Противоопухолевый липосомный препарат направленного действия

Изобретение относится к фармацевтической промышленности и используется в качестве противоопухолевого средства. Противоопухолевый липосомный препарат на основе смеси флаволигнанов или их экстрактов из плодов расторопши пятнистой, при этом препарат выполнен в липосомной форме с размерами частиц 100-500 нм и дополнительно содержит векторный компонент пептидной природы, ковалентно присоединенный к липидам оболочки липосомы, причем в качестве векторного компонента пептидной природы используют белок, выбранный из группы представителей семейств факторов роста эпителия, трансформирующих факторов роста, онкофетальных белков, факторов роста эндотелия и факторов роста фибробластов или группы активных пептидных фрагментов перечисленных белков. Вышеописанный препарат обладает повышенным противоопухолевым действием, увеличивается скорость доставки препарата к опухолевой клетке-мишени. 1 табл.

 

Предлагаемое изобретение относится к области химии природных соединений, биотехнологии, фармакологии и медицине и может быть использовано для терапии злокачественных новообразований.

Изобретение касается противоопухолевого липосомного препарата направленного действия, содержащего в качестве активного вещества смесь флаволигнанов (силибинин, силидианин и силикристин) или их экстрактов из плодов расторопши пятнистой (Silybum marianum (L.) Gaerth) и обеспечивающего направленную доставку активного вещества к опухолевым клеткам-мишеням.

Известно использование суммы флаволигнанов из плодов расторопши пятнистой в качестве гепатопротекторных препаратов, таких как карсил, легален, силибор (М.Д.Машковский. Лекарственные средства, М. 1993 г, т.1).

Хотя флавоноиды известны довольно давно в качестве веществ, обладающих гепатопротекторными свойствами, в последние годы накапливается все больше экспериментальных данных, свидетельствующих об их выраженном противоопухолевом действии (Larocca, Br.J. Hematology 75, 489, 1990), (Scambia, Br.J. Gynecologic Oncology 45, 13, 1992). Доступность, отсутствие токсичности и высокая противоопухолевая активность делают флавоноиды весьма привлекательными с точки зрения создания лекарственных препаратов. Применение флавоноидов в виде липосомных форм может значительно увеличить эффективность действия препаратов за счет снижения скорости их выведения из кровотока и адресной доставки к местам локализации опухолей.

Известно, что флаволигнаны, как правило, нерастворимы или минимально растворимы в воде, вследствие чего скорость высвобождения этих соединений и, следовательно, также их биологическая доступность и их всасываемость в организме человека неудовлетворительны.

Делались попытки добиться молекулярного изменения флаволигнанов путем обработки или взаимодействия их с подходящими химическими агентами и перевести их таким образом в производные с улучшенной водорастворимостью и повышенной скоростью высвобождения.

Так, известен комплекс силибинина с циклодекстрином (пат. РФ №2108109). Скорость растворения и высвобождения комплекса более высокая в сравнении с силибинином.

Известна флаволигнановая композиция, содержащая силимарин-сопреципитат или силибинин-сопреципитат и вспомогательные вещества, такие как сорбитановые эфиры жирных кислот и полиоксиэтиленовых производных сложных сорбитановых эфиров, водорастворимого производного сахара или целлюлозы и поливинилпирролидона (пат. РФ №2157225).

Недостатком таких комплексов является то, что рассматриваемый в отдельном случае флаволигнан связан с химическим соединением, которое может физиологически действовать как чужеродное вещество и вызывать возможно нежелательные побочные реакции или ухудшать активность флавонолигнина.

Известно средство для лечения и профилактики онкологических заболеваний на основе флаволигнанов, выбранных из изомеров силимарина, в комплексе с фосфолипидами (Патент РФ №2161488). В качестве носителя средство содержит жидкие полусинтетические глицериды жирных кислот со средней длиной цепи. Данное средство можно вводить перорально или путем инфузии: для перорального пути введения в качестве носителей особенно пригодны натуральные или синтетические фосфолипиды, поскольку они образуют жирорастворимые стабильные комплексы с изомерами силимарина; а также жидкие полусинтетические глицериды, содержащие триглицериды жирных кислот со средней длиной цепи, или их аналоги, которые могут облегчать биодоступность отдельных соединений, их натуральных смесей или содержащих их экстрактов.

