазой.

Для улучшения визуализации у больных с карциномой легких Kalofonos et. al. применяли двухступенчатый SAv-MAb/111In DTPA-биотиновый подход (Kalofonos HP et al., J. Nucl. Med. 1990, Vol.31, 1791-1796). Van Osdol et. al. и Sung et. al. создали математическую модель двухступенчатой визуализации и протоколы лечения с применением SAv-MAb и хелатов радиоактивно меченного биотина. Принимая во внимание параметры in vivo как направляющей к цели части SAv-MAb, так и визуализирующего агента радиоактивно меченного биотина, они предсказали следующее:

1) Большая молекулярная масса SAv-MAb должна снижать количество MAb, которое должно локализоваться в опухоли, и однородность связывания в опухоли.

2) Радиоактивно меченный биотин должен быстро диффундировать в опухоль, но из-за высокого сродства к связанному с периферией опухоли SAv-MAb не будет проникать глубоко в узел, если дается слишком малая доза.

3) По сравнению с непосредственно мечеными MAbs двухступенчатый протокол SAv-MAb/радиоактивно меченный биотин обеспечивает визуализацию быстрее после введения радиоактивности и дает более высокие отношения опухоль/кровь.

4) Данные отношения опухоль/кровь через 24 час превышают >2 раза по сравнению с применением непосредственно меченных MAb.

В случае их модели высокий процент радиоактивности связан с циркулирующим SAv-MAb, и добавление очищающего агента перед введением радиоактивно меченного биотина должно повышать отношение опухоль/кровь.

Двухступенчатый подход с применением биотинилированных MAbs и радиоактивно меченного SAv также был применен на животных моделях и на больных (Paganelli G. et. al. Eur. J. Nucl. Med. 1992, Vol.19, 322-329; Khawli LA et al. Abs. Immunoconj. Radiopharm. 1993 Vol.6, 13-27; Kassis Al. et. al. J. Nucl. Med. 1996 Vol.35, 1358-1365). В данном способе как целенаправляющий, так и визуализирующий агенты имеют высокую молекулярную массу и медленно удаляются из крови. Для выполнения всей процедуры требуется много дней и при наличии метаболизма радиоактивность аккумулируется в органах и медленно выводится из организма. Тем не менее, данные исследования показали, что связывание биотин/SAv совершается in vivo и дает позитивные изображения и повышенную активность в опухоли по сравнению с непосредственно меченными MAb.

Апробировалась также трехступенчатая процедура, состоящая из биотинилированного MAb, авидина и последующего 111In-DTPA-биотина (Paganelli G et al. Cancer. Res. 1991 Vol.51, 5960-5966; Dosio F. et. al. J. Nucl. Biol. Med. 1993 Vol.37, 228-232). Для данной процедуры требуется 1-3 дня между инъекциями для обеспечения аккумуляции в опухоли и очистки крови. В целом все данные исследования показали осуществимость иммунологических подходов с применением SAv/биотиновой системы in vivo. Вместе с тем, уровни в кровяном русле высокомолекулярных направляющих агентов составляли проблему из-за их продолжительной циркуляции и неспецифической аккумуляции в органах.

Тщательно исследовался альтернативный подход с предварительным целеуказанием мишени с применением трех отдельных инъекций трех компонентов: 1) SAv-MAb, 2) очищающего агента и 3) радиоактивно меченного производного биотина, содержащего хелатирующую радиоактивный металл часть DOTA (Axworthy DB et al. J. Immunother. 1994, Vol.16, 158). Вводят ковалентный конъюгат, специфичный в отношении опухоли MAb и SAv, и дают аккумулироваться в местах опухоли. После достаточного захвата опухолью (24-48 час) вводят удаляющий биотин агент для очистки крови от конъюгата через печень. Наконец вводят радиоактивно меченное производное биотин-DOTA. Очищающий агент, применяемый в данном варианте, обычно представляет собой биотинилированный белок, остатки галактозы которого были конъюгированы. Рецепторы галактозы находятся на гепатоцитах и обладают высоким сродством и специфичностью по отношению к макромолекулам с экспонированными концевыми остатками галактозы. Захват печенью коррелирует с количеством галактозных остатков, связанных с SAv (Rosebrough SF, J. Nucl. Med. 1996, Vol.37, 344-350).

Во всех данных концепциях имеется ограничение, связанное с противоречием между исходной концентрацией направляющей к цели молекулы и ее способностью глубоко проникать в опухоль, с одной стороны, и быстрым и полным выведением из крови перед введением радиоактивного/цитотоксического агента, с другой стороны. В принципе то же самое положение распространяется и на радиоактивный/цитотоксический агент. Достаточно высокая исходная концентрация в крови существенна для достижения и насыщения направляющей к цели молекулой. В то же время данный токсичный агент не должен оставаться в кровяном русле и действовать на чувствительные ткани, подобные костному мозгу. Даже если токсичный агент удаляется из организма достаточно быстро, такие органы, как почки и мочевой тракт, должны обычно получать аккумулированную токсичную дозу, равную или большую по сравнению с той, которую получает опухолевая ткань.

Очевидно имеется потребность для оптимизации данных и других условий терапевтических протоколов, в особенности, если подходы предназначены для адекватного лечения солидных опухолей. Очень важно, что такие концепции являются в значительной мере родственными, настолько, насколько возможна независимость параметров от типа и локализации заболевания и насколько возможна независимость от фармакокинетических параметров и скорости метаболизма у отдельного больного.

Краткое описание изобретения

Целью настоящего изобретения является избавление от указанных выше проблем с токсичными и нежелательными соединениями в жидкостях организма. Данная цель в соответствии с настоящим изобретением достигается с помощью способа модификации (кондиционирования) экстракорпорального устройства и способа экстракорпорального извлечения токсичного материала из жидкостей организма млекопитающего в связи с диагностикой или лечением состояния или заболевания млекопитающего, причем в данных способах применяют реагент, обладающий способностью извлекать токсичный материал из жидкостей организма и имеющий общую формулу:

где биотиновые части представляют собой природный биотин или его производные,

где a, b и с представляют собой линкеры, которые являются одинаковыми или различаются, и где d представляет собой трехфункциональную перекрестно сшивающую часть, и указанный реагент в другом варианте называется модифицирующим реагентом в описании или в предпочтительных осуществлениях указанных способов, в которых токсинсвязывающая часть реагента представляет собой биотин или его производное для экстракорпорального извлечения токсичного материала из жидкостей организма млекопитающего в связи с диагностикой или лечением состояния или заболевания млекопитающего. Другие цели и достижения станут ясны из подробного описания изобретения и пунктов прилагаемой формулы изобретения.

