Штамм бактерий azotobacter chroococcum, обладающий широким спектром фунгицидного действия и биопрепарат на его основе

Изобретение относится к биотехнологии и микробиологии. Штамм Azotobacter chroococcum BH-1811 выделен из окультуренных почв Московской области методом многоступенчатой аналитической селекции и депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под номером ВКПМ В9029. Биологический препарат, полученный на основе вышеуказанного штамма, предназначен для увеличения урожайности сельскохозяйственных культур и повышения их устойчивости к различным заболеваниям. Данная группа изобретений позволяет повысить урожайность сельскохозяйственных культур и их устойчивость к различным заболеваниям. Препарат может быть использован совместно с пестицидами в одной баковой смеси, что приводит к экономии горюче-смазочных материалов и снижению трудозатрат. 2 н.п. ф-лы, 4 табл.

 

Изобретение относится к сельскохозяйственной биотехнологии и микробиологии, в частности к получению бактериальных препаратов, применяемых в растениеводстве для повышения урожайности сельскохозяйственных культур и их устойчивости к различным заболеваниям.

Известно, что бактериальные препараты на основе штаммов Azotobacter chroococcum обладают способностью увеличивать урожайность ряда сельскохозяйственных культур.

Так, например, препараты на основе штаммов Azotobacter chroococcum ВКПМ-6011 (патент РФ №2074158) и Azotobacter chroococcum ВКПМ-6010 (патент РФ №2074159) повышают урожайность амаранта и зеленных культур соответственно. Однако спектр действия данных препаратов ограничен только указанными культурами.

Известен штамм Azotobacter chroococcum ВКПМ-3064 (патент РФ №1703634, прототип), обладающий антагонизмом по отношению к фитопатогенным грибам и способностью к синтезу индалил-уксусной кислоты (ИУК), а препарат на его основе повышает урожайность целого ряда сельскохозяйственных культур.

Недостатком данного штамма является то, что у него отсутствует антагонизм по отношению к фитопатогенным бактериям, а препарат на его основе не эффективен для зерновых культур.

Задачей изобретения является получение нового высокопродуктивного штамма, обладающего способность к синтезу ИУК, высокой нитрогеназной активностью, широким спектром подавления фитопатогенных грибов и бактерий, способностью сохранять жизнеспособность в присутствии пестицидов, и получение биопрепарата, который повышает урожайность сельскохозяйственных культур, в том числе и зерновых, их устойчивость к различным заболеваниям и может быть использован совместно с пестицидами.

Поставленная задача решается тем, что получен штамм Azotobacter chroococcum BH-1811 ВКПМ В-9029, на основе которого создан биологический препарат, повышающий урожайность сельскохозяйственных культур (в том числе и зерновых) и их устойчивость к различным заболеваниям, и который может быть использован совместно с пестицидами.

Штамм бактерий Azotobacter chroococcum BH-1811 выделен из окультуренных почв Московской области методом многоступенчатой аналитической селекции по следующим признакам: технологичность (способность штамма расти в производственных условиях), высокая продуктивность, в том числе и на регламентных средах, высокая нитрогеназная активность, способность к синтезу ИУК, широкий спектр подавления фитопатогенной микрофлоры.

Полученный штамм депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов и имеет регистрационный номер ВКПМ В-9029.

Полученный штамм характеризуется следующими признаками.

Культурально-морфологические признаки.

При выращивании на агаризованной питательной среде, имеющей состав (мас.%): КН₂PO₄ - 0,05; MgSO₄ - 0,03; NaCl - 0,03; Fe₂(SO₄)₃ - следы; раствор микроэлементов - 0,1; сахароза - 2,0; агар - 2,0, рН 6,8-7,2, при 29±1°С в течение 96 часов культура образует круглые выпуклые блестящие слизистые колонии 2-4 мм, гладкие с ровным краем, непрозрачные, тягучей консистенции, при микроскопировании мелкие палочки 1,0×2,0 мкм, встречаются кокковидные формы.

На твердой питательной среде Берка, имеющей состав (мас.%): КН₂PO₄ - 0,08; К₂HPO₄ - 0,02; MgSO₄ - 0,02; NaCl - 0,02; Fe₂(SO₄)₃ - 0,001; CaSO₄ - 0,01; глюкоза - 1,0; агар - 2,0, рН 6,8-7,0 колонии прозрачные, слегка голубоватые 2-3 мм, с гладкой блестящей поверхностью, круглые, выпуклые с ровными краями. При микроскопировании мелкие палочки кокковидной формы.

