Штамм вируса гриппа а/17/ вайоминг/03/8(h3n2) для производства живой гриппозной интраназальной вакцины для взрослых и для детей

Изобретение относится к области вирусологии и медицины. Заявлен штамм вируса гриппа А/17/Вайоминг/03/8 (H3N2). Штамм получен методом генетической реассортации эпидемического вируса А/Вайоминг/3/03 (H3N2) с холодоадаптированным штаммом А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) - донором аттенуации - с последующей селекцией в присутствии сыворотки к вирусу А/Ленинград/134/17/57 (H2N2). Полученный штамм является температурочувствительным и холодоадаптированным. Реассортант унаследовал от эпидемического вируса два гена, кодирующих поверхностные белки гемагглютинин и нейраминидазу и шесть генов, кодирующих негликозилированные белки от донора аттенуации. Изобретение может быть использовано в медицине для производства гриппозной интраназальной вакцины для взрослых и для детей. 1 ил., 3 табл.

 

Изобретение относится к медицинской вирусологии и может быть использовано в здравоохранении для профилактики эпидемического гриппа среди взрослых и детей живой интраназальной гриппозной вакциной из штамма А/17/Вайоминг/03/8 (H3N2).

Известный вакцинный штамм вируса гриппа А/17/Сидней/97/76 (H3N2) - прототип [Киселева И.В., Александрова Г.И., Руденко Л.Г., Науменко З.С., Климов А.И. Штамм вируса гриппа А/17/Сидней/97/76 (H3N2) для производства живой гриппозной интраназальной вакцины для взрослых. Патент РФ №2159812 от 27.11.2000. Опубл. БИ 2000. - №33] - утратил антигенную актуальность и вследствие этого не сможет вызвать защитную реакцию во время эпидемии гриппа, вызванной штаммом вируса гриппа, аналогичным вирусу А/Вайоминг/3/03 (H3N2).

Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является получение вакцинного штамма актуальной антигенной разновидности на основе эпидемического вируса А/Вайоминг/3/03 (H3N2).

Вакцинный штамм А/17/Вайоминг/03/8 (H3N2) получен методом генетической реассортации эпидемического вируса А/Вайоминг/3/03 (H3N2) с холодоадаптированным штаммом А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) - донором аттенуации - с последующей селекцией в присутствии антисыворотки к вирусу А/Ленинград/134/17/57 (H2N2). Донор аттенуации - холодоадаптированный температурочувствительный штамм вируса гриппа А/Ленинград/134/17/57 (H2N2), разрешенный для получения безвредных живых интраназальных вакцин [Александрова Г.И., Климов А.И. Живая вакцина против гриппа. - СПб.: Наука. - 1994. - 151 с.].

Вакцинный штамм является температурочувствительным (разность в показателях инфекционной активности при температуре инкубации 33°С и 40°С составляет 8,5 lg ЭИД₅₀/0,2 мл) и холодоадаптированным (разность в показателях инфекционной активности при температуре инкубации 33°С и 25°С равна 3,5 lg ЭИД₅₀/0,2 мл).

Один из двух поверхностных белков вакцинного штамма - гемагглютинин (НА) - в РТГА идентичен вирусу А/Вайоминг/3/03 (H3N2), антисывороткой к которому полностью нейтрализуется.

Методом рестрикционного анализа ДНК копий генов установлено, что вакцинный штамм А/17/Вайоминг/03/8 (H3N2) унаследовал все шесть генов, кодирующих внутренние белки (РВ1, РВ2, PA, NP, M, NS) от донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2), а второй из двух генов, кодирующих поверхностные белки - нейраминидазу (NA) - он унаследовал от эпидемического вируса А/Вайоминг/3/03 (H3N2). Рестрикционный метод [Klimov A.I., Сох N.J. PCR restriction analysis of genome composition and stability of cold-adapted reassortant live influenza vaccines // J.Virol. Methods. - 1995. - Vol.52. - №1-2. - P.41-49] основан на амплификации участков РНК длиной около 150-300 нуклеотидов, включающих уникальные нуклеотидные последовательности, характерные только для донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2), но не для современных эпидемических вирусов гриппа. Обработка амплифицированных фрагментов ДНК специфическими эндонуклеазами (рестриктазами) с последующим электрофорезом обработанных рестриктазами фрагментов ДНК в 1,7%-ном агарозном геле, содержащем 0,5 мкг/мл этидиума бромида, позволяет четко дифференцировать принадлежность генов исследуемых реассортантных штаммов к эпидемическому вирусу или донору аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2).

