Композиция для стимулирования образования костной ткани и сращения кости
Настоящее изобретение относится к композиции для стимуляции образования костной ткани и сращения кости, более конкретно к композиции для стимуляции образования костной ткани и сращения кости, полученной путем добавления материала, стимулирующего образование костной ткани и сращение кости, к смеси триполифосфата и водорастворимого хитозана. Изобретение обеспечивает получение композиции для стимулирования сращения кости на ранней фазе, которая являлась бы недорогой и пригодной для применения у людей. 8 з.п. ф-лы, 12 ил.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
Настоящее изобретение относится к композиции для стимуляции образования костной ткани и сращения кости, более конкретно к композиции для стимуляции образования костной ткани и сращения кости, полученной путем добавления материала, стимулирующего образование костной ткани и сращение кости, к смеси триполифосфата и водорастворимого хитозана.
ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В последнее время потеря костной массы часто вызывается заболеванием или дорожно-транспортным происшествием, так что восполнение потери костной массы является очень важным. Одним из путей восполнения потери костной массы является свободная пересадка кости, а более предпочтительно применяется заливочная композиция для соединения кости. В настоящее время для усиления роста кости или для коррекции размера недостаточно развитых челюстей применяется методика вытяжения кости, для которой также требуется большое количество заливочной композиции для соединения кости.
Методика вытяжения кости применяется для стимуляции роста кости, в особенности роста в длину, путем растяжения, исходя из теории, что «растягивающие усилия стимулируют гистогенез». Методика вытяжения кости разрабатывалась в первую очередь для стимуляции роста костей конечностей, но также широко применялась для вытяжения челюстной кости. Метод вытяжения челюстной кости представляет собой одну из разработанных в области челюстно-лицевой хирургии методик, которая позволяет улучшить пропорции лица не путем рассечения кости, а путем постепенного смещения костей лицевого черепа посредством наложения фиксирующего аппарата для вытяжения кости на подвергаемые обработке части челюстной кости и центральной части лица.
После того как Илизаровым были разработаны биомеханические элементы для вытяжения кости (Ilizarov GA, J. Dis. Orthop. Inst., 48(1): 1, 1988; Ilizarov GA, Clin. Ortho., 239: 263, 1989; Ilizarov GA, Clin. Ortho., 238: 249, 1989), методика вытяжения кости успешно применялась для восполнения потери костной массы трубчатых костей. Для успешного выполнения вытяжения кости важно поддерживать хорошее кровоснабжение в участке вытяжения кости и надежно закрепить внешний фиксатор на обеих сторонах суставной части трубчатой кости, что приводит к стимуляции сращения кости путем ее постепенного вытяжения (White SH, J. Bone Join Surgery, 72-B: 350, 1990; White SH, Orthop. Clin. North. Amer., 22: 569, 1991; Fischgrund J., Paley D., Sulter D., Clin. Orthop., 301: 31, 1994).
Период сращения кости зависит от подвергаемой вытяжению части кости, такой как кость лицевого черепа или трубчатая кость, состояния кровоснабжения, возраста пациента и так далее. После вытяжения кости сращение черепно-лицевой кости занимает 3-5 недель у детей и 6-12 недель у взрослых, в то время как сращение трубчатой кости занимает 3-6 месяцев независимо от возраста пациента. Выполнение вытяжения черепно-лицевой кости сопряжено с рядом трудностей, одна из которых заключается в высоком риске возникновения осложнений, а другая - в длительном возврате к нормальной жизни вследствие продолжительности периода сращения кости. А именно лечение после вытяжения кости занимает 2-4 месяца и включает в себя латентную фазу, фазу вытяжения кости и фазу сращения кости.