В данном патенте указано, что силимарин, представляющий собой смесь флаволигнанов силибинина, силидианина и силикристина, обладает высоким сродством к эстрогеновым рецепторам типа II и антипролиферативной активностью в отношении опухолевых клеточных линий (матки, яичника и молочной железы). Авторы предлагают применять комплексы флаволигнанов в качестве лекарственных средств, обладающих активностью в отношении эстрогенных рецепторов типа II, локализованных на поверхности опухолей матки, яичника и молочной железы, что значительно суживает круг онкологических заболеваний, которые могут быть подвергнуты терапии с помощью флаволигнанов. Кроме того, недостатком предлагаемого средства являются сравнительно низкая адресность доставки флаволигнанов к опухолевым клеткам-мишеням и достаточно быстрое выведение их из организма, а следовательно, и недостаточная терапевтическая эффективность препарата.

Наиболее близким по технической сущности к настоящему изобретению относится противоопухолевый липосомный препарат на основе смеси флаволигнанов или их экстрактов из плодов расторопши пятнистой (Silibum marianum (L.) Gaertn) в липосомной форме с размерами частиц 100-500 нм (заявка РФ №2005108651 от 29.03.05).

Известный препарат предназначен для лечения и профилактики не только эстрогензависимых опухолей, но и широкого спектра опухолей эпидермального и мезенхимального происхождения и отличается простотой и технологичностью получения, сочетающейся с низкой биодеградабельностью. Несмотря на то, что средство способно избирательно доставляться к пораженному органу-мишени, скорость этой доставки недостаточна.

Задача данного изобретения - увеличение скорости доставки средства к опухолевой клетке-мишени, усиление противоопухолевой активности действующего компонента препарата за счет увеличения стабильности в кровяном русле.

Поставленная задача решается за счет использования противоопухолевого липосомного препарата направленного действия на основе смеси флаволигнанов или их экстрактов из плодов расторопши пятнистой в липосомной форме с размерами частиц 100-500 нм. При этом препарат дополнительно содержит в своем составе векторный компонент пептидной природы, ковалентно присоединенный к липидам оболочки липосомы и обеспечивающий направленную доставку активного вещества к опухолевым клеткам-мишеням. Векторный компонент может быть выбран из группы белков - представителей семейств факторов роста эпителия, трансформирующих факторов роста, онкофетальных белков, факторов роста эндотелия и факторов роста фибробластов. В качестве векторного компонента могут быть также использованы укороченные фрагменты перечисленных белков.

Вследствие низкого содержания или отсутствия рецепторов к векторному компоненту липосом, наполненных смесью флаволигнанов или их экстрактом из плодов расторопши, на поверхности нормальных клеток и экстремально высокой плотности рецепторов на опухолевых клетках липосомы адресно доставляются в последние и преодолевают мембрану клетки путем рецепторопосредованного эндоцитоза. Предлагаемый заявителем подход сочетает в себе простоту и технологичность получения липосомной формы экстракта плодов расторопши, а молекулярный дизайн препарата и механизм его доставки в опухолевые клетки позволяет значительно увеличить время циркуляции смеси флаволигнанов или их экстрактов из плодов расторопши пятнистой в крови и усилить его противоопухолевое действие.

Изобретательской задачей является создание эффективного противоопухолевого препарата направленного действия, представляющего собой нацеленные липосомы с ковалентно связанным с липидами оболочки липосом векторным компонентом пептидной природы, обеспечивающим специфическое связывание липосом с рецепторами поверхности опухолевых клеток и эффективную внутриклеточную доставку активного содержимого липосом в опухолевые клетки. В качестве противоопухолевого препарата, заключенного в липосомы, предлагается использовать смесь флаволигнанов (силибин, силидианин и силикристин) или содержащих их экстрактов из плодов расторопши пятнистой (Silybum marianum (L.) Gaerth). Предлагаемый липосомный препарат обладает способностью избирательно связываться с рецепторами на поверхности опухолевых клеток или эндотелиальных клеток опухолевых сосудов.

Препарат может быть легко получен с помощью стандартных биотехнологических и химических методов, отличается стабильностью и технологичностью получения, может быть использован для лечения различных онкологических заболеваний. Таким образом, изобретение полностью соответствует критерию «изобретательский уровень».

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Получение направленных липосом, содержащих смесь флаволигнанов.