На чертеже в качестве примера представлена рестрикция ДНК-копии фрагмента гена РА эндонуклеазой Asn I. 1-я дорожка - ДНК маркер молекулярного веса IX; 2-я, 5-я и 8-я дорожки - донор аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2); 3-я и 7-я дорожки - эпидемический вирус А/Вайоминг/3/03 (H3N2); 4-я и 6-я дорожки - кандидат в вакцинные штаммы А/17/Вайоминг/03/8 (H3N2). В РА гене донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) в позиции нуклеотида 1045 имеется замена G→T по сравнению с современными эпидемическими штаммами, приведшая к аминокислотной замене валина эпидемических вирусов на лейцин у донора аттенуации. Донор аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) имеет на этом участке сайт рестрикции для экзогенной рестриктазы Vsp I. У эпидемических вирусов этот рестрикционный сайт отсутствует. Таким образом, обработка всех исследуемых фрагментов ДНК данным ферментом приводит к разрезанию участка гена РА на два более мелких фрагмента, если он происходит от донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2). В случае РА гена от эпидемического вируса расщепления не происходит.

Результаты рестрикционного анализа всех генов вакцинного штамма А/17/Вайоминг/03/8 (H3N2) представлены в табл.1.

Таким образом, представленный вакцинный штамм А/17/Вайоминг/03/8 (H3N2) характеризуется сочетанием полезных признаков, необходимых вакцинному штамму: антигенной специфичностью поверхностных белков эпидемического вируса А/Вайоминг/3/03 (H3N2), структурой генома, оптимальной для реассортантных вакцинных штаммов, температурочувствительностью и холодоадаптированностью, что коррелирует с аттенуацией для человека, характерной для донора аттенуации.

Морфология штамма - полиморфная, типичная для вируса гриппа.

ХАРАКТЕРИСТИКА ШТАММА

Инфекционная активность при репродукции в развивающихся куриных эмбрионах при 33-34°С в течение 48 часов - 8,5 lg ЭИД₅₀/0,2 мл.

Гемагглютинирующая активность - 1:1024.

Штамм проявляет генетическую стабильность биологических признаков после 5 пассажей на куриных эмбрионах (при использовании больших заражающих доз).

Пример получения вакцинного штамма А/17/Вайоминг/03/8 (H3N2) представлен в прилагаемом паспорте.

Таблица 1 Перечень праймеров и рестриктаз, использованных для изучения состава генома реассортантного вакцинного штамма А/17/Вайоминг/03/8 (H3N2), полученного на основе эпидемического вируса А/Вайоминг/3/03 (H3N2) и донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2)
Ген	Нуклеотид	Условное название и нуклеотидная Последовательность праймеров (F - прямой праймер; R - обратный праймер)	Рестриктаза	Рестрикция
ЭВ	ДА	ВШ
РВ2	1459	PB2F-1374	5' GGGAATTGAACATATCGA	Mse I	-	+	+
PB2R-1614	5' TATTGTCAGTTTCTCTGT
РВ1	819	PB1F-740	5' GAGCAATTGCAACACCCG	Hind III	+	-	-
PB1R-1044	5' TGCGATGCTCAGGACGTT
PA	1045	PAF-900	5' TGAGGACCCAAGTCACGA	Vsp I	-	+	+
PAR-1077a	5'CTCATTCTCAATGTCCTGCAGTTCTGCCATTA
NP	1066	NPF-886	5' TATGGACCTGCCGTAGCC	Eco R I	-	+	+
NPR-1200	5' GTACCTGCTTCTCAGTTC
NA	77	NAF-14	5' AAG ATG AAT CCA AAT CAA	Mse I	-	+	+
NAR-775	5' AGT АТС GGC TCT TCC TGA TGC
M	969	MF-785	5' CCCTCTTGTTGTTGCCGC	Fok I	+	-	-
MR-1001	5' CAGCTCTATGCTGACAAA
NS	798	NSF-673	5' CAAAACAGAAACGGAAAA	Cac 8 I	+	-	-
NSR-890	5' AGTAGAAACAAGGGTGTTTTTTATCATTAA
ОБОЗНАЧЕНИЯ: ЭВ - эпидемический вирус А/Вайоминг/3/03 (H3N2), ДА - донор аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2), ВШ - вакцинный штамм А/17/Вайоминг/03/8 (H3N2); «+» - амплифицированная копия фрагмента РНК эпидемического вируса или донора аттенуации рестрицируется соответствующим ферментом; «-» - амплифицированная копия фрагмента РНК эпидемического вируса или донора аттенуации не рестрицируется соответствующим ферментом

