Способ неинвазивной диагностики цитогенетического и цитотоксического действия факторов окружающей среды на организм человека

Изобретение относится к области медицины. Способ диагностики заключается в том, что эпителиальные клетки слизистой носа получают путем соскоба их с внутренней части обеих носовых полостей ватной палочкой, наносят методом отпечатков на сухие предметные стекла, фиксируют в смеси этилового спирта и ледяной уксусной кислоты, высушивают на воздухе, окрашивают ацетоорсеином, промывают дистиллированной водой, окрашивают светлым зеленым, определяют с помощью светового микроскопа десять кариологических показателей, указывающих на мутагенное (цитогенетическое) и цитотоксическое действие исследуемого фактора. Изобретение обеспечивает безболезненность процедуры, повышение достоверности диагностики. 4 з.п. ф-лы, 1 табл.

 

Настоящее изобретение относится к медицине и может быть использовано для неинвазивной диагностики мутагенного (цитогенетического) и цитотоксического действия различных факторов на организм человека.

Известно, что после воздействия на организм человека ионизирующей радиации, химических соединений, вирусов у человека наблюдаются различные формы морфологических аномалий ядер клеток, которые определяются, в основном, в лимфоцитах крови и буккальном эпителии слизистой щеки человека. Эпителиальные клетки слизистой носа для оценки цитогенетического и цитотоксического действия факторов используются редко. Однако эти клетки могут быть наилучшим индикатором действия на организм загрязнений атмосферного воздуха, поскольку именно они находятся под непосредственным воздействием загрязнений атмосферного воздуха и являются барьером на пути поступления химических и биологических факторов в организм человека.

В большинстве исследований для оценки цитогенетического повреждения определяют только частоту клеток с микроядрами и в редких случаях другие показатели.

Известен способ неинвазивной диагностики цитогенетического действия различных факторов на организм человека путем исследования эпителиальных клеток слизистой носа человека (см. Burgaz S., Cakmak G., Erdem O., Yilmaz M., Karakaya A.E. "Micronuclei frequencies in exfoliated nasal mucosa cells from pathology and anatomy laboratory workers exposed to formaldehyde" // Neoplasma, 2001, V.48, N2, p.144-147), включающий получение клеток отоларингологом с помощью эндоцервикальной щеточки, нанесение на сухие предметные стекла, фиксации, окрашивания по методу Фельгена с докраской прочным зеленым и последующего микроскопического анализа с определением одного показателя - частоты клеток с микроядрами.

Недостатками известного способа являются:

- необходимость проведения процедуры взятия материала отоларингологом (ограничивает возможности взятия материала у обследуемых);

- болезненность процедуры при использовании эндоцервикальной щеточки;

- возможность имитации микроядер некоторыми штаммами микробов при окраске по Фельгену (Nair U. et al., 1991);

- оценка цитогенетического эффекта исследуемых факторов только по одному показателю - учету клеток с микроядрами;

- оценка с помощью подготовленных препаратов только цитогенетического эффекта без учета цитотоксического действия.

Технической задачей настоящего изобретения является упрощение способа получения клеток при обследовании населения, повышение достоверности, информативности и, в целом, эффективности оценки действия различных факторов на эпителиальные клетки слизистой носа человека (одновременный анализ цитогенетического и цитотоксического действия).

Указанный технический результат достигается тем, что в способе неинвазивной диагностики цитогенетического и цитотоксического действия различных факторов на организм человека согласно изобретению препараты эпителиальных клеток слизистой носа получают путем соскоба этих клеток ватной палочкой, клетки наносят методом отпечатков на сухое предметное стекло, фиксируют в течение 10 минут в смеси этилового спирта и ледяной уксусной кислоты (3:1), высушивают на воздухе, окрашивают предварительно отфильтрованным 2,5% раствором ацетоорсеина при 37°С в течение 45 минут, промывают в 2-х сменах дистиллированной воды, нагретой до 37°С, дополнительно окрашивают 1% спиртовым раствором светлого зеленого в течение 2-3 минут, промывают дистиллированной водой, высушивают и с помощью светового микроскопа определяют 10 кариологических показателей: клетки с микроядрами, протрузиями (указывают на цитогенетическое действие), аномальной формой ядра, инвагинацией ядерной мембраны, вакуолизацией ядра, конденсацией хроматина, кариопикнозом, кариорексисом, кариолизисом, двуядерные клетки, клетки с центральной ядерной перетяжкой (указывают на цитотоксическое и, возможно, цитогенетическое действие фактора).