Липосомы, содержащие фосфатидилхолин и холестерин в соотношении 7/3, получали по методу [Szoka F. and Papahadjopoulos D. Annu. Rev. Biophys. Bioeng. 9:467-508, 1980]. Включение смеси флаволигнанов или их экстрактов из плодов расторопши пятнистой в полученные липосомы осуществляли по методам [Lasic D.D. et al. FEBS Lett. 312:255-258, 1992; Наган G. et al., Biochim. Biophys. Acta 1151:201-215, 1993]. Степень включения флаволигнанов в липосомы составляет 95-98% при соотношении 300 мг препарата/100 мМ фосфолипида. Ковалентные конъюгаты векторных компонентов пептидной природы, выбранных из группы представителей семейств факторов роста эпителия (также трансформирующих факторов роста, онкофетальных белков, факторов роста эндотелия и факторов роста фибробластов или группы активных пептидных фрагментов перечисленных белков) с фосфатидилэтаноламином синтезировали с использованием стандартных методов и различных кросс-линкеров и затем инкубировали совместно с липосомами при 45-60°С в течение 0,5-1 ч. Полученные нацеленные липосомы с размером частиц 100-500 нм отделяли от невключенного конъюгата методом гель-фильтрационной хроматографии на колонке с CL-4В-сефарозой.

Полученные направленные липосомы растворяют в физиологическом растворе или фосфатно-солевом буфере, рН 7,4. Дополнительно противоопухолевый препарат направленного действия может содержать вспомогательные вещества.

Пример 2. Противоопухолевая активность липосомного препарата направленного действия в отношении экспериментальных опухолей у животных.

Клетки меланомы линии В 16 поддерживали путем еженедельной внутрибрюшинной перевивки мышам С 57 В 1/6. Для индукции солидных опухолей мышам вводили подкожно клеточную суспензию (2·10⁵ клеток в 0,1 мл физиологического раствора). Липосомный препарат направленного действия, полученный, как описано в примере 1, содержащий в качестве векторного компонента пептидной природы фактор роста эпителия, вводили опытным животным внутривенно. В качестве препарата сравнения использовали прототип - экстракт расторопши в липосомной форме. В качестве дополнительного контроля использовали смесь флаволигнанов из экстракта расторопши, вводимую внутрижелудочно в 1% крахмальном клейстере по той же схеме. Препараты вводили один раз в неделю, всего три приема, начиная с 3-го дня после прививки опухоли. Однократные дозы препаратов составляли 20 мг/кг в пересчете на сухую смесь флаволигнанов. Каждая экспериментальная группа состояла из шести животных, контрольная (нелеченные животные) - из десяти. Размер опухолей измеряли один раз в 2-3 дня. Объем опухоли вычисляли по формуле , где а - короткий, b - длинный диаметр опухоли. Относительный размер опухолей (ОРО) определяли по формуле: , где Р_оп - средний размер опухолей в опытной группе, Р_к - средний размер опухолей у контрольных животных. Увеличение продолжительности жизни леченых животных по сравнению с контролем определяли по формуле: , где Т - средняя продолжительность жизни (СПЖ) леченых животных, дни, С - СПЖ контрольных животных, дни.

Результаты эксперимента приведены в табл.1. Как видно из таблицы, эффективность терапии липосомным препаратом значительно превышает таковую от применения контрольного препарата и препарата сравнения (прототипа) и выражается в значительном торможении роста опухолей и увеличении средней продолжительности жизни леченных животных.

№	Группа животных/препарат	ТРО, %	УПЖ, %
1	Смесь флаволигнанов из экстракта расторопши	23	18
2	Заявленный липосомный препарат направленного действия	49	43
3	Прототип - экстракт расторопши в липосомной форме	40	36

Аналогичные результаты были получены в экспериментах с применением липосомных препаратов направленного действия, содержащих в качестве векторных компонентов пептидной природы белки - представители семейств факторов роста эпителия, трансформирующих факторов роста, онкофетальных белков, факторов роста эндотелия и факторов роста фибробластов, а также их укороченные фрагменты.

Противоопухолевый липосомный препарат на основе смеси флаволигнанов или их экстрактов из плодов расторопши пятнистой, отличающийся тем, что препарат выполнен в липосомной форме с размерами частиц 100-500 нм и дополнительно содержит векторный компонент пептидной природы, ковалентно присоединенный к липидам оболочки липосомы, причем в качестве векторного компонента пептидной природы используют белок, выбранный из группы представителей семейств факторов роста эпителия, трансформирующих факторов роста, онкофетальных белков, факторов роста эндотелия и факторов роста фибробластов или группы активных пептидных фрагментов перечисленных белков.