В одном варианте настоящего изобретения реакционно-способные дибиотиновые соединения присоединяют к лигандам, которые избирательно связываются с компонентами, естественно присутствующими в крови или искусственно вводимыми в кровь, и полученные конъюгаты применяют для модификации матриксов колонок, содержащих авидин или стрептавидин, для медицинского применения. В другом варианте настоящего изобретения экстракорпоральное устройство, содержащее колонку, которая была модифицирована дибиотиновым конъюгатом, соединено с аппаратом, который качает цельную кровь от больных через колонку и возвращает ее пациенту, для очистки крови больных от материалов, которые связываются с дибиотиновым конъюгатом. Таким образом, цель настоящего изобретения также заключается в облегчении применения экстракорпоральной очистки от токсичных агентов путем предоставления средств одноступенчатого превращения биотинсвязывающего устройства в устройство для связывания токсичного вещества путем применения водорастворимой молекулы, которая содержит две биотиновые части.

Другие варианты, в которых реагент трижды биотинилирован, описаны в последующих примерах.

Краткое описание чертежей

На фиг.1 представлено модифицирование (стрепт)авидинового матрикса производными соединений дибиотина.

На фиг.2 представлено связывание токсичного материала с модифицируемой колонкой.

На фиг.3 представлена общая структура реагента, модифицирующего колонку.

На фиг.4 представлена стандартная кривая для биотин-тримерного ТИФА.

На фиг.5 представлена типичная кривая снижения авидина под действием колонки биотин-тример/авидин.

Раскрытие предпочтительных осуществлений

Настоящее изобретение также включает способ модифицирования для превращения биотинсвязывающего матрикса в матрикс, способный связывать множество веществ, токсичных для организма. В изобретении применяют специализированные покрытые авидином или SAv колонки, поскольку они обеспечивают поверхность связывания токсичных соединений (например, радиоактивно меченных антител), которые содержат присоединенный биотин (Nilsson. R. et.al., патент ЕРС 567514). Данные колонки обладают подходящими характеристиками для прохождения через них цельной крови и достижения хорошей очистки в течение приемлемого периода времени. В настоящем изобретении значительно расширено применение колонок авидин/SAv путем их перевода в форму, связывающую другие типы молекул, с помощью двухступенчатого процесса. На первой стадии перевод колонки из формы биотинсвязывающей, покрытой (стрепт)авидином колонки, в колонку, которая связывает токсичный материал, может быть достигнут путем ее модифицирования с помощью избытка дибиотинового производного, как показано на фигуре 1. На следующей стадии модифицированная колонка может быть применена в экстракорпоральном устройстве для удаления из крови токсичного вещества. Связывание токсичного вещества с модифицированной колонкой изображено на фигуре 2. Две стадии могут быть разделены во времени в результате хранения модифицированной колонки.

В предпочтительном осуществлении изобретения токсичный лекарственный агент, применяемый для лечения заболевания человека, удаляют из крови для улучшения отношения его концентраций в мишени и не-мишени. Улучшенное отношение мишени к не-мишени обеспечивает лучший терапевтический показатель. Избирательная локализация лекарственного агента в ткани или органе является очень важным фактором для его эффективного применения. Отсутствие избирательной тканевой локализации является особенно важным при лечении лекарственными агентами, когда желаемое действие заключается в индукции гибели клеток определенного типа, как в случае лечения рака. Для повышения специфичности применяют моноклональные антитела, специфичные в отношении опухоли, в качестве носителя (в виде иммуноконъюгатов) различных токсичных агентов, таких как, но не ограничиваясь этим, радионуклиды, цитотоксины и ферменты, применяемые в пролекарственных протоколах (Meyer et al., Bioconjugate Chem. 6, 440-446; 1995; Houba et al., Bioconjugate Chem. 7, 606-611, 1996; Blakey et al., Cancer Res. 56, 3287-3292, 1996).

Применяемый здесь термин "реагент" (а также "модифицирующий реагент") обозначает соединение, содержащее две функции - для специфичного взаимодействия с единственной биотинсвязывающей молекулой и отдельную функцию для связывания токсичного материала. Он может быть применен для превращения биотинсвязывающего матрикса в матрикс, который может быть применен для извлечения конкретного токсичного материала из жидкостей организма или применен для превращения биотинсвязывающего матрикса в матрикс, который связывает биотинсвязывающие молекулы.

Применяемый здесь термин "эффекторная молекула" обозначает любую часть, которая может быть присоединена к направляющей молекуле или к молекуле, взаимодействующей с направляющей молекулой (комплекс целенаправляющей молекулы), и которая либо повышает действие целенаправляющей молекулы/комплекса целенаправляющей молекулы или которая сама по себе вносит вклад в желаемое фармакологическое или диагностическое действие.

Применяемый здесь термин "токсичный материал" обозначает любое соединение необязательно в конъюгате с эффекторной молекулой, кластер соединений, клетки и т.д., которые могут быть удалены из жидкостей организма млекопитающего путем применения реагента.

Применяемый здесь термин "часть, связывающая токсин" обозначает любую часть, способную взаимодействовать с токсичным материалом жидкости организма млекопитающего посредством специфического взаимодействия с токсичным материалом. В некоторых предпочтительных осуществлениях настоящего изобретения часть, связывающая токсин, представляет собой биотин или его производное.

Применяемый здесь термин "биотинилированные молекулы" обозначает молекулы, которые проникают в ткань млекопитающего легче, чем иммуноглобулины, например радиоактивно меченное производное биотина, содержащее часть, хелатирующую радиоактивный металл.

Применяемый здесь термин "целенаправляющая биомолекула" обозначает биомолекулы, которые избирательно связываются с определенными структурами клеток млекопитающего.

Для аффинных адсорбентов матрикс (М) может иметь разную форму и химический состав. Он может, например, составлять основу колонки, наполненной конкретными полимерами, причем последние могут иметь природное происхождение или создаваться искусственным путем. Частицы могут быть макропористыми или их поверхность может быть модифицирована для того, чтобы увеличить площадь поверхности. Частицы могут быть сферическими или гранулированными и в их основе могут находиться полисахариды, керамический материал, стекло, двуокись кремния, пластик или их любое сочетание или подобный им материал. Их сочетание могло бы быть, например, твердыми частицами, покрытыми подходящим полимером природного происхождения или созданным искусственным путем. Могут также применяться искусственные мембраны. Они могут быть плоскими листовыми мембранами, изготовленными из целлюлозы, полиамида, полисульфона, полипропилена или материалов другого типа, которые являются по существу инертными, биосовместимыми, нетоксичными и на которых можно было бы иммобилизовать рецептор либо непосредственно, либо после химической модификации поверхности мембраны. Могут быть также применены капиллярные мембраны, подобные полым волокнам, изготовленным из целлюлозы, полипропилена или других материалов, подходящих для мембран данного типа. Предпочтительным осуществлением является дисперсный материал на основе агарозы и подходящий для экстракорпоральных применений.