Оценка цитогенетического и цитотоксического действия различных факторов на организм человека путем исследования эпителиальных клеток слизистой носа может быть более эффективной, чем при исследовании слизистой щеки, поскольку нос является входными воротами при действии загрязнений атмосферного воздуха. В то же время, в отличие от наиболее широко используемого способа оценки цитогенетического эффекта у человека при анализе лимфоцитов, этот способ является неинвазивным.

Процедура получения клеток напоминает прочистку носа ватной палочкой, безболезненна и может быть проведена медицинским работником (для этого не требуется специалист-отоларинголог).

Предлагаемый способ подготовки материала к микроскопическому исследованию (фиксации и окраски) позволяет корректно выявлять указанные кариологические показатели, т.е. отличать их от микробов, цитоплазматических включений или детрита, путем применения специфичного для ядерного хроматина красителя - ацетоорсеина. Докраска цитоплазмы светлым зеленым позволяет достигать еще большего контраста для выявления ядерного материала и четко определять границы клеток, что важно для подсчета кариологических показателей.

Предлагаемый способ позволяет проводить одновременно оценку цитогенетического и цитотоксического действия любых исследуемых факторов. Оценка частоты клеток с микроядрами является основным общепринятым показателем цитогенетического действия исследуемого фактора. Повышение частоты клеток с микроядрами, образованными отставшими в процессе митоза фрагментами хромосом, свидетельствует об индукции генных или хромосомных мутаций, тогда как увеличение частоты микроядер, образованных одной или несколькими отставшими хромосомами, указывает на геномные (анеугенные) мутации.

Повышение частоты клеток с ядерными протрузиями (protrusions, broken eggs, nuclear buds) может свидетельствовать о цитогенетическом эффекте исследуемого препарата, приводящем к онкогенным процессам. Считают, что значительная часть ядерных протрузий является результатом разрыва в анафазе митоза хромосомных или хроматидных мостов. В то же время предполагают, что ядерные протрузии типа "ядерных почек", по-видимому, могут образоваться в результате "почкования" интерфазных ядер и далее приводить к образованию микроядер. Микроядра и протрузии, образующиеся таким способом служат для выброса амплифицированной ДНК и являются индикаторами онкогенных процессов в клетке. Другие исследователи предполагают, что через образование "ядерных почек" элиминируются комплексы репарации ДНК. В обоих случаях эти показатели отражают цитогенетическое действие исследуемого фактора.

Исследуемый фактор считают цитогенетически активным, если он вызывает статистически значимое повышение частоты эпителиоцитов с микроядрами в группе воздействия по сравнению с контролем. Достоверное повышение частоты клеток с протрузиями служит дополнительным подтверждением цитогенетического эффекта. Таким образом, достоверное повышение частоты клеток с микроядрами и/или протрузиями является индикатором мутагенного и потенциального канцерогенного действия исследуемого фактора.

Другие кариологические показатели позволяют оценить действие исследуемого фактора, приводящее к повреждению и гибели клеток (цитотоксическое и, возможно, генотоксическое). Гибель клеток может происходить двумя путями: апоптоза и некроза. Апоптоз направлен на поддержание постоянного количества клеточных элементов в органах и тканях организма и удаление клеток, прошедших жизненный цикл. Апоптоз обеспечивает физиологическую регенерацию ткани (Kerr et al., 1972). При действии исследуемых факторов на генетический аппарат клетки, апоптоз может усиливаться или снижаться. Гибель клеток путем некроза происходит непосредственно при действии повреждающих факторов на клетки и ткани непосредственно, не затрагивая механизма реализации генетической информации. Механизмы и значение апоптоза и некроза различны, поэтому для оценки действия эндо- или экзогенных факторов важно определять комплекс кариологических показателей, характеризующих тот или иной процесс. В отличие от гибели клеток, вызываемой патологической ситуацией, процессы апоптоза происходят в ядре и цитоплазме при сохранении целостности клеточной оболочки.

По данным Fenech и соавторов (2003) увеличение частоты клеток с аномальной формой ядра, характеризующейся выступами в цитоплазму, при четко просматривающейся, не разрушенной ядерной оболочке и интенсивном окрашивании хроматина свидетельствует об активизации апоптоза (программируемой гибели клеток) в исследуемой ткани и отмечается при канцерогенезе.

Увеличение частоты клеток с инвагинацией кариолеммы или зональным лизисом кариолеммы с выходом хроматина при снижении окрашивания ядра и цитоплазмы свидетельствует об активации некроза в ткани и характеризует цитотоксическое действие.