При выращивании на жидкой питательной среде Федорова с мелассой (мас.%): меласса - 3,0; К₂HPO₄ - 0,03; MgSO₄ - 0,03; NaCl - 0,05; К₂SO₄ - 0,02; Fe₂Cl₃ - 0,001; СаСО₃ - 0,5; р-р микроэлементов - 0,01; рН 6,8-7,2 при температуре 29±1°С и непрерывном перемешивании - аэрации, равной 1 объем воздуха/1 объем питательной среды в минуту, в течение 24 часов культура представляет собой жидкость; при микроскопировании клетки мелкие палочки, слабоподвижные; зрелые клетки на 48 часу роста мелкие палочки, кокковидной формы, неподвижные, образуют толстостенные цисты.

Размеры клеток варьируют при росте на различных питательных средах 1-1,2×1,5-2,5 мкм. Реакция по Грамму - отрицательная.

На МПА и МПБ рост отсутствует.

Физиолого-биохимические признаки

Мезофил, рост возможен в интервале 25-35°С, оптимальная для роста температура 29±1°С.

Аэроб, при глубинной ферментации на жидкой питательной среде оптимальный режим аэрации-перемешивания 1 объем воздуха/1 объем питательной среды, что соответствует сульфитному числу 1.

Возможен рост при рН 6,5-8,0, оптимально для роста рН 6,8-7,2.

Отношение к источникам углеводов.

Хорошо усваивает глюкозу, сахарозу, маннит, сорбозу, крахмал, декстрин, глицерин, этанол. Не усваивает ксилозу, арабинозу, лактозу, целлюлозу.

Отношение к источникам азота.

Хорошо растет на безазотистых средах, а также на средах с добавлением мелассы и (NH₄)₂SO₄. В качестве источников азота используют нитраты, соли аммония и некоторые аминокислоты.

Отношение к фитопатогенным грибам и бактериям.

Подавляет рост грибов Alternaria sp., Pythium de Baryanum, Fusarium oxysporum, Fusarium vasinfectum, Fusarium moniliforme, Fusarium lini, Cladosporium sp., Scolecotrychum sp., Helmintosporium sativum, Botrytis sp., Verticillium dahliae и бактерий Rhizoctonia sp., Puccinia triticina, Septoria graminum, Actinomyces sp. Активность определяли методом агаровых блочков (Егоров Н.С. Микробы антагонисты и биологические методы определения антибиотической активности. М., "Высшая школа", 1965, с.131.) через 3-6 суток роста тест-культур на диагностических средах (табл.1).

Штамм Azotobacter chroococcum ВН-1811 ВКПМ В-9029 хранится на твердой питательной среде следующего состава, мас.%: КН₂PO₄ - 0,05; MgSO₄ - 0,03; NaCl - 0,03; Fe₂(SO₄)₃ - 0,0005; MnSO₄ - 0,0005; (NH₄)₂MoO₇ - 0,0005; СаСО₃ - 0,35; меласса - 3,0; агар - 2,0. Температура выращивания 29±1°С, продолжительность выращивания 72-96 ч.

Штамм хранится в пробирках на скошенной агаризованной среде при температуре 4±2°С до 2-х лет.

Таблица 1. Спектр антагонистической активности штамма Azotobacter chroococcum BH-1811 ВКПМ В-9029
Тест-культура	Зона подавления роста, мм
Alternaria sp.	9
Botrytis sp.	11
Cladosporium sp.	4
Fusarium brassicae	12
Fusarium lini	9
Fusarium moniliforme	6
Fusarium oxysporum	7
Fusarium vasinfectum	9
Helmintosporium sativum	6
Pythium de Baryanum	12
Scolecotrychum sp.	8
Verticillium dahliae	7
Actinomyces sp.	6
Puccinia triticina	6
Rhizoctonia sp.	10
Septoria graminum	7
Phytophtora infestans	4

Таким образом, получен штамм Azotobacter chroococcum BH-1811 ВКПМ В-9029, имеющий следующие характерные особенности:

- хороший рост на производственных средах в условиях глубинной ферментации;

- широкий спектр подавления фитопатогенной микрофлоры в почве;

- высокая нитрогеназная активность (что характеризует способность штамма к азотфиксации);

- способность к синтезу ИУК (которая относится к фитогормонам и оказывает положительное влияние на рост растений);

- способность сохранять активность при длительном хранении без лиофилизации при температуре 2-4°С.

