Способ прогнозирования течения множественной миеломы

Изобретение относится к медицине, а именно к гематологии, и может быть использовано для прогнозирования выживаемости при множественной миеломе. Сущность изобретения. Выделяют ДНК из лимфоцитов периферической венозной крови методом фенольно-хлороформной экстракции, проводят генотипирование полиморфизма С3435Т промоторной области гена множественной лекарственной устойчивости MDR 1 методом полимеразной цепной реакции синтеза ДНК с последующей рестрикцией. При выявлении у обследуемого генотипа СТ прогнозируют благоприятное течение заболевания, связанное с отсутствием токсического поражения внутренних органов. Преимущество изобретения заключается в повышение точности прогнозирования. 1 табл., 1 ил.

 

Изобретение относится к медицине, а именно, к гематологии, и может быть использовано для прогнозирования выживаемости при множественной миеломе.

Множественная миелома (ММ) относится к группе лимфопролиферативных заболеваний с низкой степенью злокачественности, продолжительность жизни при этом заболевании колеблется от нескольких месяцев до более 10 лет, но в среднем не превышает 5 лет. Заболеваемость множественной миеломой в среднем в мире составляет 3 случая на 100000 взрослого населения. Заболевание характеризуется сложностью прогнозирования течения, ранней утратой трудоспособности и высокой смертностью.

Вместе с тем, своевременное прогнозирование течения заболевания необходимо для организации квалифицированной медицинской помощи, планирования объемов социальной помощи, финансовых расходов на лечение и обслуживание конкретного больного. Вышеизложенное определяет необходимость разработки новых способов прогнозирования выживаемости при ММ.

Согласно литературным данным, к факторам неблагоприятного прогноза ММ относятся: содержание плазматических клеток более 10%; наличие костных повреждений, увеличение концентрации сывороточного β2-микроглобулина более 6 мг/мл, морфологические признаки дисгемопоэза в гранулоцитарном ростке костного мозга (Подольцева Э.И. Классификация множественной миеломы. Гематология и трансфузиология. -1997. - Т.42. № 3. С.8-11).

Известен способ прогнозирования развития ММ по стадии заболевания, сывороточным уровням β-микроглобулина, С-реактивного белка (Anderson K.C., Kyle R.A., Dalton W.S. et al. Multiple Myeloma: New Insights and Therapeutic Approaches // Hematology. - 2000. - P.147-165). Однако установлено, что изменения этих показателей не всегда выявляются в начале развития патологического процесса, когда впервые возникает необходимость в планировании медицинской и социальной помощи. Известен цитогенетический способ прогнозирования развития и исходов MM (Worel N. et al. Deletion of chromosome 13q14 detected by fluorescence in situ hybridization has prognostic impact on survival after high-dose therapy in patients with multiple myeloma // Ann. Hemat. - 2001. - V.80. - P.345-348). Так, например, пациенты с ММ с выявленной делецией хромосомы 13q14 имели более короткую продолжительность заболевания и более низкую выживаемость. Существенными недостатками этого метода являются его трудоемкость и необходимость дорогостоящего оборудования и реактивов.

Прототипом изобретения является способ прогнозирования течения и выживаемости при ММ путем генотипирования полиморфизма - 174 G/C гена интерлейкин 6 (ИЛ-6) в ДНК лимфоцитов периферической крови больных с различной степенью агрессивности ММ (Клинико-генетические ассоциации у больных множественной миеломой / Д.Х.Калимуллина, А.Б.Бакиров, Т.В.Викторова // Гематология и трансфузиология. - 2004. - № 4. - С.13-17). Было выявлено, что в группе с доброкачественным течением ММ статистически значимо чаще встречается генотип СС полиморфизма - 174 G/C гена ИЛ-6, чем генотипы GC и GG. Указанный способ позволяет достоверно прогнозировать характер течения заболевания. Вместе с тем к недостаткам способа следует отнести следующее: 1) на выживаемость при ММ влияет не только характер течения заболевания, определяемый уровнем ИЛ-6, низкий уровень которого ассоциируется с генотипом СС - 174 G/C гена ИЛ-6; 2) значительную роль в выживаемости при множественной миеломе играет чувствительность к химиотерапии и токсические осложнения от нее. Известно, что резистентность к терапии определяется, в том числе, и геном множественной лекарственной устойчивости MDR1, который обеспечивает выведение из клетки токсических веществ за счет увеличения содержания Ргликопротеина (Fishman D., Faulds G., Jeffery R. et al. The effect of novel polymorphisms in the interleukin-6 on IL-6 transcription and plasma levels, and an association with systemic-onset juvenile chronic arthritis // J.Clin. Invest - 1998. - V.102. P.1369-1376; Kafka A., Sauer G., Jaeger C. et al. Polymorphism C3435T of the MDR-1 gene predicts response to preoperative chemotherapy in locally advanced breast cancer // Int. J. Oncol. - 2003. - Vol.22. - N5. - P.1117-21; Ameyaw M.M., Regateiro F., Li T. et al. MDR1 pharmacogenetics: frequency of the C3435T mutation in exon 26 significantly ifluenced by ethnicity // Pharmacogenetics. - 2001. - Vol.11. - N3. - P.217-221). Ассоциации полиморфизма C3435T гена MDR1 с выживаемостью при ММ ранее не исследовались.