ПАСПОРТ ШТАММА

1. Название штамма-А/17/Вайоминг/03/8 (H3N2)

2. Серия - серия 2

3. Метод получения - реассортация; характеристика родительских вирусов:

а). эпидемический вирус - А/Вайоминг/3/03 (H3N2)

б). донор аттенуации - А/Ленинград/134/17/57 (H2N2)

4. Количество пассажей - 6 в процессе реассортации

5. Характеристика штамма:

а). оптимальные условия репродукции - 33°С, 48 часов;

б). гемагглютинирующая активность - 1:1024;

в). инфекционная активность - 8.5 lg ЭИД₅₀/0,2 мл;

г). чувствительность к ингибиторам - ингибиторорезистентный в РТГА с нормальной лошадиной сывороткой;

д). разность в показателях инфекционной активности при 33°С и 40°С - 8.5 lg ЭИД₅₀/0,2 мл;

е). разность в показателях инфекционной активности при 33°С и 25°С - 3.5 lg ЭИД₅₀/0,2 мл.

ж). структура генома реассортанта:

- гены от эпидемического вируса - НА, NA

- гены от донора аттенуации - РВ2, РВ1, PA, NP, M, NS

6. Характеристика штамма после лиофилизации:

а). дата лиофилизации - 26 февраля 2004 года;

б). объем материала в ампуле - 1.0 мл;

в). количество доз в серии - 4;

г). инфекционная активность - 7.5 lg ЭИД₅₀/0.2 мл;

д). гемагглютинирующая активность - 1:256.

7. Рекомендуемое разведение при вакцинации - 1:2.

8. Антигенная специфичность

а). гемагглютинина - идентичен вирусу А/Вайоминг/3/03 (H3N2) по данным РТГА с иммунной крысиной антисывороткой;

б). нейраминидазы - идентична вирусу А/Вайоминг/3/03 (H3N2) по данным ПЦР-рестрикционного анализа ДНК-копий генов.

9. Безвредность для мышей при подкожном и внутрибрюшинном введении

- безвреден.

10. Бактериологический контроль:

дата проведения - 27 февраля 2004 года

результат - стерилен.

11. Контроль на отсутствие посторонних вирусов - посторонние вирусы отсутствуют.

Таблица 2 Реактогенность вакцинного штамма А/17/Вайоминг/03/8 (H3N2) для взрослых людей
Препарат	Число обследуемых	Показатель	Температурные реакции(в °С)	Показатель реактогенности, %
Слабые (37,1-37,5°С)	Средние (37,6-38,4°С)	Сильные (≥38,5°С)
		абс.ч.	3	0	0
Вакцина	49	%	6,1	0	0	0
		абс.ч.	1	1	1
Плацебо	42	%	2,4	2,4	2,4
Таблица 3 Реактогенность вакцинного штамма А/17/Вайоминг/03/8(Н3М2) для детей 3-14 лет
Препарат	Число обследуемых	Показатель	Температурные реакции(в °С)	Показатель реактогенности, %
Слабые (37,1-37,5°С)	Средние (37,6-38,4°С)	Сильные (≥38,5°С)
Вакцина	76	абс.ч. %	3 3,9	1 1,3	0 0	0
Плацебо	58	абс.ч. %	3 5,2	3 5,2	1 1,7

ШТАММ А/17/ВАЙОМИНГ/03/8 (H3N2) АРЕАКТОГЕНЕН ДЛЯ ВЗРОСЛЫХ ЛИЦ

Пример 1. При вакцинации 49 взрослых человек интраназально реассортантным вакцинным штаммом А/17/Вайоминг/03/8 (H3N2) с инфекционной активностью 7,5 lg ЭИД₅₀/0,2 мл в разведении 1:2 в объеме 0,5 мл сильных температурных реакций с повышением температуры свыше 38,5°С и средних температурных реакций с повышением температуры в диапозоне 37,6-38,5°С не наблюдалось. Слабые температурные реакции (до 37,5°С) наблюдались в 6,1% случаев. Результаты обследования приведены в таблице 2.