Кроме того, нами показано (пример 4), что полученный штамм способен сохранять свою жизнеспособность в присутствии ряда пестицидов, что позволяет использовать их в одной баковой смеси с препаратом, в основе которого лежит полученный штамм Azotobacter chroococcum ВН-1811 ВКПМ В-9029.

Биологический препарат для повышения урожайности сельскохозяйственных культур и их устойчивости к различным заболеваниям получен путем 2-ступенчатой ферментации штамма бактерий Azotobacter chroococcum ВКПМ В-9029, при этом первую ферментацию проводят на жидкой питательной среде Федорова с мелассой в течение 24-36 часов, а вторую - на той же среде в течение 48-60 часов, ферментации ведут при температуре 29±1°, непрерывном перемешивании и аэрации, равной 1 объем воздуха/1 объем питательной среды в минуту, посевную культуру засевают из расчета 5-10% от объема питательной среды.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Получение биологического препарата на основе штамма Azotobacter chroococcum ВКПМ В-9029.

Стерильную жидкую питательную среду состава, мас.%: KH₂PO₄ - 0,05; MgSO₄ - 0,03; NaCl - 0,03; Fe₂(SO₄)₃ - 0,0005; MnSO₄ - 0,0005; (NH₄)₂MoO₇ - 0,0005; СаСО₃ - 0,35; Н₃ВО₃ - 0,0005; меласса - 3,0; рН 6,8-7,2 в инокуляторе засевают посевной культурой из расчета 10% от объема питательной среды. Выращивают в течение 30 часов при температуре 29±1°С, непрерывном перемешивании и аэрации, равной 1 объем воздуха/1 объем питательной среды в минуту.

Полученной посевной культурой засевают ферментер с предварительно простерилизованной жидкой питательной средой, имеющей состав, мас.%: КН₂PO₄ - 0,05; MgSO₄ - 0,03; NaCl - 0,03; Fe₃(SO₄)₃ - 0,0005; MnSO₄ - 0,0005; (NH₄)₂MoO₇ - 0,0005; СаСО₃ - 0,35; Н₃ВО₃ - 0,0005; меласса - 3,0; рН 6,8-7,2 из расчета 10% от объема питательной среды. Выращивание проводят при температуре 29±1°С, непрерывном перемешивании и аэрации, равной 1 объем воздуха/1 объем питательной среды в минуту. Продолжительность выращивания 48 часов. Получают вязкую жидкую культуру с титром 20 млрд./мл, нитрогеназной активностью 2135 мкг N₂ и содержанием ИУК 12,1 мкг/мл.

В качестве готового продукта используют вязкую жидкую культуру Azotobacter chroococcum ВН-1811 ВКПМ В-9029 с рН 7,4-7,8 и активностью КОЕ не менее 5 млрд./мл.

Показано, что готовый продукт сохраняет свою активность в течение 6 месяцев при температуре от +4 до +20°С.

Готовый продукт фасуют в заранее простерилизованные канистры по 10 л и сдают на склад.

Пример 2. Влияние препарата на урожайность сельскохозяйственных культур.

Препарат, полученный по примеру 1, применяли для проведения испытаний в открытом грунте (площадь обработки 9 га из расчета 200 мл/га)

- на яровой пшенице и сахарной свекле в Курском НИИАПП (опрыскивание почвы перед посевом);

- на картофеле в Брянском филиале ВНИИКХ (обработка почвы перед посевом);

- на яровой пшенице и горохе в Козангуловском ОПХ (обработка посевов в фазе кущения и обработка почвы перед посевом соответственно);

- на яровом ячмене в Краснодарском крае (обработка семян и внесение в почву)

Таблица 2. Влияние препарата на урожайность сельскохозяйственных культур
Обрабатываемые культуры	УРОЖАЙ, ц/га	Прибавка урожая
	контроль	препарат	ц/га	%
Яровая пшеница	31,2	35,7	4,5	14,4
Сахарная свекла	279,0	349,0	70,0	25,1
Яровой ячмень	17,8	21,2	3,4	19,1
Горох	20,1	22,3	2,2	10,9
Картофель	301,0	432,0	131,0	43,5

Данные испытаний, приведенные в табл.2, показывают, что препарат, полученный на основе штамма Azotobacter chroococcum ВН-1811 ВКПМ В-9029, оказывает положительное влияние на урожайность широкого ряда сельскохозяйственных культур.