Биотинсвязывающая молекула может быть иммобилизована на матриксе с помощью различных способов. Выбор способа присоединения должен зависеть от природы биотинсвязывающей молекулы, а также от природы поддерживающего матрикса. Для белков могут быть применены такие функциональные группы, как гидроксильная, амино, карбоксильная или тиоловая группы. Гликопротеины, подобные авидину, могут быть присоединены к матриксу через их гликозильные остатки. Твердую основу можно также активировать для придания способности связывать белки путем образования связей твердой основой посредством специфичной или неспецифичной реакции с боковыми цепями или с основной цепью белка. Связь между твердой основой и биотинсвязывающей молекулой может также иметь нековалентную природу, при которой используются силы электростатического взаимодействия, силы водородной связи или гидрофобного взаимодействия. Для применения в иммунологических анализах нековалентное присоединение, по-видимому, является наиболее приемлемым. Может применяться также спейсер между матриксом и биотинсвязывающей молекулой.

Модифицирующий реагент составлен из молекулы, которая содержит две биотиновые части, а также часть, связывающую токсичный материал. Две биотиновые части важны в изобретении, поскольку такое построение позволяет обеим биотиновым частям связываться с одной и той же (стрепт)авидиновой молекулой на колонке, что перекрестно связывает субъединицы и помогает стабилизировать колонку в условиях движения через нее крови. Перекрестное сшивание биотиновых частей с соседними (стрепт)авидиновыми частями не происходит, поскольку биотиновые димеры связываются значительно быстрее с прилегающим биотинсвязывающим карманом (внутримолекулярное связывание) по сравнению со связыванием с биотинсвязывающим карманом на соседней молекуле (межмолекулярное связывание) (Wilbur et al. Bioconjugate Chem. 8, 819-832, 1997). Авидин и стрептавидин более стабильны, когда связаны с биотином, и перекрестная сшивка субъединиц обеспечивает дополнительную стабильность (Biomolecular Engineering 16, 67-72, 1999).

Модифицирующий реагент составлен из двух биотиновых частей, токсинсвязывающей части, трехфункциональной перекрестно сшивающей части и трех линкерных молекул (а-с), как изображено на фигуре 3. Две биотиновые части составлены из природного биотина или производных биотина, присоединенных к линкерной молекуле(молекулам) (а, b) через биотинкарбоксилат посредством амидной связи. Биотиновые части присоединены к трехфункциональному перекрестно сшивающему реагенту посредством линкерных молекул, которые обеспечивают расстояние как минимум 20 и как максимум 60 между карбоксилатными атомами углерода биотина при измерении в полностью линеаризованной форме. Линкерные молекулы a, b и с, кратко называемые также линкерами, могут быть одними и теми же или каждый линкер может отличаться по своей природе. Линкерные молекулы являются неразветвленными или с разветвленными цепями и содержат в цепи обеспечивающие растворимость в воде функциональные части, такие как простой эфир/тиоэфирные связи, амины, или добавки к цепи, которые содержат амины, карбоксилаты или гидроксильные функциональные части. Альфа атом на линкере для биотинамидной связи может быть незамещенным (например, СН₂) или может содержать метильную, гидроксиметиленовую или карбоксилатную функциональную часть. Более крупные функциональные части снижают связывание с (стрепт)авидиновыми колонками. Последние функциональные части обеспечивают устойчивость к биотинидазе, но данная устойчивость не требуется для связывания двух биотиновых частей со (стрепт)авидином на колонках, поскольку они недоступны для расщепления биотинидазой. Когда токсинсвязывающая часть является другой биотиновой частью, может быть желательна устойчивость к биотинидазе. Трехфункциональный перекрестно сшивающий агент представляет собой алифатическое или ароматическое соединение, которое содержит три функциональные группы, которые являются нуклеофилами или взаимодействуют с нуклеофилами, для конъюгации с линкерными молекулами. Предпочтительными трехфункциональными перекрестно сшивающими реагентами являются ароматические кольца с 1,3,5-замещением. Наиболее предпочтительны производные 1,3,5-бензолтрикарбоновой кислоты, 3,5-диаминобензойной кислоты, 5-амино-1,3-дикарбоксибензола (аминоизофталевой кислоты). Токсинсвязывающая часть представляет собой любую молекулу, которая связывается с токсичным веществом с высоким сродством. Примеры таких связывающих молекул включают моноклональные антитела (или фрагменты, или созданные с помощью генной инженерии аналоги), аптамеры, пептиды, олигодезоксинуклеотид (или связывающие фрагменты), интеркалирующие реагенты (например, красители, химиотерапевтические агенты, природные вещества) и хелаты металлов, которые специфически связываются с токсином или эффекторной молекулой, присоединенной к токсичному материалу. Примеры токсичных материалов включают: ионы металлов, химиотерапевтические агенты, свободные радионуклиды, радионуклиды, связанные с другими соединениями, пищевые токсины, токсины, произведенные бактериями, токсины, продуцируемые в результате вирусных инфекций, токсины, продуцируемые в результате болезненных состояний, продуцируемые пораженными клетками, клетками, участвующими в иммунном ответе, при несовместимости по группе крови или HLA, а также при несовместимости с ксеноантителами и т.д.

Предпочтительный биотиновый остаток представляет собой биотин или его производное. В большинстве примеров биотиновая часть должна быть природным биотином, который присоединен к линкеру посредством амидной связи. В некоторых примерах может быть выгодно иметь биотиновое производное, которое не связывается также прочно как природный биотин, или биотиновое производное, которое связывается с химически модифицированным или генетически мутированным авидином или стрептавидином более предпочтительно, чем природный биотин. Примерами таких биотинов являются норбиотин, гомобиотин, оксибиотин, иминобиотин, дезтиобиотин, диаминобиотин, сульфоксид биотина и биотинсульфон. Включаются также другие модификации биотина, включая дополнительную модификацию указанных выше примеров. Две биотиновые части в реагенте согласно настоящему изобретению в альтернативном варианте могут состоять из любых производных биотина, перечисленных выше.