Главным недостатком способа является невозможность прогнозировать показатели выживаемости и неблагоприятного течения заболевания на начальной стадии и тем самым запланировать объем помощи данному больному.

Техническим результатом изобретения является повышение точности прогнозирования выживаемости при ММ.

Указанный технический результат достигается тем, что в выделенной методом фенольно-хлороформной экстракции ДНК из лимфоцитов периферической венозной крови проводят генотипирование полиморфизма C3435T промоторной области гена множественной лекарственной устойчивости MDR1 методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) синтеза ДНК с последующей рестрикцией. После амплификации и рестрикции фрагменты ДНК разделяют электрофоретически в 7%-ном полиакриламидном неденатурированном геле и анализируют при ультрафиолетовом освещении на трансиллюминаторе: наличие ДНК-фрагментов 62+145 нуклеотидных пар (н.п.) интерпретируют как цитозин - СС, размером 62+145+207 н.п. - цитозин-тимин - СТ; размером 207 н.п. - как тимин - ТТ.

Для анализа полиморфизма C3435T гена MDR1 были взяты специфические последовательности олигонуклеотидных праймеров из работы Tanabe М. et al (2001). Состав реакционной смеси и условия для ПЦР изложены ниже. Нуклеотидную замену С→Т в положении 3435 гена MDR1 выявляли рестрикцией полученного ПЦР-продукта размером 207 н.п. ферментом Kzo 9I при 37°С. Генотипы типировались по критерию присутствия сайта рестрикции: наличие двух фрагментов длиной 62 и 145 н.п. определяло генотип СС, трех фрагментов длиной 62, 145, 207 н.п. - генотип СТ, одного фрагмента длиной 207 н.п. - генотип ТТ. При выявлении у обследуемого пациента генотипа СТ прогнозируется благоприятное течение заболевания, связанное с отсутствием токсического поражения внутренних органов и ведущее к лучшим показателям выживаемости.

На чертеже представлена кумулятивная выживаемость больных множественной миеломой в зависимости от генотипа по полиморфизму С3435Т гена MDR1.

Способ осуществляется следующим образом.

ДНК выделяют из лимфоцитов периферической крови. В качестве консерванта используют раствор следующего состава: 0.48% лимонной кислоты, 1.32% цитрата натрия, 1.47% глюкозы. При заборе крови к 1 мл консерванта добавляют 6 мл крови и хорошо перемешивают.

Для получения ДНК необходимой степени чистоты и достаточного молекулярного веса используется метод выделения ДНК из крови фенольно-хлороформной экстракцией, описанный Мэтью (Mathew С.С. The isolation of high molecular weight eucariotic DNA // Methods in Molecular Biology. / Ed. Walker J.M., N.Y, L.: Human Press.; - 1984. - V.2. - P.31-34).

1. Кровь в пробирке с консервантом тщательно перемешивается и переливается в центрифужный стакан на 100 мл, туда же добавляли 50 мл охлажденного лизирующего буфера, содержащего 320 мМ сахарозы, 1% раствор тритона Х-100, 5 мМ MgCl₂, 10 мМ трис HCl (рН 7,6).

2. Смесь центрифугируется 20 мин при 4000 об/мин.

3. Надосадочную жидкость сливают, к получившемуся осадку приливают 8 мл 25 мМ ЭДТА, рН 8.0, суспендируют.

4. К суспензии добавляют 0,8 мл 10% SDS и протеиназу К (концентрация - 10 мг/ мл). Смесь для лизиса оставляют на ночь в термостате при температуре 38°С.