Пример 3. Влияние препарата на степень поражения сельскохозяйственных культур болезнями.

В Козангуловском ОПХ и в Курском НИИАПП определяли влияние препарата, полученного по примеру 1, на степень поражения болезнями гороха и яровой пшеницы.

Обработку посевов проводили препаратом на площади 10 га из расчета 200 мл/га.

Результаты, приведенные в табл.3, показывают, что препарат, полученный на основе штамма Azotobacter chroococcum ВН-1811 ВКПМ В-9029, подавляет развитие различных заболеваний сельскохозяйственных культур.

Таблица 3. Влияние препарата на степень поражения гороха и яровой пшеницы различными болезнями.
	Яровая пшеница	Горох
	Бурая ржавчина, %	Септориоз, %	Корневые гнили %	Аскохитоз, %	Ржавчина %	Корневые гнили, %
Козангуловское ОПХ
Контроль	-	-	21,0	13,8	7,2	10,3
Препарат	-	-	6,0	7,3	6,1	9,1
Курское НИИАПП
Контроль	26,5	46,9	-	-	-	-
Препарат	10,1	23,3	-	-	-	-

Пример 4. Влияние пестицидов на жизнеспособность штамма Azotobacter chroococcum ВН-1811 ВКПМ В-9029

Проверку влияния пестицидов на жизнеспособность штамма Azotobacter chroococcum ВН-1811 ВКПМ В-9029 осуществляют путем сравнения жизнеспособности штамма в стандартном рабочем растворе биологического препарата и в рабочем растворе с добавлением химического препарата (пестицида).

Для этого к 1 литру воды добавляют 0,6 мл препарата, полученного по примеру 1, и рассчитанное количество пестицида. Смесь тщательно перемешивают в течение 30 минут и определяют число жизнеспособных клеток штамма в единице объема.

Концентрацию пестицида в смеси рассчитывали исходя из рекомендуемых норм расхода при полевых обработках зерновых культур.

Результаты, приведенные в табл.4, показали, что вышеперечисленные пестициды не оказывают существенного отрицательного влияния на жизнеспособность штамма, а следовательно, препарат, полученный на основе штамма Azotobacter chroococcum ВН-1811 ВКПМ В-9029, при проведении полевых работ может быть использован с пестицидом в одной баковой смеси.

Таблица 4. Влияние пестицидов на жизнеспособность штамма Azotobacter chroococcum BH-1811 ВКПМ В-9029
№ п/п	Название пестицида	Концентрация пестицида в рабочем растворе (%)	Число жизнеспособных клеток (титр) в 1 мл смеси.
1	Контроль (Биопрепарат без пестицида)	-	9,3 млрд.
Гербициды
2	Диален-супер	0,27	4,01 млрд.
4	Лонтрел-300	0,22	4,66 млрд.
Протравители
8	Виал	0,17	6,5 млрд.
11	Премис	0,53	6,55 млрд.
12	Суми 8	0,7	7,4 млрд.
14	ВИАЛ-ТТ	0,13	5,95 млрд.
15	Дивидент	0,7	4,35 млрд.

Таким образом, показано, что препарат, полученный на основе штамма Azotobacter chroococcum ВН-1811 ВКПМ В-9029, повышает урожайность многих сельскохозяйственных культур и увеличивает их устойчивость к различным заболеваниям.

Кроме того, препарат может использоваться совместно с пестицидами в одной баковой смеси, что приводит к экономии горюче-смазочных материалов и снижению трудозатрат.

1. Штамм бактерий Azotobacter chroococcum BH-1811 ВКПМ В-9029, устойчивый к действию пестицидов, используемый для получения биологического препарата, предназначенного для увеличения урожайности сельскохозяйственных культур и повышения их устойчивости к различным заболеваниям.

2. Биологический препарат для повышения урожайности сельскохозяйственных культур и их устойчивости к различным заболеваниям, полученный путем 2-ступенчатой ферментации штамма бактерий Azotobacter chroococcum BH-1811 ВКПМ В-9029, при этом первую ферментацию проводят на жидкой питательной среде Федорова с мелассой в течение 24-36 ч, а вторую - на той же среде в течение 48-60 ч, ферментации ведут при температуре 29±1°C, непрерывном перемешивании и аэрации, равной 1 объему воздуха/1 объем питательной среды в минуту, посевную культуру засевают из расчета 5-10% от объема питательной среды.