В сообщении Carls и Sailer было отмечено, что при росте на 1 мм в сутки биохимические и физиологические показатели были лучше, чем при росте на 2-3 мм в сутки (Carls & Sailer, J. Craniomaxillofac. Surg., 94: 152, 1994). Илизаровым также было отмечено, что при росте на 1 мм в сутки наблюдались наилучшие результаты, в то время как при росте на 0,5 мм в сутки происходило преждевременное сращение кости, а рост на 2 мм в сутки приводил к возникновению нежелательных изменений в подвергаемых вытяжению тканях (Ilizarov, J. Dis. Orthop. Inst., 48(1): 1, 1988; Ilizarov, Clin. Ortho. 239: 263, 1989). Кроме того, также известно, что последовательный рост вызывает наименьшие повреждения в тканях и наилучшее развитие капиллярных сосудов и образование костной ткани. Поэтому сокращение продолжительности вытяжения кости и сращения кости может способствовать предупреждению развития возможных осложнений и более быстрому возвращению пациента к нормальной жизни. Для того чтобы сократить продолжительность вытяжения кости и сращения кости, с целью стимуляции образования костной ткани и сращения кости применяют заливочную композицию для соединения кости.
Между тем известно, что костный аутотрансплантат, обработанный гомотрансплантат, гетеротрансплантат и заменитель костного трансплантата стимулируют образование костной ткани. Костный аутотрансплантат применяют для суставной агглютинации (joint-agglutination) или лечения перелома без вытяжения (non-agglutinational fracture) или для предупреждения образования разрушений и пустот, вызванных инфекцией, опухолью или хирургическим вмешательством, посредством заполнения полости кости и восполнения потери костной массы. Пересаженный костный аутотрансплантат обладает высокой способностью к всасыванию, что приводит к восстановлению циркуляции крови. В это время дифференцировка клеток-предшественников костной ткани приводит к образованию костных остеобластов, активация которых стимулирует восстановление кости, а также восполняет потерю костной массы. Однако применение костного аутотрансплантата проблематично вследствие наличия ограничения на количество забираемого костного материала и высокой болезненностью, которую вызывает вспомогательная операция по забору донорской кости. Поэтому для стимуляции восстановления кости в участках вытяжения применяют костный морфогенный белок или другой заместитель костного трансплантата. Костный морфогенный белок считается наиболее эффективным материалом, индуцирующим восстановление кости, но его применение в клинике ограничено вследствие его высокой стоимости и трудностей его получения.
Поэтому авторы настоящего изобретения попытались разработать композицию для стимуляции образования костной ткани и сращения кости, которая являлась бы недорогой и пригодной для применения у людей. В результате авторы настоящего изобретения получили композицию путем добавления материала, стимулирующего образование костной ткани и сращение кости, к смеси триполифосфата и водорастворимого хитозана и доказали, что композиция по настоящему изобретению стимулирует сращение кости на ранней фазе и сокращает период образования костной ткани путем уменьшения времени сращения кости.
КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к композиции для стимуляции образования костной ткани и сращения кости, более конкретно к композиции для стимуляции образования костной ткани и сращения кости, полученной путем добавления материала, стимулирующего образование костной ткани и сращение кости, к смеси триполифосфата и водорастворимого хитозана. Композиция по настоящему изобретению может стимулировать образование костной ткани и сращение кости на ранней стадии.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Фиг.1 представляет собой фотографию, на которой показано проведение вертикальной остеотомии на левой челюсти собаки с целью вытяжения кости с применением хитозана, β ig-h3 и костного морфогенного белка человека (BMP-4).
Фиг.2 представляет собой фотографию, на которой показан сдвоенный шприц, содержащий водорастворимый хитозан, содержащий β ig-h3 водорастворимый хитозан, содержащий BMP-4 водорастворимый хитозан и 5% триполифосфат. При этом в отсеке A шприца содержится 0,5 см3 водорастворимого хитозана, содержащего β ig-h3 водорастворимого хитозана или содержащего BMP-4 водорастворимого хитозана, а в отсеке B шприца содержится 0,5 см3 5% триполифосфата.
Фиг.3 представляет собой фотографию, на которой показана собака перед умерщвлением через 7 недель после вытяжения кости.
Фиг.4a представляет собой фотографию, на которой показана оцененная при помощи рентгенографического исследования степень сращения кости в контрольной группе через 5 недель после вытяжения кости, в частности, контрольную группу обрабатывали только триполифосфатом с проведением вытяжения кости на 2,0 мм в сутки в течение 5 суток.