Экстракцию ДНК осуществляют в следующем порядке.

1. Для депротеинизации к лизату добавляют 0,5 мл 5М перхлората натрия и 8 мл фенола, насыщенного 1 М трис HCl до рН 7.8.

2. Смесь центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 мин.

3. Отбирают водную фазу, содержащую ДНК, РНК и неденатурированные белки.

4. Отобранную фазу обрабатывают смесью фенол-хлороформа (1:1), а затем - хлороформом.

5. Препараты осаждают двумя объемами 96% этанола.

6. Образовавшийся осадок ДНК растворяют в 1,5 мл деионизированной Н₂О; раствор хранят при -20°С.

1. В дальнейшем полученную ДНК используют в качестве матрицы для полимеразной цепной реакции (ПЦР) для амплификации нужного фрагмента промоторной области гена MDR1. Специфические последовательности олигонуклеотидных праймеров приведены в работе Expression of P-glycoprotein in Human Placenta: Relation to genetic polymorphism of the Multidrug Resistance (MDR)-1 gene / M.Tanabe, I.Ieiri, N.Nagata et al. // J. Pharm. Exper. Therapy. - 2001. - Vol.297. - P.1137-1143.

Нуклеотидную замену С→Т в положении 3435 гена выявляют рестрикцией полученного ПЦР-продукта размером 207 н.п. ферментом Kzo 9I. Состав реакционной смеси для ПЦР следующий: 0.1-1 мкг геномной ДНК, 0.25 мкМ каждого олигопраймера, 250 мкМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата (Promega, USA) помещали в 25 мкл однократного буфера для ПЦР следующего состава: 67 mM Tris-HCl, рН 8.8, 6.7 mM MgCl₂, 16,6 mM (NH₄)₂SO₄, 0.01% Tween-20. Полученную смесь прогревают 2 минуты при 94°С, добавляют 5 единиц термофильной ДНК-полимеразы, 20-30 мкл минерального масла. Режим амплификации: 30 циклов со следующими параметрами: 94°С - 45 секунд, 55°С - 45 секунд, 72°С - 45 секунд.

После 30-го цикла проводили инкубацию при 72°С в течение 7 минут. ПЦР-продукты подвергают рестрикции с помощью фермента Kzo 9I при 37°С в течение ночи и электрофорезу в вертикальном 7% полиакриламидном геле. Для этого 7 мкл ПЦР-продукта смешивают 5 ед. фермента, смесь выдерживают при 37°С в течение 10 часов. В качестве электролита для электрофореза применяют 1X боратный буфер (0,089 М трис HCl, рН=7,8; 0,089 М борная кислота, 0,002 М ЭДТА с рН=8,0).

Перед нанесением на вертикальный электрофорез пробы смешивают в соотношении 1:5 с краской, содержащей 0,25% бромфенолового синего, 0,25% ксиленцианола, 15% фикола. Электрофорез проводят при постоянном напряжении 10 вольт/см после 15-минутного преэлектрофореза. Детекцию результатов проводят путем окрашивания полиакриламидного геля бромистым этидием в течение 10 минут с последующей визуализацией в ультрафиолетовом свете на трансиллюминаторе. Идентифицированные генотипы типируются по критерию присутствия или отсутствия сайта рестрикции, так что Kzo 9I - генотипы СС - это гомозиготы по наличию вариабельного сайта (65+145 н.п.), СТ - гетерозиготы по наличию сайта (65+145+207 н.п.) и ТТ - гомозиготы по наличию сайта (207 н.п.).

В качестве конкретных примеров обследовано в целом 66 больных ММ, находившихся на лечении в гематологическом отделении РКБ, в возрасте от 32 до 75 лет.

Результаты молекулярно-генетического анализа полиморфного локуса С3435Т гена MDR1 у больных ММ представлены в таблице.

Таблица Частоты генотипов полиморфизма локуса С3435Т гена MDR1
Генотипы	Больные множественной миеломой; n=66
Абс.	%
СС	6	9,09
СТ	31	46,97
ТТ	29	43,94

С целью оценки влияния роли полиморфизма С3435Т гена множественной лекарственной устойчивости MDR1 на течение множественной миеломы, проведено сравнение выживаемости по Caplan-Meier пациентов с различными генотипами по этому полиморфизму.