В предпочтительном осуществлении изобретения токсинсвязывающая часть представляет собой биотин или производное биотина. Модифицирование авидиновой или стрептавидиновой колонки данным реагентом (трибиотиновым реагентом) обеспечивает удаление токсичных материалов, которые объединяются с авидином или стрептавидином (или с данными реагентами, которые химически модифицированы, укорочены путем ферментативного переваривания или изменены посредством способов генетического мутагенеза). Примеры предпочтительного модифицирующего реагента, который содержит 3 биотина, показаны на схеме 1. Предпочтительное медицинское применение для данного модифицирующего авидин или стрептавидин реагента заключается в удалении из крови больного терапевтического радионуклида, который с ним связывается. В представленных примерах (соединения 1-3) модификации являются одинаковыми за исключением природы и длины линкерной группы. Применяемым перекрестно сшивающим реагентом является 1,3,5-бензолтрикарбоновая кислота, а применяемые линкеры содержат эфирные функциональные части для обеспечения растворимости в воде. В соединении 3 линкер содержит также аспарагиновую кислоту, которая дает свободный карбоксилат для повышения растворимости в воде и для блокирования действия биотинидазы.

Схема 1: примеры димеров биотина, которые также содержат третий биотин для связывания радиоактивно меченных производных стрептавидина

А. Тример биотина с расстоянием 31 между карбоксилатами биотина

B. Тример биотина с расстоянием 41 между карбоксилатами биотина

С. Тример биотина с расстоянием 53 между карбоксилатами биотина

Другие дибиотиновые модифицирующие реагенты, связывающие токсичный материал, включенные в способы в соответствии с настоящим изобретением, могут быть легко получены путем конъюгации содержащего нуклеофил, реакционно-способного в отношении нуклеофила или дибиотинового соединения с частью, связывающей токсичный материал. Примеры, показывающие синтез реакционно-способных дибиотиновых соединений, представлены на схемах 2 и 3. В данных примерах в качестве трехфункционального перекрестно сшивающего реагента применяют активированный тетрафторфениловым эфиром и защищенный N-tBoc аминоизофталат, 4. Взаимодействие соединения 4 с биотином, конъюгированным с линкером, 4,7,10-триоксатридекандиамином, дает дибиотиновое соединение 5. Защитная N-tBoc группа в соединении 5 легко превращается в свободный амин 6 с помощью чистой трифторуксусной кислоты. Анилиновое соединение 6 вводят в реакцию с соединениями, связывающими токсичный материал, которые содержат активированные карбоксилатные эфиры, или с такими, которые должны подвергаться другим реакциям нуклеофильного вытеснения. Свободный амин 6 также легко превращается в функциональные группы, которые способны взаимодействовать с нуклеофилами (например, изотиоцианат 7; малеимид 8 или другие реагенты, такие как альфа-галоацетамиды). Изотиоцианат-дибиотиновое соединение 7 вводят в реакцию с молекулами, связывающими токсичный материал, которые содержат амины, а малеимид-дибиотин 8 вводят в реакцию с молекулами, связывающими токсичный материал, которые содержат сульфгидрильные группы (а также амины). Дополнительные, реакционно-способные реагенты могут быть легко получены сходным образом. Реагент, который вводят в реакцию с окисленными сахарами и спиртами, представляет собой гидроксиламиновое производное 10. В примерах схемы 2 линкер с либо отсутствует, либо сначала присоединяется к молекуле, связывающей токсичный материал. Во многих примерах должна быть сконструирована линкерная молекула для обеспечения большей доступности части, связывающей токсичный материал, для взаимодействия с токсичным материалом в крови. Следовательно, линкер может быть встроен в молекулу перед взаимодействием с молекулой, связывающей токсичный материал. Примеры, в которых линкерная молекула была включена, показаны на схеме 3 (соединения 11-14).

Схема 2: синтез дибиотиновых реагентов, которые могут быть конъюгированы с другими молекулами

Схема 3: синтез дибиотиновых реагентов, которые содержат линкерную часть и имеют функциональные группы, которые обеспечивают конъюгацию с другими молекулами

Примеры

Следующие примеры предлагаются для того, чтобы показать способы получения соединений различных типов, раскрытых в данном патенте, и их применение в качестве реагента для модифицирования колонки для удаления токсина из цельной крови. Примеры предлагаются в виде иллюстраций, но не для ограничения. На основе показанных здесь примеров могут быть представлены многие дополнительные примеры.

Пример 1

Получение дибиотинового соединения, которое может быть конъюгировано с молекулами, связывающими токсин

Стадия 1: получение N-трет-Boc-5-аминоизофталевой кислоты

К раствору 5-аминоизофталевой кислоты (1,0 г, 5,52 ммоль), гидроксида натрия (0,49 г, 12,14 ммоль), ДМФ (10 мл) и воды (10 мл) при температуре бани лед/вода добавляли ди-трет-бутилдикарбонат (1,27 г, 5,80 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при температуре окружающей среды в течение 16 час. Раствор нейтрализовали 53,0 мл 0,5 н HCl при температуре бани лед/вода, после чего белый осадок фильтровали, промывали водой и сушили в вакууме. Остаток кристаллизовали из смеси МеОН/Н₂О для получения чистого соединения в виде белого твердого вещества. Выход 0,94 г (61%). Т.пл.>300°С. 1Н ЯМР (ДМСО-d6): δ 1,50 (с, 9Н), 8,08 (т, J=1,5 Гц, 1Н), 8,31 (д, J=1,5 Гц, 2Н), 9,80 (с, 1Н). Вычислено для C₁₃H₁₆NO₆ (М+Н)⁺: 282,0977. Найдено: 282,0981. ВЭЖХ: tR=11,3 мин.

Стадия 2: получение дитетрафторфенилового эфира N-трет-Вос-5-аминоизофталата

К раствору трет-Вос-5-аминоизофталевой кислоты (0,35 г, 1,23 ммоль), NEt₃ (0,52 мл, 3,70 ммоль), ДМФ (4,0 мл) и воды (10 мл) при комнатной температуре по каплям добавляли 2,3,5,6-тетрафторфенилтрифторацетат (0,47 мл, 2,71 ммоль). После перемешивания реакционной смеси при комнатной температуре в течение 30 мин добавляли 60 мл воды, белый осадок фильтровали, промывали водой, сушили в вакууме для получения сырого продукта.

