Штамм бактерий bacillus mucilaginosus, обладающий широким спектром фунгицидного действия, и биопрепарат на его основе

Изобретение относится к биотехнологии и микробиологии. Штамм Bacillus mucilaginosus Вас-10 выделен из окультуренных почв Московской области методом многоступенчатой аналитической селекции и депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под номером ВКПМ В-8966. Биологический препарат, полученный на основе вышеуказанного штамма, предназначен для увеличения урожайности сельскохозяйственных культур и повышения их устойчивости к различным заболеваниям. Данная группа изобретений позволяет повысить урожайность сельскохозяйственных культур и их устойчивость к различным заболеваниям. Препарат может быть использован совместно с пестицидами в одной баковой смеси, что приводит к экономии горюче-смазочных материалов и снижению трудозатрат. 2 н.п. ф-лы, 5 табл.

 

Изобретение относится к сельскохозяйственной биотехнологии и микробиологии, в частности, к получению бактериальных препаратов, применяемых в растениеводстве для повышения урожайности сельскохозяйственных культур и их устойчивости к различным заболеваниям.

Известен штамм Bacillus mucilaginosus ВКПМ В-5987 (патент РФ №2081867, прототип) и препарат для получения бактериального удобрения, полученный на его основе.

Указанный штамм обладает способностью трансформировать нерастворимые и малорастворимые фосфаты в доступную для растений форму, а бактериальный препарат, полученный на его основе, повышает плодородие почвы, урожайность сельскохозяйственных культур, укореняемость черенков плодовых и декоративных культур.

Недостатком штамма является отсутствие у него антагонизма по отношению к фитопатогенным грибам и бактериям.

Технической задачей изобретения является получение нового штамма, способного трансформировать нерастворимые (малорастворимые) соединения фосфора и калия, обладающего широким спектром антагонистического действия и способного сохранять жизнеспособность в присутствии пестицидов, а также получение биопрепарата, который повышает урожайность сельскохозяйственных культур и их устойчивость к различным заболеваниям и может быть использован совместно с пестицидами.

Поставленная задача решается тем, что получен штамм Bacillus mucilaginosus Вас-10 ВКПМ В-8966, на основе которого создан биологический препарат, повышающий урожайность сельскохозяйственных культур, их устойчивость к различным заболеваниям и который может быть использован совместно с пестицидами.

Штамм бактерий Bacillus mucilaginosus Вас-10 выделен из окультуренных почв Московской области методом многоступенчатой аналитической селекции по следующим признакам: технологичность (способность штамма расти в производственных условиях), хорошая продуктивность, в том числе и на регламентных средах, способность трансформировать нерастворимые (малорастворимые) соединения фосфора и калия, широкий спектр подавления фитопатогенной микрофлоры.

Полученный штамм депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов и имеет регистрационный номер ВКПМ В-8966.

Полученный штамм характеризуется следующими признаками.

Культурально-морфологические признаки

При выращивании на картофельном агаре (масс.%: картофельный отвар - 98,0; агар - 2,0) и среде Александрова (масс.%: К₂HPO₄ - 0,2; MgSO₄ - 0,05; FeCl₂ - следы; сахароза - 0,5; силикаты - 0,1; СаСО₃ - 0,01 (растирается с силикатами); агар - 2,0) при 29±1°С в течение 96 часов колонии светло-серые, гладкие с ровным краем, влажные, блестящие, слегка приплюснуты к поверхности агара, полный цикл развития завершается спорообразованием.

При выращивании на среде Сурмана с мелассой (масс.%: меласса - 0,5; К₂HPO₄ - 0,03; MgSO₄ - 0,01; NaCl - 0,05; KNO₃ - 0,1; СаСО₃ - 1,0) при температуре 29±1°С в течение 48 часов культура представляет собой вязкую жидкость; при микроскопировании клетки крупные единичные палочки и споры до 120-180 млн./мл.

При выращивании на агаризованной среде Эшби (масс.%: сахароза - 2,0; К₂HPO₄ - 0,02; NaCl - 0,02; MgSO₄ - 0,02; СаСО₃ - 0,5; K₂SO₄ - 0,5; агар - 2,0) при температуре 29±1°С в течение 96 часов колонии выпуклые, бесцветные, прозрачные, слизистые, с ровным краем, вязкой консистенции, диаметром 3-5 мм.