Наилучшие показатели выживаемости были характерны для гетерозигот СТ: 25% больных погибли в течение 34,2 месяцев, медиана выживаемости равна 48 месяцам, а 75% больных погибли в течение 66,8 месяцев.

Значительно худшие показатели у гомозигот ТТ: 25% больных погибли в течение года, 50% - в течение 28,4 месяцев. Мы не приводим показатели выживаемости больных с генотипом СС, так как их было всего 6 человек. Анализ достоверности различий между группами с генотипами ТС и ТТ по Gexan р=0,01; Cox-Mantel p=0,04.

Сравнительные кривые выживаемости приведены на чертеже.

Анализ кривых свидетельствует о том, что гетерозиготы СТ по полиморфизму С3435Т гена MDR1, характеризующиеся повышением Р-гликопротеина в клетке и, соответственно, снижением в клетке токсических веществ, отличались благоприятным течением ММ.

Пример 1. Б-ой М.З. 1941 года рождения, город Уфа, Республика Башкортостан. Диагноз ММ установлен в августе 2001 года, подтвержден стернальной пункцией, где обнаружено 24,5% плазматических клеток. Регулярно получал полихимиотерапию с включением циклофосфана, винкристина, алкерана, белюстина, преднизолона; винкристина, адриабластина и дексаметазона. При молекулярно-генетическом тестировании у больного было взято 8 мл венозной крови с последующем выделением ДНК и амплификацией полиморфного участка С3435Т гена MDR1 в реакционной смеси, содержащей примерно 0.1-1 мкг геномной ДНК, 1 ед. Taq-полимеразы, 0.25 мкМ каждого олигопраймера, 250 мкМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата в 25 мкл однократного буфера для ПЦР. После рестрикции амплифицированных ПЦР-продуктов рестриктазой Kzo 9I провели электрофорез фрагментов при постоянном напряжении 250-300 вольт после 15-минутного преэлектрофореза. После окончания электрофореза гель окрасили раствором бромистого этидия в течение 10 минут и анализировали при ультрафиолетовом освещении на трансиллюминаторе. Исследование полиморфного локуса гена MDR1 больного выявило генотип ТТ. Выявление данного генотипа позволило прогнозировать плохие показатели выживаемости при лечении больного. Пациент скончался в декабре 2001 года.

Пример 2. Пациент X.М.С. 1933 года рождения, г.Дюртюли, Республика Башкортостан. Диагноз ММ установлен в январе 2000 года, подтвержден миелограммой - 14% плазматических клеток. Заболевание было диагностировано во 2 стадии. Проводилось лечение по схеме МР с включением преднизолона и мелфалана с соблюдением доз и интервалов лечения. В настоящее время находится в фазе «плато». При молекулярно-генетическом тестировании у больного было взято 8 мл венозной крови с последующим выделением ДНК и амплификацией полиморфного участка С3435Т гена MDR1 в реакционной смеси, содержащей примерно 0.1-1 мкг геномной ДНК, 1 ед. Taq-полимеразы, 0.25 мкМ каждого олигопраймера, 250 мкМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата в 25 мкл однократного буфера для ПЦР. После рестрикции амплифицированных ПЦР-продуктов рестриктазой Kzo 9I провели электрофорез фрагментов при постоянном напряжении 250-300 вольт после 15-минутного преэлектрофореза. После окончания электрофореза гель окрасили раствором бромистого этидия в течение 10 минут и анализировали при ультрафиолетовом освещении на трансиллюминаторе. Исследование полиморфного локуса гена MDR1 больного выявило генотип СТ. Выявление данного генотипа позволило прогнозировать лучшие показатели выживаемости при лечении больного. Пациент наблюдается в настоящее время (январь 2005 года).

Таким образом, нами проведено молекулярно-генетическое изучение полиморфного локуса С3435Т гена MDR1 66 больных ММ и в контрольной группе. Установлено, что больные с генотипом СТ характеризуются лучшими показателями выживаемости, чем с генотипом ТТ.

Способ прогнозирования течения множественной миеломы, включающий выделение ДНК из лимфоцитов периферической венозной крови больного, генотипирование полиморфного локуса С3435Т гена множественной лекарственной устойчивости MDR1 методом полимеразноцепной реакции синтеза ДНК и при выявлении генотипа СТ прогнозируют благоприятное течение заболевания, связанное с отсутствием токсического поражения внутренних органов.