Фиг.4b представляет собой фотографию, на которой показана оцененная при помощи рентгенографического исследования степень сращения кости в контрольной группе через 7 недель после вытяжения кости, в частности, контрольную группу обрабатывали только триполифосфатом с проведением вытяжения кости на 2,0 мм в сутки в течение 5 суток.
Фиг.5a представляет собой фотографию, на которой показана оцененная при помощи рентгенографического исследования степень сращения кости в получавшей хитозан группе через 4 недели после вытяжения кости, в частности, группу обрабатывали хитозаном и триполифосфатом с проведением вытяжения кости на 2,0 мм в сутки в течение 5 суток.
Фиг.5b представляет собой фотографию, на которой показана оцененная при помощи рентгенографического исследования степень сращения кости в получавшей хитозан группе через 7 недель после вытяжения кости, в частности, группу обрабатывали хитозаном и триполифосфатом с проведением вытяжения кости на 2,0 мм в сутки в течение 5 суток.
Фиг.6a представляет собой фотографию, на которой показана оцененная при помощи рентгенографического исследования степень сращения кости в получавшей β ig-h3 группе через 4 недели после вытяжения кости, в частности, группу обрабатывали содержащим β ig-h3 водорастворимым хитозаном и триполифосфатом с проведением вытяжения кости на 2,0 мм в сутки в течение 5 суток.
Фиг.6b представляет собой фотографию, на которой показана оцененная при помощи рентгенографического исследования степень сращения кости в получавшей β ig-h3 группе через 7 недель после вытяжения кости, в частности, группу обрабатывали содержащим β ig-h3 водорастворимым хитозаном и триполифосфатом с проведением вытяжения кости на 2,0 мм в сутки в течение 5 суток.
Фиг.7a представляет собой фотографию, на которой показана оцененная при помощи рентгенографического исследования степень сращения кости в получавшей BMP-4 группе через 4 недели после вытяжения кости, в частности, группу обрабатывали содержащим BMP-4 водорастворимым хитозаном и триполифосфатом с проведением вытяжения кости на 2,0 мм в сутки в течение 5 суток.
Фиг.7b представляет собой фотографию, на которой показана оцененная при помощи рентгенографического исследования степень сращения кости в получавшей BMP-4 группе через 7 недель после вытяжения кости, в частности, группу обрабатывали содержащим BMP-4 водорастворимым хитозаном и триполифосфатом с проведением вытяжения кости на 2,0 мм в сутки в течение 5 суток.
Фиг.8a представляет собой график, на котором показаны измеренные через 4 недели после вытяжения кости значения минеральной плотности кости для каждой группы, получавшей только хитозан, содержащий β ig-h3 водорастворимый хитозан и содержащий BMP-4 водорастворимый хитозан, соответственно, с проведением вытяжения кости на 2,0 мм в сутки в течение 5 суток.
Фиг.8b представляет собой график, на котором показаны измеренные через 7 недель после вытяжения кости значения минеральной плотности кости для каждой группы, получавшей только хитозан, содержащий β ig-h3 водорастворимый хитозан и содержащий BMP-4 водорастворимый хитозан, соответственно, с проведением вытяжения кости на 2,0 мм в сутки в течение 5 суток.
Фиг.9a представляет собой фотографию, на которой показан гистологический срез в контрольной группе через 4 недели после вытяжения кости, в частности, группу обрабатывали только триполифосфатом с проведением вытяжения кости на 2,0 мм в сутки в течение 5 суток (стрелки-указатели: первичные разрезанные части кости).
Фиг.9b представляет собой фотографию, на которой показан гистологический срез в контрольной группе через 7 недель после вытяжения кости, в частности, группу обрабатывали только триполифосфатом с проведением вытяжения кости на 2,0 мм в сутки в течение 5 суток (стрелки-указатели: первичные разрезанные части кости).
Фиг.9с представляет собой фотографию, на которой в контрольной группе, которую обрабатывали только триполифосфатом с проведением вытяжения кости на 2,0 мм в сутки в течение 5 суток, показано образование костной ткани на краю участка вытяжения кости, подтвержденное при помощи окрашивания гематоксилином&эозином (A: фиброзная ткань, B: остеобласты).