В получившей плацебо группе из 42 лиц слабые реакции наблюдались у 2,4% лиц, средние температурные реакции - у 2,4% и сильные температурные реакции - у 2,4%.

Показатель реактогенности (разница в проценте средних реакций у привитых вакциной и получивших плацебо) составил 0%.

Таким образом, вакцинный штамм А/17/Вайоминг/03/8 (H3N2) по показателям реактогенности соответствует требованиям, предъявляемым к вакцинным штаммам Фармакопейной статьей ФСП 42-0417-4097-03 на живую сухую гриппозную аллантоисную вакцину для интраназального применения.

ШТАММ А/17/ВАЙОМИНГ/03/8 (H3N2) АРЕАКТОГЕНЕН ДЛЯ ДЕТЕЙ 3-14 ЛЕТ

До 2004 года реассортантные вакцинные штаммы живой гриппозной вакцины для детей и для взрослых готовили на двух разных донорах аттенуации. Вакцинные штаммы живой гриппозной вакцины для взрослых готовили на доноре аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) [Александрова Г.И., Климов А.И. Живая вакцина против гриппа. - СПб.: Наука. - 1994. - 151 с.], а вакцинные штаммы живой гриппозной вакцины для детей - на более аттенуированном доноре А/Ленинград/134/47/57 (H2N2) [Александрова Г.И., Климов А.И. Живая вакцина против гриппа. - СПб.: Наука. - 1994. - 151 с.]. В 2003 году Комитет медицинских иммунобиологических препаратов счел целесообразным рекомендовать «Вакцину гриппозную аллантоисную интраназальную живую сухую для взрослых» для иммунизации детей в возрасте 3-6 лет с внесением соответствующих изменений в «Инструкцию по применению» препарата [Инструкция по применению вакцины гриппозной аллантоисной интраназальной живой сухой. Утверждена Главным санитарным врачом РФ Г.Г.Онищенко 16.06.2004].

В этой связи нами была изучена реактогенность вакцинного штамма А/17/Вайоминг/03/8 (H3N2) на детях.

Пример 2. Группу из 76 детей в возрасте 3-14 лет вакцинировали интраназално в объеме 0,5 мл реассортантным вакцинным штаммом А/17/Вайоминг/03/8 (H3N2) с инфекционной активностью 7,5 lg ЭИД₅₀/мл в разведении 1:2. Группа детей того же возраста из 58 человек получила плацебо. Результаты исследований приведены в таблице 3.

В группе вакцинированных детей сильные температурные реакции с повышением температуры свыше 38,5°С не наблюдались. Средние реакции в диапазоне 37,6-38,5°С наблюдались в 1,3% случаев. Слабые температурные реакции с кратковременным повышением температуры до 37,5°С были отмечены в 3,9% случаев.

В группе детей, получивших плацебо, наблюдались сильные температурные реакции с повышением температуры свыше 38,5°С и средние температурные реакции в диапазоне 37,6-38,5°С в 1,7% и 5,2% случаев соответственно. Слабые температурные реакции отмечены в 5,2% случаев.

Показатель реактогенности (разница в проценте средних реакций у привитых вакциной и получивших плацебо) составил 0%.

Испытания на волонтерах подтвердили, что вакцинный штамм А/17/Вайоминг/03/8 (H3N2) по показателям реактогенности соответствует требованиям, предъявляемым к вакцинным штаммам Фармакопейной статьей ФСП 42-0417-4097-03 на живую сухую гриппозную аллантоисную вакцину для интраназального применения.

На основе вышесказанного предлагаемый по изобретению вакцинный штамм вируса гриппа может быть использован для профилактики гриппа как у взрослых, так и у детей с трехлетнего возраста, что подтверждают результаты изучения его реактогенности для разных возрастных групп.

Штамм вируса гриппа, депонированный в Государственном институте стандартизации и контроля имени Л.А.Тарасевича под №144, используемый для получения живой гриппозной интраназальной вакцины для взрослых и для детей.