Сырой продукт очищали колоночной хроматографией на силикагеле (40 г) с элюированием смесью 10% EtOAc/гексан для получения бесцветного твердого вещества. Выход 0,213 г (30%). Т.пл. 159,7-161,8°С, с разр. 1Н ЯМР (CDCl₃): 1,55 (с, 9Н), 6,83 (с, 1Н), 7,08 (м, 1Н), 8,54 (д, J=1,5 Гц, 2Н), 8,67 (т, J=1,5 Гц, 1Н). Вычислено для C₂₅H₁₅F₈NNaO₆ (M+Na)⁺: 600,0669. Найдено: 600,0674. ВЭЖХ: tR=16,1 мин.

Стадия 3: получение N-(13-амино-4,7,10-триоксатридеканил) биотинамида

Биотин (10 г, 40,9 ммоль) растворяли в 200 мл теплого (70°С) ДМФ в атмосфере аргона. Раствору давали остыть до температуры окружающей среды, добавляли 10 мл (82 ммоль) триэтиламина и затем 16 г (61 ммоль) 2,3,5,6-тетрафторфенилтрифторацетата. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 30 мин, и растворитель удаляли в вакууме. Продукт растирали в 100 мл эфира и фильтровали. Выделенный продукт сушили в вакууме для получения 14 г (83%) TFP-эфира биотина в виде бесцветного твердого вещества. Т.пл. 185-187°С. 1Н ЯМР (ДМСО-d6) δ: 1,4-1,8 (м, 6Н), 2,5 (м, 1Н), 2,6-2,9 (м, 3Н), 3,1 (м, 1Н), 4,2 (м, 1Н), 6,4 (д, 2Н), 7,9 (м, 1Н); ИК (KBr, см^-1) 3250, 2915, 1790, 1710, 1520, 1480, 1090. Анализ вычисл. для C₁₆H₁₆F₄N₂O₃S: С 48,98; Н 4,11; N 7,14. Найдено: С 48,90; Н 4,14; N 6,86.

TFP-эфир биотина (5 г, 12,8 ммоль) добавляли в сухой сосуд, содержащий 200 мл безводного ДМФ. В другой сухой сосуд, содержащий 28 г (128 ммоль) 4,7,10-триокса-1,13-тридекандиамина 8, добавляли 4 мл триэтиламина. Оба сосуда охлаждали до 0-5°С с помощью бани лед-вода. К раствору триоксатридекандиамина на протяжении периода времени 1 час по каплям добавляли TFP-эфир биотина. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 30 мин, и растворитель удаляли в вакууме. Полученное масло растирали в 500 мл эфира и перемешивали в течение 30 мин. Твердое вещество фильтровали, затем растворяли в смеси метанол:этилацетат (4:1) и наносили на колонку с двуокисью кремния (2,5 см × 35 см). Колонку элюировали той же смесью растворителей. Собирали фракции, содержащие продукт, и растворитель удаляли в вакууме. Выделенный продукт сушили в вакууме для получения 4,5 г (79%) соединения 9 в виде бесцветного твердого вещества, Т.пл. 104-106°С. 1Н ЯМР (МеОН) δ: 1,46 (м, 2Н), 1,6-1,8 (м, 9Н), 2,2 (т, 2Н), 2,7 (д, 1Н), 2,75-2,9 (м, 3Н), 3,2-3,3 (м, 5Н), 3,5-3,6 (м, 14Н), 4,3 (м, 1Н), 4,5 (м, 1Н); ИК (KBr, см^-1): 3280, 2910, 2850, 1690, 1640, 1110, 940. Анализ вычисл. для C₂₀H₃₈N₄O₅S·H₂O: С 51,70; Н 8,68; N 12,06. Найдено: С 51,95; Н 7,98; N 11,65.

Стадия 4: 1-N-трет-Вос-3,5-бис(13'-(биотинамидил)-4',7',10'-триоксатридеканамидил)аминоизофталат.

К раствору соединения 3 (65 мг, 0,11 ммоль) и триэтиламина (47 мкл, 0,33 ммоль) в безводном ДМФ при комнатной температуре по каплям добавляли биотин-триоксадиамин 4 (100 мг, 0,22 ммоль) в безводном ДМФ. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 час, и затем раствор упаривали досуха в вакууме. Остаток очищали с помощью колонки силикагеля (40 г) с элюированием смесью 20% MeOH/EtOAc для получения 73 мг (58%) бесцветного твердого вещества. Т.пл. 209-211°С с разр. 1Н ЯМР (CD₃OD, 200 МГц): δ 1,43 (т, 3Н), 1,54 (с, 9Н), 1,69 (м, 6Н), 1,88 (м, 3Н), 2,19 (м, 4Н), 2,69 (д, 4Н), 2,92 (м, 2Н), 4,30 (м, 2Н), 4,48 (м, 2Н), 7,83 (м, 1Н), 8,00 (м, 2Н); вычисл. масса для С₅₃Н₈₈N₉O₁₄S₂ (М+Н)⁺: 1139. Найдено: 1139. Вычисл. масса для C₅₃H₈₇N₉O₁₄S₂Na (M+Na)⁺: 1161. Найдено: 1161. ВЭЖХ 11,8 мин.

Стадия 5: 1-изотиоцианат-3,5-бис(13'-(биотинамидил)-4',7',10'-триоксатридекандил)аминоизофталат

Стадия 5: 1-изотиоцианат-3,5-бис(13'-(биотинамидил) 4',7',10'-триоксатридекандил)аминоизофталат

120 мг соединения 22 (0,11 ммоль) растворяли в чистой ТФУ (1 мл) и перемешивали при комнатной температуре в течение 10 мин. После этого избыток ТФУ удаляли в вакууме. Остаток растворяли в 2 мл метанола и обрабатывали 0,2 мл триэтиламина. Летучие вещества удаляли в вакууме, после чего последовательно добавляли воду (3 мл), хлороформ (3 мл) и тиофосфоген (42 мкл, 0,55 ммоль). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 час. После этого избыток тиофосгена и хлороформа выпаривали в вытяжном шкафу в струе аргона. Оставшуюся водную фазу упаривали досуха в вакууме с получением 77 мг (68%) соединения 23 в виде легкого, желтого, липкого, твердого вещества. 1Н ЯМР (ДМСО-d6, 200 МГц): δ 1,24-1,35 (м, 6Н), 1,43-1,67 (м, 14Н), 1,77 (т, J=6,6 Гц, 6Н), 2,05 (т, J=7,1 Гц, 6Н), 2,58 (д, J=12,5 Гц, 2Н), 2,82 (дд, J=4,8, 12,5 Гц, 2Н), 3,07 (м, 8Н), 3,28-3,57 (м, 18Н), 4,13 (дд, J=4,6, 7,7 Гц, 2Н), 4,31 (дд, J=4,6, 7,7 Гц, 2Н), 7,80 (т, J=5,0 Гц, 2Н), 7,98 (с, 2Н), 8,34 (с, 1Н), 8,77 (т, J=5,1 Гц, 2Н) вычисл. масса для C₄₉H₇₈N₉O₁₂S₃Na (M+Na)⁺: 1103. Найдено: 1103. ВЭЖХ 11,8 мин.