Фиг.10a представляет собой фотографию, на которой показан гистологический срез в получавшей BMP-4 группе через 4 недели после вытяжения кости, в частности, группу обрабатывали содержащим BMP-4 водорастворимым хитозаном и триполифосфатом с проведением вытяжения кости на 2,0 мм в сутки в течение 5 суток (стрелки-указатели: первичные разрезанные части кости).
Фиг.10b представляет собой фотографию, на которой показан гистологический срез в получавшей BMP-4 группе через 7 недель после вытяжения кости, в частности, группу обрабатывали содержащим BMP-4 водорастворимым хитозаном и триполифосфатом с проведением вытяжения кости на 2,0 мм в сутки в течение 5 суток (стрелки-указатели: первичные разрезанные части кости).
Фиг.10c представляет собой фотографию, на которой показано, что центр участка вытяжения кости заполнен остеобластами и фиброзной тканью, что подтверждается при помощи окрашивания гематоксилином&эозином гистологического среза A.
Фиг.10d представляет собой фотографию, на которой показано, что центр участка вытяжения кости заполнен остеобластами и фиброзной тканью, что подтверждается при помощи окрашивания гематоксилином&эозином гистологического среза B.
Фиг.11a представляет собой фотографию, на которой показан гистологический срез в получавшей β ig-h3 группе через 4 недели после вытяжения кости, в частности, группу обрабатывали содержащим β ig-h3 водорастворимым хитозаном и триполифосфатом с проведением вытяжения кости на 2,0 мм в сутки в течение 5 суток (стрелки-указатели: первичные разрезанные части кости).
Фиг.11b представляет собой фотографию, на которой показан гистологический срез в получавшей β ig-h3 группе через 7 недель после вытяжения кости, в частности, группу обрабатывали содержащим β ig-h3 водорастворимым хитозаном и триполифосфатом с проведением вытяжения кости на 2,0 мм в сутки в течение 5 суток (стрелки-указатели: первичные разрезанные части кости).
Фиг.11c представляет собой фотографию, на которой показано образование костной ткани на всем протяжении участка вытяжения, что подтверждается при помощи окрашивания гематоксилином&эозином гистологического среза B.
Фиг.12a представляет собой фотографию, на которой показан гистологический срез в получавшей хитозан группе через 4 недели после вытяжения кости, в частности, группу обрабатывали хитозаном и триполифосфатом с проведением вытяжения кости на 2,0 мм в сутки в течение 5 суток (стрелки-указатели: первичные разрезанные части кости).
Фиг.12b представляет собой фотографию, на которой показан гистологический срез в получавшей хитозан группе через 7 недель после вытяжения кости, в частности, группу обрабатывали хитозаном и триполифосфатом с проведением вытяжения кости на 2,0 мм в сутки в течение 5 суток (стрелки-указатели: первичные разрезанные части кости).
Фиг.12c представляет собой фотографию, на которой показано образование костной ткани на всем протяжении участка вытяжения, что подтверждается при помощи окрашивания гематоксилином&эозином гистологического среза A.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Для достижения указанной выше цели настоящее изобретение обеспечивает композицию для стимуляции образования костной ткани и сращения кости, полученную путем добавления материала, стимулирующего образование костной ткани и сращение кости, к смеси триполифосфата и водорастворимого хитозана.
Настоящее изобретение также относится к применению указанной композиции для стимуляции образования костной ткани и сращения кости на ранней фазе.
Дополнительные признаки настоящего изобретения будут рассмотрены далее в этом документе.
Настоящее изобретение относится к композиции для стимуляции образования костной ткани и сращения кости, полученной путем добавления материала, стимулирующего образование костной ткани и сращение кости, к смеси триполифосфата и водорастворимого хитозана.
Композиции по настоящему изобретению для стимуляции образования костной ткани и сращения кости получают путем добавления материала, стимулирующего образование костной ткани и сращение кости, к смеси триполифосфата и водорастворимого хитозана. Примеры материала, стимулирующего образование костной ткани и сращение кости, представляют собой β ig-h3, костный морфогенный белок, TGF-β, FGF, IGF-1 и PDGF, но не ограничиваются ими. В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения в качестве материалов, стимулирующих образование костной ткани и сращение кости, применяют β ig-h3 и BMP-4.