При микроскопировании клетки неподвижные, крупные палочки правильной формы с округлыми концами, единичные.

На средах без источника азота (среда Эшби) споры не образуются. При перенесении вегетативных клеток со среды Эшби на картофельный агар или на среду Сурмана с мелассой способность к спорообразованию восстанавливается. Споры имеют овальную форму.

Размеры клеток варьируют при росте на различных питательных средах 1-1,4×4-7 мкм. Грамотрицательны, но окраска по Грамму может варьировать.

На МПА и МПБ рост отсутствует (иногда наблюдается очень слабое развитие).

Физиолого-биохимические признаки

Мезофил, рост возможен в интервале 15-35°С, оптимальная для роста и спорообразования температура 29±1°С.

Аэроб, при глубинной ферментации на жидкой питательной среде оптимальный режим аэрации-перемешивания 1 объем O₂/1 объем питательной среды, что соответствует сульфитному числу 1.

Возможен рост при рН 5,5-8,0, оптимально для роста и спорообразования рН 6,8-7,2.

Отношение к источникам углеводов

Хорошо растет на глюкозе, сахарозе, мальтозе, лактозе, арабинозе, гидролизует крахмал. Плохо усваивает целлюлозу. Из спиртов усваивает маннит, глицирин, лактат. Не усваивает уксусную, молочную, янтарную, лимонную кислоты.

Отношение к источникам азота

В качестве источника азота может быть использован аммонийный азот, карбамид и нитраты.

Отношение к нерастворимым соединениям фосфора и калия

Штамм обладает способностью растворять силикаты, апатиты, трикальцийфосфат, нуклеонат натрия (табл.1).

Таблица 1. Влияние штамма Bacillus mucilaginosus Вас-10 ВКПМ В-8966 на нерастворимые фосфаты
№№ п/п	Наименование показателя	Числовое значение показателя
1	Число жизнеспособных клеток (КОЕ)	150 млн./мл
2	Накопление фосфора в жидкой культуре с внесением в среду (в пересчете на Р2O5):
	- нуклеонат натрия	80,0 мг/мл
	- трикальций фосфат	21,0 мг/мл
	- фторапатит	4,0 мг/мл

Отношение к фитопатогенным грибам и бактериям

Подавляет рост грибов Alternaria sp., Aspergilus niger, Pythium sp., Fusarium oxysporum, Penicillium citrinum, Penicillium expansum и бактерий Erwinia phytophtora, Rhizoctonia sp., Puccinia triticina, Erysiphe graminis, Septoria graminum, Actinomyces sp. Активность определяли методом «лунок» (Егоров Н.С. Микробы антагонисты и биологические методы определения антибиотической активности. М., «Высшая школа», 1965, с.131) через 3-6 суток роста тест-культур на диагностических средах (табл.2).

Таблица 2. Спектр антагонистической активности штамма Bacillus mucilaginosus Вас-10 ВКПМ В-8966
Тест-культура	Зона подавления роста, мм
Altemaria sp.	4
Aspergilus niger	3
Pythium sp.	8
Fusarium oxysporum	6
Penicillium citrinum	5
Penicillium expansum	5
Erwinia phytophtora	4
Rhizoctonia sp.	10
Puccinia triticina	8
Erysiphe graminis	7
Septoria graminum	11
Actinomyces sp.	4

Штамм Bacillus mucilaginosus Вас-10 ВКПМ В-8966 хранится на твердой питательной среде Эшби с добавлением NH₄NO₃ следующего состава, масс.%: сахароза - 2,0; К₂HPO₄ - 0,02; NaCl - 0,02; MgSO₄ - 0,02; NH₄NO₂ - 0,02; СаСО₃ - 0,5; K₂SO₄ - 0,5; агар - 2,0. Температура выращивания 29±1°С, продолжительность выращивания 96 ч.

Штамм хранится в пробирках на скошенной агаризованной среде, при температуре 4±2°С до 3-х лет.

Таким образом, получен штамм Bacillus mucilaginosus Вас-10 ВКПМ В-8966, имеющий следующие характерные особенности:

- хороший рост на производственных средах в условиях глубинной ферментации;

- способность трансформировать труднодоступный для растений фосфор и калий;

- широкий спектр подавления фитопатогенной микрофлоры в почве;

- способность сохранять активность при длительном хранении без лиофилизации при температуре 2-4°С.