Пример 2

Конъюгация дибиотинового соединения с молекулой, связывающей токсин

К 150 мкл раствора 6,7 мг/мл моноклонального антитела 53-6А2 (1 мг) добавляли 108 мг (15 эквив.) дибиотинизотиоцианатного соединения 23 в 4 мкл ДМСО. Смесь слегка встряхивали, и затем давали взаимодействовать при комнатной температуре в течение ночи. Конъюгированное с дибиотином антитело очищали от избытка дибиотинового реагента ультрафильтрацией с центрифугированием при 6000 об/мин в Centricon 30 с последующими 4×1 мл промывками 0,9% солевым раствором.

Пример 3

Модифицирование авидиновой колонки дибиотин-токсинсвязывающим конъюгатом

В данном примере предлагается дибиотиновое соединение, которое также содержит другую биотиновую часть. Две из биотиновых частей должны связываться с авидином или стрептавидином, оставляя третью биотиновую часть способной связываться с токсичными соединениями, которые также конъюгированы с или представляют собой гибридные белки, содержащие авидин или стрептавидин. Таким образом, в данном примере дибиотиновое соединение представляет собой тример биотина, но те же самые способы могут быть применены для модифицирования колонки с дибиотиновыми соединениями, которая содержит другие высокоаффинные связывающие лиганды.

Модифицирование биотинсвязывающей колонки для превращения ее в авидинсвязывающую колонку:

Основу колонки снаряжали двумя мл авидин-агарозы Mitra и промывали >10 мл ЗФР со скоростью протекания 1 мл/мин (1,6 см/мин). Пять мл 1 мг/мл раствора биотин-тримера в ЗФР рециркулировали через авидиновую колонку со скоростью 1 мл/мин в течение 20 минут. В конце рециркуляции образец (0,5 мл) отбирали из рециркулирующего раствора и анализировали с помощью метода ТИФА, разработанного Mitra Medical Technology АВ. Биотин-авидин-агарозную колонку промывали фосфатным буфером со скоростью 1 мл/мин в течение 20 минут. С помощью определения концентрации биотин-тримера в рециркулирующей жидкости было установлено количество адсорбированного биотин-тримера как приблизительно 1,9 мг, т.е. 0,95 мг/мл геля в момент окончания рециркуляции. Стандартная кривая для определения концентрации биотин-тримера представлена на фиг.4.

Биотин-тример адсорбировали на 2 мл авидин-агарозы Mitra. Партия используемой авидин-агарозы имела статическую связывающую способность биотина приблизительно 74 г/мл. Если один биотин-тример связывается на одно доступное связывающее место, это должно соответствовать 514 г биотин-тримера/мл. Так как приблизительно 0,95 мг биотин-тримера связывалось на мл авидин-агарозы, можно заключить, что адсорбент был насыщен биотин-тримером.

Оценка адсорбции авидина на модифицированной колонке:

Авидин-агарозную колонку, которая была модифицирована тримером биотина (т.е. фигура 4, соединение №2), заполняли фосфатным буфером. После этого 20 мл раствора авидина, с содержанием авидина 1 мг/мл в ЗФР, давали рециркулировать через биотин-авидин-агарозную колонку со скоростью 1,0 мл/мин (1,6 см/мин). Пропускали три объема раствора авидина (3×20 мл) и отбирали аликвоты из резервуара перед началом рециркуляции, затем через 2 мин и с 5-мин интервалами. Аликвоты анализировали на количество в них авидина с применением метода ТИФА, разработанного Mitra Medical Technology AB. Концентрация авидина в резервуаре для рециркуляции представлена на фиг.5. Пунктирная линия представляла теоретически ожидаемую при отсутствии эффекта насыщения. Колонка насыщается приблизительно после 40 мин (2 об.), когда приблизительно 16 мг (80%) авидина связалось. Признаки насыщения наблюдались через приблизительно 20 мин (1,0 об.), когда экспериментальная кривая начинала отклоняться от теоретической кривой, что наступало, когда приблизительно 10 мг авидина связывались с колонкой.

Через 40 мин рециркуляции связывалось приблизительно 16 мг авидина, т.е. 8 мг/мл биотин-авидин-агарозы. Это соответствует молярному отношению 1:1 между авидином, связанным с агарозой, и авидином, адсорбированным биотин-тримером. Первоначальные эффекты насыщения наблюдались приблизительно после одного объема рециркуляции. После прохождения 2 объемов дополнительный авидин не связывался.

Эксперименты показали, что авидин-агароза может быть насыщена биотин-тримером, связывающимся со всеми участками, доступными для мономерного биотина, и что рециркулирующий свободный авидин эффективно связывается с колонкой, заполненной биотин-авидин-агарозой. Примерно 8 мг авидина было связано на мл адсорбента, что соответствует молярному отношению 1:1 между связанным авидином и авидином, иммобилизованным на агарозных частицах.

Пример 4

Применение модифицированной колонки для удаления токсинов из крови

Модифицированная колонка применяется для облегчения удаления конкретных токсинов из кровяного русла с помощью прохождения крови через устройство, покрытое авидином/стрептавидином, которое перед применением было превращено в специфическое устройство за счет пропускания раствора, содержащего реагент, модифицирующий колонку, несущий специфическую токсинсвязывающую часть. Это должно позволить устройству, покрытому авидином/стрептавидином, применяться в качестве технологической платформы для удаления различных токсинов. В конкретных случаях могло бы быть желательным удаление более одного токсина при одной и той же процедуре обработки, что может быть легко достигнуто за счет пропускания смеси реагентов, модифицирующих колонку, несущих различные части, связывающие конкретные токсины. Подходящее применение для такого мультифункционального устройства могло бы заключаться в очистке крови от анти-HLA антител, антител против антигенов группы крови или антиксеноантител перед трансплантацией органов или клеток. С помощью применения подходящей смеси реагентов, модифицирующих колонку, несущих различные части, связывающие конкретные токсины, направленные на конкретные подтипы, например, анти-HLA антитела, устройство, удаляющее токсины, может быть специально приспособлено для больных, нуждающихся в нем перед лечением.