Хитозан представляет собой полисахарид, полученный путем деацетилирования хитина, структурного материала экзоскелета морских Crustacea (Kind, G.M., Bind, S.D., Staren, E.D., Templeton, A.J. and Economou, S.G., Curr. Surg., 47: 37, 1990; Hauschks, P.V., Bone, Vol. 1, 103, 1990, London CRC press; Cunningham, N.S., Paralkar, V. and Reddi, A.H., Proc. Nat. Acad. Sci., 89: 11740, 1982; Malette, W.G., Quigley, H.J. and Adickes, E.D., Nature and Technology, 435: 1986, New York Plenum Press). Muzzarelli и соавторы обнаружили, что введенный в участки с недоразвитием кости хитозан стимулирует нормальное образование костной ткани (Muzzarelli, R.A., Mattioli-Belmonte, M., Tiets, C., Biagini, R., Feioli, G., Brunelli, M.A., Fini, M., Giardino, R., Ilari, P. and Biagini, G., Biomaterials, 15: 1075, 1994), а Klokkevold и соавторами также сообщалось о том, что хитозан стимулирует дифференцировку костных остеобластов и сам по себе стимулирует образование костной ткани (Klokkevold, P.R., Vandemark, L., Kenney, E.B. and Bernard, G.W., J. Periodontol., 67: 1170, 1996).
Известно, что TGF-β индуцирует пролиферацию и дифференцировку остеобластов, в особенности считается, что β ig-h3 стимулирует продукцию различных костных внутриклеточных белков in vitro и снижает разрушение коллагена в остеобластах (Sporn, M.B., Roberts A.B., Springer-Verlag, New York: 3, 1990; Centrella, M., McCarthy, T.L. and Canalis, E., J. Bone Join. Surg., 73(Am): 1418, 1991; Mustoe, T.A., Pierce, G.F., Thomason, A., Gramates, P., Sporn, M.B. and Deuel, T.F., Science, 237: 1333, 1987; Noda, M. and Camilliere, J.J., Endocrinol., 124: 2991, 1989; Joyce, M.E., Jinguski, S., Roberts, A.B., Sporn, M.B. and Bolander, M.E., J. Bone Miner. Res., 4: 225, 1989; Hock, J.M., Canalis, E. and Centrella, M., Endocrinol., 126: 421, 1990; Beck, L.S., Ammann, A.J., Aufdemorte, T.B., DeGuzman, L., Xu, Y., Lee, W.P., McFatridge, L.A. and Chen, T.L., J. Bone Miner. Res., 6: 961, 1991). Среди многих факторов роста трансформирующий фактор роста β (TGF-β) является особо важным регулятором восстановления и развития кости. TGF-β 1 является сильным хемоаттрактантом остеобластов и регулирует деление клеток-предшественников остеобластов в ходе процесса эндохондрального окостенения. Применяемый в качестве клеточного белка-аттрактанта белок β ig-h3, экспрессия которого индуцируется TGF-β, обладает способностью привлекать клетки и способствовать их распространению путем взаимодействия с интегринами (Jung-Eun Kim, Song-Ja Kim, Byung-Heon Lee, Rang-Woon Park, Ki-San Kim and In-San Kim, J. Biol. Chem., 275: 30907-30915, 2000), а также излечивать порезы. Известно, что он также играет важную роль на ранней фазе остеогенеза (Dieudonne, S.C., Kerr, J.M., Xu, T., Sommer B., DeRubeis, A.R., Kuznetsov, S.A., Kim, I-S., Robey, P.G., and Young M.F., J. Cell. Biochem., 76: 231-243, 1999).