Увеличение частоты клеток с вакуолизацией ядра и цитоплазмы при снижении окрашивания хроматина является признаком активации некротических процессов в ткани (цитотоксическое действие), в то же время при конденсации хроматина и более интенсивной окраске цитоплазмы вакуолизация может предшествовать кариорексису.

Клетки с конденсацией хроматина, предшествующей пикнозу, кариопикнозом и кариорексисом появляются в результате апоптоза (цитогенетическое действие).

Увеличение количества клеток с кариолизисом при разрушении кариолеммы и клеточной оболочки свидетельствует об усилении некроза (цитотоксическое действие). В то же время сохранение кариолеммы и интенсивное окрашивание цитоплазмы может свидетельствовать о позднем апоптозе (цитогенетическое действие).

Образование двуядерных клеток, по-видимому, происходит в результате деления ядра без деления цитоплазмы, при этом увеличивается их плоидность. Частота двуядерных клеток является индикатором пролиферативной активности в печени после частичной гепатоэктомии (Styles et al., 1987). Отмечают линейную корреляционную связь между частотой тетраплоидных метафаз и двуядерных клеток в культуре (Oshimura et al., 1984). Предполагают, что образование двуядерных и многоядерных клеток может быть следствием аномалий митоза при действии патологических факторов. Их появление характерно при опухолеобразовании. В целом, изменение этого показателя характеризует цитотоксическое и, возможно, цитогенетическое действие фактора.

В настоящее время значимость показателя "частота клеток с центральной перетяжкой ядра" не ясна. Однако в наших исследованиях отмечено повышение частоты таких клеток в слизистой щеки женщин, проживающих в загрязненном районе города по сравнению с условно чистым (Юрченко и соавт., 2000). Установлена прямая корреляционная связь их с частотой двуядерных клеток (неопубликованные данные). Ранее такие клетки характеризовали как "амитоз" - непрямое деление ядра (Клишов, 1968).

Таким образом, повышение частоты клеток с микроядрами и/или протрузиями при действии исследуемого физического, химического или биологического фактора указывают на его цитогенетическое действие; другие показатели (клетки с аномальной формой ядра, инвагинацией ядерной мембраны, вакуолизацией ядра, конденсацией хроматина, кариопикнозом, кариорексисом, кариолизисом, двуядерные клетки, клетки с центральной ядерной перетяжкой) безусловно отражают цитотоксическое действие фактора, но, возможно, также могут свидетельствовать о цитогенетическом эффекте.

Предлагаемым способом обследовано 205 жителей г.Москвы и Московской области, служащих офиса, которых можно принять за условно контрольную группу. Выборка представлена 90 мужчинами и 115 женщинами, в основном, в возрасте 23-59 лет, один человек в возрасте 66 лет. Материал для исследования получен и проанализирован указанным выше способом. Исследованные кариологические показатели (средние значения и пределы варьирования) представлены в Таблице.

Таблица
Средние значения и пределы варьирования кариологических показателей при исследовании слизистой носа жителей г.Москва (условно контрольная группа)
Показатели	xср.±m (пределы варьирования)
Число индивидов	205
Частота клеток с микроядрами в %	0,35±0,03 (0-3)
Частота клеток с ядерными протрузиями в %	1,51±0,08 (0-11)
Частота клеток с аномальной формой ядра в %	33,62±1,76 (0-130)
Частота клеток с вакуолизацией ядра в %	58,41±1,63 (3-142)
Частота клеток с кариорексисом в %	2,27±0,15 (0-15)
Частота клеток с двумя ядрами в %	2,29±0,11 (0-10)
Частота клеток с перетяжкой ядра в %	2,84±0,12 (0-12)

Пример 1.

1. У обследуемой В.Е. ватной палочкой проводили соскоб эпителиальных клеток со слизистой носа, наносили их на сухое предметное стекло, фиксировали в течение 10 минут в смеси этилового спирта и ледяной уксусной кислоты (3:1), окрашивали 2,5% раствором ацетоорсеина при 37°С в течение 45 минут, промывали в 2-х сменах дистиллированной воды, нагретой до 37°С, дополнительно окрашивали 1% спиртовым раствором светлого зеленого в течение 3 минут, промывали дистиллированной водой. С помощью светового микроскопа на предметном стекле анализировали по 1000 клеток назального эпителия, среди которых учитывали клетки с микроядрами, клетки с протрузиями, клетки с аномальной формой ядра, инвагинацией ядерной мембраны, вакуолизацией ядра, конденсацией хроматина, кариопикнозом, кариорексисом, кариолизисом, двуядерные клетки, клетки с центральной ядерной перетяжкой. Получены следующие результаты. У обследуемой среди 1000 проанализированных клеток выявлено 3 клетки с микроядром, 8 клеток с протрузиями, в целом 11 клеток с цитогенетическими повреждениями, 62 клетки с вакуолизацией хроматина, 22 клетки с кариорексисом, 8 клеток с двумя ядрами, 6 клеток с центральной ядерной перетяжкой. Обнаружена высокая по сравнению с контролем (таблица 1) частота клеток с микроядрами и протрузиями. Повышение частоты двух цитогенетических показателей(клеток с микроядрами и клеток с протрузиями, которые не учитывались в прототипе) позволяет более обосновано диагностировать цитогенетический эффект.