Кроме того, показано (пример 4), что полученный штамм способен сохранять свою жизнеспособность в присутствии пестицидов, что позволяет использовать их в одной баковой смеси с препаратом, в основе которого лежит полученный штамм Bacillus mucilaginosus Вас-10 ВКПМ В-8966.

Биологический препарат для повышения урожайности сельскохозяйственных культур и их устойчивости к различным заболеваниям получен путем двухступенчатой ферментации штамма бактерий Bacillus mucilaginosus Вас-10 ВКПМ В-8966, при этом первую ферментацию проводят на жидкой питательной среде Эшби с добавлением NH₄NO₃ в течение 24-36 часов, а вторую - на среде Сурмана с мелассой в течение 48-60 часов, ферментации ведут при температуре 29±1°C, непрерывном перемешивании и аэрации, равной 1 объем воздуха/1 объем питательной среды в минуту, посевную культуру засевают из расчета 5-10% от объема питательной среды.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Получение биологического препарата на основе штамма Bacillus mucilaginosus Вас-10 ВКПМ В-8966

Стерильную жидкую питательную среду состава, масс.%: сахароза - 2,0; К₂HPO₄ - 0,02; NaCl - 0,02; MgSO₄ - 0,02; NH₄NO₃ - 0,02; СаСО₃ - 0,5; K₂SO₄ - 0,5 в инокуляторе засевают посевной культурой из расчета 10% от объема питательной среды. Выращивают в течение 30 часов при температуре 29±1°С, непрерывном перемешивании и аэрации, равной 1 объем воздуха/1 объем питательной среды в минуту.

Полученной посевной культурой засевают ферментер с предварительно простерилизованной жидкой питательной средой, имеющей состав, масс.%: меласса - 0,5; К₂HPO₄ - 0,03; MgSO₄ - 0,01; NaCl - 0,05; KNO₃ - 0,1; СаСО₃ - 1,0, из расчета 10% от объема питательной среды. Выращивание проводят при температуре 29±1°С, непрерывном перемешивании и аэрации, равной 1 объем воздуха/1 объем питательной среды в минуту. Продолжительность выращивания 48 часов. Получают вязкую жидкую культуру, содержащую 180 млн. спор/мл.

В качестве готового продукта используют вязкую жидкую культуру Bacillus mucilaginosus Вас-10 ВКПМ В-8966 с рН 7,5-7,8 и активностью КОЕ не менее 120 млн./мл.

Показано, что готовый продукт сохраняет свою активность в течение 9 месяцев при температуре от +4 до +30°С.

Готовый продукт фасуют в заранее простерилизованные канистры по 10 л и сдают на склад.

Пример 2. Влияние препарата на урожайность сельскохозяйственных культур.

Препарат, полученный по примеру 1, применяли для проведения испытаний в открытом грунте (площадь обработки 9 га, из расчета 200 мл/га):

- на озимой пшенице и ячмене в Курском НИИАПП (площадь обработки 9 га, обработка почвы перед посевом);

- на картофеле в Брянском филиале ВНИИКХ (обработка почвы перед посевом);

- на яровой пшенице и горохе в Казантуловском ОПХ (обработка посевов в фазе кущения и обработка почвы перед посевом соответственно) (см. табл.3).

Таблица 3. Влияние препарата на урожайность сельскохозяйственных культур
Обрабатываемые культуры	УРОЖАЙ, ц/га	Прибавка урожая
контроль	препарат	ц/га	%
Озимая пшеница	27,3	30,0	2,7	9,8
Яровая пшеница	25,6	28,1	2,6	9,8
Ячмень	19,1	21.4	2,3	12,0
Горох	20,1	24,7	4,6	22,9
Картофель	301,0	386,0	85,0	28,2

Данные испытаний, приведенные в табл.3, показывают, что препарат, полученный на основе штамма Bacillus mucilaginosus Вас-10 ВКПМ В-8966, оказывает положительное влияние на урожайность ряда сельскохозяйственных культур.

Пример 3. Влияние препарата на степень поражения сельскохозяйственных культур болезнями.

В Козангуловском ОПХ определяли влияние препарата, полученного по примеру 1, на степень поражения болезнями гороха и яровой пшеницы.