Впервые обнаруженный Urist костный морфогенный белок (обозначаемый в этом документе как "BMP") представляет собой костеобразующий материал. Сообщалось, что BMP стимулирует дифференцировку плюрипотентных клеток в хондроциты и остеобласты, а также играет важную роль в восстановлении кости (Urist, M.R., Science, 150: 893, 1965; Urist, M.R. and Strates, B.S., J. Dent. Res., 50: 1392, 1971; Wozney, J.M., Butterworth Heinermann 1st Ed. London: 397-411, 1994; Wozney, J.M., Mol. Reprod. Dev., 32; 160, 1992; Wozney, J.M., Rosen, V. and Celeste, A.J., Science, 242: 1528, 1988; Ono, I., Tatashita, T., Takita, H. and Kuboki, Y., J. Craniofac. Surg., 7: 418, 1996). К настоящему времени известны 13 BMP человека, и сообщалось, что костный морфогенный белок 4 (BMP-4) человека обладает особенно заметным положительным эффектом на восстановление кости (Boyne, P.J., Bone, 19: 83s, 1996; Zegzula, H.D., Buck, D.C., Brekke, J., Wozney, J.M. and Hollinger, J.O., J. Bone Join. Surg., 79: 1778, 1997; Sporn, M.B., Roberts AB (eds.), Springer-Verlag, New York: 3, 1990).
Триполифосфат немедленно застывает при добавлении к нему водорастворимого хитозана. Поэтому, в соответствии с настоящим изобретением, для немедленного затвердевания в месте введения, препятствующего распространению вводимых материалов в другие участки, хитозан, содержащий β ig-h3 водорастворимый хитозан, стимулирующий образование костной ткани и сращение кости материал или костный морфогенный белок требуется вводить в то же самое место с применением сдвоенного шприца, показанного на фигуре 2.
Для получения стимулирующей образование костной ткани и сращение кости композиции по настоящему изобретению, применяемый в качестве стимулирующего образование костной ткани и сращение кости материала белок β ig-h3 или костный морфогенный белок добавляют к смеси триполифосфата и водорастворимого хитозана, причем триполифосфат и водорастворимый хитозан предпочтительно смешивают в отношении 20:80-80:20 мас.%, и более предпочтительно в отношении 50:50. Применяемый в качестве материала, стимулирующего образование костной ткани и сращение кости, белок β ig-h3 предпочтительно добавляют к композиции в количестве 100 мкг/мл - 1 мг/мл, и более предпочтительно в количестве 300 мкг/мл - 600 мкг/мл. BMP также предпочтительно добавляют к композиции в количестве 50 нг/мл - 500 нг/мл, и более предпочтительно в количестве 100 нг/мл - 300 нг/мл.
Настоящее изобретение также относится к применению композиции по настоящему изобретению для стимуляции образования костной ткани и сращения кости на ранней стадии.
Для проверки того, может ли композиция по настоящему изобретению применяться для стимуляции образования костной ткани и сращения кости, авторы настоящего изобретения исследовали действие композиции, полученной путем добавления к триполифосфату водорастворимого хитозана, содержащего β ig-h3 водорастворимого хитозана или содержащего BMP водорастворимого хитозана, на образование костной ткани и сращение кости путем проведения операции вытяжения кости на челюсти собаки.
В контрольной группе проведенные через 4 недели и 7 недель исследования образца кости показали, что участок вытяжения был твердым, но слегка гнулся при сгибании. Было доказано, что в получавшей BMP-4 группе, полученной путем добавления к триполифосфату содержащего BMP-4 водорастворимого хитозана, в получавшей β ig-h3 группе, полученной путем добавления к триполифосфату содержащего β ig-h3 водорастворимого хитозана, и в получавшей хитозан группе, полученной путем добавления к триполифосфату только водорастворимого хитозана, участок вытяжения в образцах кости через 4 недели после вытяжения кости был более твердым, чем в контрольной группе через 7 недель после вытяжения кости. Через 7 недель после вытяжения в этих группах формировались новые кости, и участки вытяжения становились очень твердыми.