Пример 2.

У обследуемой А.В. проводили забор эпителиальных клеток слизистой носа и микроскопический анализ клеток указанным в примере 1 способом. Среди 1000 проанализированных клеток выявлена 1 клетка с микроядром, 7 клеток с протрузиями, в целом 8 клеток с цитогенетическими повреждениями, 22 клетки с вакуолизацией хроматина, 9 клеток с двумя ядрами, 12 клеток с центральной ядерной перетяжкой. Частота клеток с протрузиями, двуядерных клеток и клеток с центральной перетяжкой ядра повышена по сравнению с контролем (таблица 1), что свидетельствует о цитогенетическом и цитотоксическом повреждении эпителия слизистой носа при действии факторов окружающей среды. Следует отметить, что цитогенетический эффект выявлен по показателю "частота клеток с протрузиями", который в прототипе не учитывался.

Пример 3.

У обследуемой О.Е. проводили забор эпителиальных клеток слизистой носа и микроскопический анализ клеток указанным в примере 1 способом. Среди 1000 проанализированных клеток выявлена 1 клетка с микроядром и 1 клетка с протрузией, 158 клеток с вакуолизацией хроматина, 2 клетки с кариорексисом, 3 клетки с двумя ядрами, 3 клетки с центральной ядерной перетяжкой. Выявлена повышенная по сравнению с контролем частота клеток с вакуолизацией хроматина, что позволяет диагностировать цитотоксическое действие факторов окружающей среды. Цитотоксический эффект в прототипе не учитывался.

При выявлении у обследуемых цитогенетических и/или цитотоксических нарушений эпителия слизистой носа при действии факторов окружающей среды им даются соответствующие рекомендации по оптимизации качества жилой среды, диеты, витамино- и минералотерапии. При использовании указанного способа в эпидемиологических исследованиях и выявлении повышенной средней частоты цитогенетических и цитотоксических показателей в группе воздействия относительно контроля проводится поиск и вычленение факторов, индуцирующих цитогенетический и/или цитотоксический эффект для устранения или минимизации их действия, рекомендуется проведение гигиенических мероприятий, направленных на улучшение условий труда и качества окружающей среды.

1. Способ неинвазивной диагностики воздействия факторов окружающей среды (ОС) на организм человека путем определения цитогенетического действия, включающего забор материала в виде эпителиальных клеток со слизистой носа, окрашивание материала и проведение микроскопического анализа с учетом клеток с микроядрами, отличающийся тем, что забор материала проводят путем соскоба клеток ватной палочкой, фиксируют материал в смеси этилового спирта и ледяной уксусной кислоты, осуществляют окрашивание ацетоорсеином, затем докрашивают светлым зеленым, после чего при микроскопии дополнительно учитывают клетки с протрузиями и, кроме того, определяют клетки с аномальной формой ядра, инвагинацией ядерной мембраны, вакуолизацией ядра, конденсацией хроматина, кариопикнозом, кариорексисом, кариолизисом, двуядерные клетки, клетки с центральной ядерной перетяжкой, при повышении относительно контроля частоты клеток с микроядрами и протрузиями диагностируют наличие цитогенетического действия факторов ОС, а при повышении относительно контроля частоты клеток с аномальной формой ядра, инвагинацией ядерной мембраны, вакуолизацией ядра, конденсацией хроматина, кариопикнозом, кариорексисом, кариолизисом, двуядерных клеток, клеток с центральной ядерной перетяжкой диагностируют наличие цитотоксического действия факторов окружающей среды.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что фиксацию клеток осуществляют смесью этилового спирта и ледяной уксусной кислоты, взятых в соотношении 3:1, в течение 10 мин.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что клетки окрашивают предварительно отфильтрованным 2,5%-ным раствором ацетоорсеина при 37°С в течение 45 мин.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что после окраски клетки промывают в 2-х сменах дистиллированной воды, нагретой до 37°С.

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что клетки докрашивают 1%-ным спиртовым раствором светлого зеленого в течение 2-3 мин.