Обработку посевов проводили препаратом на площади 10 га. Из расчета 200 мл/га.

Результаты, приведенные в табл.4, показывают, что препарат, полученный на основе штамма Bacillus mucilaginosus Вас-10 ВКПМ В-8966, подавляет развитие различных заболеваний сельскохозяйственных культур.

Таблица 4. Влияние препарата на степень поражения гороха и яровой пшеницы различными болезнями.
	Яровая пшеница	ГОРОХ
Корневые гнили, %	Аскохитоз, %	Ржавчина, %	Мучнистая роса, %	Корневые гнили, %
Контроль	21,0	13,8	7,2	2.5	10,3
Препарат	9,0	4,2	3,2	2,1	9,4

Пример 4. Влияние пестицидов на жизнеспособность штамма Bacillus mucilaginosus Вас-10 ВКПМ В-8966.

Проверку влияния пестицидов на жизнеспособность штамма Bacillus mucilaginosus Вас-10 ВКПМ В-8966 осуществляют путем сравнения жизнеспособности штамма в стандартном рабочем растворе биологического препарата и в рабочем растворе с добавлением химического препарата (пестицида).

Для этого к 1 литру воды добавляют 0,6 мл препарата, полученного по примеру 1, и рассчитанное количество пестицида. Смесь тщательно перемешивают в течение 30 минут и определяют число жизнеспособных клеток штамма в единице объема.

Концентрацию пестицида в смеси рассчитывали исходя из рекомендуемых норм расхода при полевых обработках зерновых культур.

Результаты, приведенные в табл.5, показали, что вышеперечисленные пестициды не оказывают существенного отрицательного влияния на жизнеспособность штамма, а следовательно, препарат, полученный на основе штамма Bacillus mucilaginosus Вас-10 ВКПМ В-8966, при проведении полевых работ может быть использован с пестицидом в одной баковой смеси.

Таблица 5. Влияние пестицидов на жизнеспособность штамма Bacillus mucilaginosus Вас-10 ВКПМ В-8966.
№ п/п	Название пестицида	Концентрация пестицида в рабочем растворе (%)	Число жизнеспособных клеток (титр) в 1 мл смеси.
1	Контроль (Биопрепарат без пестицида)	-	110 млн
Гербициды
2	Диален-супер	0,27	107 млн
3	Раундап	1,0	103 млн
4	Лонтрел-300	0,22	95 млн
Фунгициды
5	Альто супер	0,17	98 млн
6	Фундазол	0,2	90 млн
7	Тилт	0,17	60 млн
Протравители
8	Виал	0,17	110 млн
9	Бункер	0,17	105 млн
10	Тэбу 60	0,17	102 млн
11	Премис	0,53	100 млн
12	Суми 8	0,7	100 млн
13	ТМТД	1,3	100 млн
14	ВИАЛ-ТТ	0,13	100 млн
15	Дивидент	0.7	95 млн
16	Фенорам супер	0,7	88 млн
17	Витарос	1,0	80 млн

Таким образом, показано, что препарат, полученный на основе штамма Bacillus mucilaginosus Вас-10 ВКПМ В-8966, повышает урожайность многих сельскохозяйственных культур и увеличивает их устойчивость к различным заболеваниям.

Кроме того, препарат может использоваться совместно с пестицидами в одной баковой смеси, что приводит к экономии горюче-смазочных материалов и снижению трудозатрат.

1. Штамм бактерий Bacillus mucilaginosus Вас-10 ВКПМ В-8966, устойчивый к действию пестицидов, используемый для получения биологического препарата, предназначенного для увеличения урожайности сельскохозяйственных культур и повышения их устойчивости к различным заболеваниям.

2. Биологический препарат для повышения урожайности сельскохозяйственных культур и их устойчивости к различным заболеваниям, полученный путем 2-ступенчатой ферментации штамма бактерий Bacillus mucilaginosus Вас-10 ВКПМ В-8966, при этом первую ферментацию проводят на жидкой питательной среде Эшби с добавлением NH₄NO₃ в течение 24-36 ч, а вторую - на среде Сурмана с мелассой в течение 48-60 ч, ферментации ведут при температуре (29±1)°C, непрерывном перемешивании и аэрации, равной 1 объем воздуха/1 объем питательной среды в минуту, посевную культуру засевают из расчета 5-10% от объема питательной среды.