Модификация может быть выполнена в больнице присоединением емкостей для инфузии, содержащих подходящие модифицирующие реагенты, несущие различные части, связывающие конкретные токсины, направленные на конкретные подтипы, к мониторному блоку (устройство для перепрограммируемого диализа), применяемого для экстракорпорального лечения, и модифицирование авидин/стрептавидинового устройства могло бы быть достигнуто вручную или автоматически с помощью мониторного блока. Скорость тока растворов модифицирующих колонку реагентов, поступающих в устройство, должна в таком случае определяться пропорцией различных частей, связывающих конкретные токсины, в окончательном улучшенном устройстве.

В другом варианте емкости для инфузии, содержащие смеси реагентов, модифицирующих колонку, несущих различные части, связывающие конкретные токсины, или окончательные устройства могли бы быть приготовлены предварительно с определенной смесью частей, связывающих конкретные токсины.

Пример 5

Применение модифицированной колонки для усовершенствования иммунонацеливания в двухступенчатой процедуре

Для улучшения иммунонацеливания в двухступенчатой процедуре на первой стадии предлагается средство для эффективной очистки кровяного русла от биотинилированных целенаправляющих молекул путем пропускания крови через биотинсвязывающее устройство и на второй стадии - очистка крови от вводимого впоследствии токсичного производного авидина/стрептавидина путем пропускания крови через авидин/стрептавидин-связывающее устройство, которое было получено путем пропускания раствора, содержащего реагент в соответствии с настоящим изобретением, например, димеры или тримеры биотина через биотинсвязывающее устройство.

В другом варианте порядок проведения данной процедуры может быть обратным, как описано далее.

Для улучшения иммунонацеливания в двухступенчатой процедуре на первой стадии предлагается средство для эффективной очистки кровяного русла от конъюгированных с SA/авидином целенаправляющих молекул путем пропускания крови через устройство, связывающее авидин/стрептавидин, которое было получено путем пропускания раствора, содержащего димеры или тримеры биотина, через биотинсвязывающее устройство, а на второй стадии - очистка крови от молекул, содержащих реагент, вовлеченный в способы в соответствии с настоящим изобретением, например биотин и радионуклид/цитотоксическая часть путем пропускания крови через биотинсвязывающее устройство.

Еще одной альтернативой является улучшение иммунонацеливания в двухступенчатой процедуре - на первой стадии предлагается средство для мониторинга захвата опухолью биотинилированной целенаправляющей молекулы, меченной агентом, который может быть определен гамма-камерой, ПЭТ-сканированием, магнитно-резонансной томографией или другими способами диагностики in vivo, и через подходящее время очистку крови от несвязавшейся с мишенью целенаправляющей молекулы путем пропускания крови через биотинсвязывающее устройство и через подходящее время введение несущего авидин/SA и уничтожающего клетки радионуклидного/цитотоксического агента, который позднее удаляют из кровяного русла путем пропускания крови через авидин/стрептавидинсвязывающее устройство, которое было получено путем пропускания раствора, содержащего реагент в соответствии с настоящим изобретением, например димеры или тримеры биотина через биотинсвязывающее устройство.

Пример 6

Применение модифицированной колонки для улучшения иммунонацеливания в трехступенчатой процедуре

Для улучшения иммунонацеливания в трехступенчатой процедуре на первой стадии предлагается средство для эффективной очистки кровяного русла от биотинилированных направляющих молекул путем пропускания крови через биотин связывающее устройство и на второй стадии - очистка крови от введенного авидина/SA путем пропускания крови через авидин/стрептавидинсвязывающее устройство, которое было получено путем пропускания раствора, содержащего реагент в соответствии с настоящим изобретением, например димеры или тримеры биотина через биотинсвязывающее устройство, и на третьей стадии - очистка крови от молекул, содержащих биотин и радионуклидную/цитотоксическую часть путем пропускания крови через биотинсвязывающее устройство.

1. Способ получения экстракорпорального устройства для извлечения токсичного материала из жидкостей организма млекопитающего в связи с диагностикой или лечением состояния или заболевания млекопитающего, в котором раствор, содержащий реагент, имеющий общую формулу

где биотиновые части представляют собой природный биотин или его производные,

a, b и с представляют собой линкеры, которые являются одинаковыми или различаются,

d представляет собой трехфункциональную перекрестно сшивающую часть, и

токсинсвязывающая часть связана с трехфункциональной перекрестно сшивающей частью через линкер с,

пропускают через устройство, обладающее биотинсвязывающей способностью, где реагент связывается с устройством и где указанное устройство в результате этого превращается из биотинсвязывающего в связывающее токсический материал устройство.

2. Способ по п.1, в котором трехфункциональная перекрестно сшивающая часть, содержащая три функциональные группы, которые являются нуклеофильными или являются реакционно-способными в отношении нуклеофилов, представляет собой алифатическое или ароматическое соединение, предпочтительно ароматическое соединение с 1,3,5-замещением, наиболее предпочтительно производные 1,3,5-бензолтрикарбоновой кислоты, 3,5-диаминобензойной кислоты или 5-амино-1,3-дикарбоксибензола.

3. Способ по п.1, в котором токсинсвязывающая часть представляет собой молекулу, которая связывается с высоким сродством с токсичным материалом с или без эффекторной молекулы, и выбрана из группы, включающей моноклональные антитела, включая их фрагменты или созданные с помощью генной инженерии аналоги, аптамеры, пептиды, олигодезоксинуклеотиды, включая их связывающие фрагменты, интеркалирующие реагенты, включая красители, химиотерапевтические агенты, природные вещества и хелаты металлов, которые специфически связываются с токсичным материалом с или без эффекторной молекулы или с эффекторной молекулой, присоединенной к токсичному материалу.

4. Способ по п.1, в котором один или более из линкеров a, b и с, является(являются) линейным(и) или разветвленным(и) и содержат(ит) обеспечивающие растворимость в воде функциональные части или боковые группы, содержащие амины, карбоксилаты или гидроксильные функциональные части, предпочтительно альфа-карбоксилат или N-метильную группу для улучшения устойчивости к ферментативному расщеплению биотинамидной связи между биотиновой частью или ее производным и спейсером.

5. Способ по п.1, в котором биотиновые производные выбраны из группы, состоящей из норбиотина, гомобиотина, оксибиотина, иминобиотина, дезтиобиотина, диаминобиотина, сульфоксида биотина, биотинсульфона или других биотиновых молекул, обладающих способностью связываться с авидином, стрептавидином и их производными.

6. Способ по п.4, в котором линкеры а и b обеспечивают расстояние минимум 20 и максимум 60 между трехфункциональной перекрестно сшивающей частью и каждым карбоксилатным атомом углерода биотиновой части при измерении в полностью линеаризованной форме.

7. Способ по п.3, в котором токсинсвязывающая часть обладает способностью связываться с высоким сродством с токсичным материалом, выбранным из группы, состоящей из ионов металлов, химиотерапевтических агентов, свободных радионуклидов, радионуклидов, связанных с другими соединениями, пищевых токсинов, токсинов, продуцируемых бактериями, предпочтительно эндотоксинов или энтеротоксинов, токсинов, продуцируемых в результате вирусных инфекций, токсинов, продуцируемых в результате болезненных состояний, продуцируемых пораженными клетками, клетками, участвующими в иммунном ответе, антител против антигенов группы крови, антител против HLA, анти-ксеноантител или любого другого нежелательного эндогенного компонента, присутствующего в жидкости организма на нежелательном уровне в результате заболевания, нарушения или несовместимости с терапевтическим лечением, предпочтительно TNF и цитокининов или любого экзогенного компонента, который вовлечен или мог бы быть вовлечен в заболевание, нарушение или лекарственную несовместимость, предпочтительно биотинсвязывающих молекул.

8. Способ по п.7, в котором биотинсвязывающая молекула выбрана из группы, состоящей из авидина, стрептавидина или их производных или фрагментов, имеющих, по существу, ту же самую способность связывать биотин, что и авидин или стрептавидин, и необязательно связана с эффекторной молекулой.

9. Способ по п.3, в котором эффекторная молекула представляет собой радионуклид, цитотоксический агент, хелатирующий агент для связывания радионуклидов, химиотерапевтический агент, природный токсин или его производное или синтетический токсин.

10. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором токсинсвязывающая часть представляет собой биотин, спейсеры a, b и с представляют собой 4,7,10-триокса-1,13-тридекандиамин и трехфункциональная перекрестно сшивающая часть представляет собой 5-амино-1,3-дикарбоксибензол.

11. Способ по любому из пп.1-9, в котором указанный реагент представляет собой

12. Способ извлечения токсичного материала из жидкостей организма в связи с диагностикой или лечением млекопитающего с использованием экстракорпорального устройства, в котором токсичный материал, необязательно включающий эффекторную молекулу, который был введен в кровяное русло млекопитающего и сохранялся в нем в течение определенного времени для того, чтобы сконцентрироваться в ткани-мишени или клетках, но который не сконцентрировался в указанной ткани-мишени или клетках, непосредственно или через другие предварительно введенные молекулы полностью или частично удаляют из кровяного русла путем пропускания крови или плазмы млекопитающего через экстракорпоральное устройство, содержащее реагент, определенный в любом из пп.1-11.

13. Способ по п.12, в котором токсинсвязывающая часть реагента представляет собой биотин или его производное, в котором

a) биотинилированные направляющие биомолекулы, введенные в кровяное русло млекопитающего, но не сконцентрированные в ткани-мишени или клетках, удаляют из кровяного русла пропусканием через экстракорпоральное биотинсвязывающее устройство и

b) биотинсвязывающие молекулы, введенные в кровяное русло после стадии а), и каждая из которых конъюгирована с эффекторной молекулой, но не сконцентрированные в ткани-мишени или клетках, удаляют из кровяного русла пропусканием через экстракорпоральное устройство, содержащее указанный реагент, для специфичной адсорбции биотинсвязывающих молекул и конъюгированных с ними эффекторных молекул.

14. Способ по п.13, в котором

а) каждая из биотинилированных целенаправляющих биомолекул конъюгирована с эффекторной молекулой и которые были введены в кровяное русло для отслеживания захвата опухолью путем выявления эффекторной молекулы гамма-камерой, ПЭТ-сканированием, магнитно-резонансной томографией или другими способами диагностики in vivo, и в котором эффекторная молекула на стадии b) представляет собой вызывающий гибель клеток радионуклид или цитотоксический агент.

15. Способ по п.13, в котором на стадии b) биотинсвязывающие молекулы не конъюгированы с эффекторными молекулами и в котором на дополнительной стадии с) конъюгат между эффекторной молекулой и биотином или реагент вводят в кровяное русло млекопитающего и, необязательно, кровь очищают от указанного конъюгата, не сконцентрированного в мишени или клетках ткани, путем пропускания через экстракорпоральное биотинсвязывающее устройство.

16. Способ по п.12, в котором токсинсвязывающая часть реагента представляет собой биотин или его производное, в котором

a) биотинсвязывающие молекулы, присоединенные к целенаправляющим молекулам, введенные в кровяное русло млекопитающего, но не сконцентрированные в ткани-мишени или клетках-мишенях, удаляют из кровяного русла пропусканием через экстракорпоральное устройство, содержащее указанный реагент для специфичной адсорбции биотинсвязывающих молекул, и, необязательно,

b) биотинилированные молекулы либо с биотином, либо с реагентом введенные в кровяное русло после стадии а), каждая из которых конъюгирована с эффекторной молекулой, но не сконцентрированные в ткани-мишени или клетках, удаляют из кровяного русла пропусканием через экстракорпоральное биотинсвязывающее устройство.

17. Способ по любому из пп.13-16, в котором биотинилированные целенаправляющие молекулы представляют собой направляющие молекулы, содержащие природный биотин или его производные,

биотинсвязывающие молекулы представляют собой молекулы, содержащие авидин, стрептавидин или их производные,

биотинилированные молекулы представляют собой радиоактивно меченые производные биотина, содержащие часть, хелатирующую радиоактивный металл, и

эффекторная молекула представляет собой радионуклид или цитотоксический агент.

18. Способ по п.12 для одновременной очистки крови от множества антител против HLA, множества антител против антигенов группы крови или множества антиксеноантител предпочтительно перед трансплантацией органа или клеток, который включает экстракорпоральное устройство, содержащее указанный реагент или несколько реагентов, имеющих различные специфичные токсинсвязывающие части.

19. Экстракорпоральное устройство для извлечения токсичного материала из жидкостей организма млекопитающего в связи с диагностикой или лечением состояния или заболевания млекопитающего, которое включает биотинсвязывающую молекулу, связанную с реагентом, как описано в любом из пп.1-11.

20. Экстракорпсфальное устройство по п.19, в котором устройство представляет собой колонку, биотинсвязывающая молекула представляет собой авидин или стрептавидин и реагент представляет собой трибиотинилированный реагент.