Через 4 недели и через 7 недель после вытяжения кости в контрольной группе проводили рентгенографическое исследование. В результате было показано, что между подвергнутыми вытяжению разрезанными частями челюстной кости образуется широкая рентгенопрозрачная зона, а в примыкающей к ним ткани едва образуется рентгеноконтрастная зона. Результат, полученный в контрольной группе через 4 недели после вытяжения кости, заметно не отличался от результата, полученного через 7 недель после вытяжения кости. В то же время, при введении способствующих росту кости материалов в получавшей BMP-4 группе, в получавшей β ig-h3 группе и в получавшей хитозан группе в участке вытяжения челюстной кости ясно наблюдалась кальцификация. Через 4 недели после введения способствующих росту кости материалов в результате рентгенографического исследования было подтверждено, что рентгенопрозрачная зона между подвергнутыми вытяжению разрезанными частями челюстной кости практически соединилась с рентгеноконтрастной зоной вокруг обеих сторон разрезанных частей челюстной кости. По сравнению с исследованиями, проведенными через 4 недели после вытяжения кости, через 7 недель толщина рентгеноконтрастной зоны увеличилась по высоте более чем в два раза. По сравнению с другими группами более темное рентгеноконтрастное затемнение и более плотную рентгеноконтрастную зону наблюдали в получавшей BMP-4 группе (см. фиг.4-7).
Кроме того, по сравнению с контрольной группой в каждой экспериментальной группе была отмечена более высокая минеральная плотность кости. Наибольшая минеральная плотность кости была отмечена в получавшей BMP-4 группе, после которой в порядке убывания шли получавшая β ig-h3 группа, получавшая хитозан группа и контрольная группа. Минеральная плотность кости отражает степень рентгеноконтрастности в участке вытяжения между разрезанными частями челюстной кости, при этом подразумевается, что чем выше плотность, тем эффективнее идет процесс формирования новой кости (см. фиг.8).
Также проводили гистологическое исследование. В результате обнаружено, что в контрольной группе через 4 недели после вытяжения весь участок вытяжения кости заполнен фиброзной тканью. Хотя формирование новой кости вблизи разреза челюстной кости начиналось путем реакции надкостницы, общего образования костной ткани обнаружено не было (см. фиг.9a). Однако через 7 недель рядом с краем участка вытяжения было обнаружено образование костной ткани и образование хряща, а во многих местах также были обнаружены кровеносные сосуды и нервная ткань (см. фиг.9b и 9c).
В получавшей BMP-4 группе, через 4 недели пролиферация образующих остеоид остеобластов частично наблюдалась в центре и по краям подвергаемых вытяжению разрезанных участков, но большая часть участка вытяжения была заполнена фиброзными тканями (см. фиг.10a и 10c). Через 7 недель в участке вытяжения трабекулы перепончатой ретикулофиброзной кости, имеющие неправильную форму, были частично кальцифицированы, и наблюдалось формирование участка новой кости, в котором была развита сеть кровеносных сосудов разного размера, и узкого фиброзного промежуточного пространства, лежащего посередине. Новая кость, формирующаяся по всему участку вытяжения, была похожа на нормальную трубчатую кость (см. фиг.10b и 10d).
В получавшей β ig-h3 группе образующие остеоид остеобласты частично наблюдались в центре участка вытяжения, что было подтверждено в ходе гистологического исследования через 4 недели после вытяжения кости (см. фиг.11a). Через 7 недель большое количество остеобластов формировали новую кость по направлению от края к центру участка вытяжения. Величина вновь формирующейся кости была меньше, чем в получавшей BMP-4 группе, но расположенное в центре участка вытяжения фиброзное промежуточное пространство было шире, чем в получавшей BMP-4 группе (см. фиг.11b и 11c).
В получавшей хитозан группе проведенное через 4 недели гистологическое исследование подтвердило тот факт, что большая часть участка вытяжения заполнена фиброзными тканями (см. фиг.12a). Через 7 недель вместе с новой костью по краю участка вытяжения наблюдалось множество остеобластов, и было подтверждено формирование новых костей по направлению от края к центру участка вытяжения (см. фиг.12b и 12c). Величина вновь формирующейся кости была меньше, чем в получавшей β ig-h3 группе или в получавшей BMP-4 группе, но фиброзное промежуточное пространство было шире, чем в получавшей β ig-h3 группе.
В итоге, композиция по настоящему изобретению, полученная путем добавления к триполифосфату водорастворимого хитозана, содержащего β ig-h3 водорастворимого хитозана и содержащего BMP-4 водорастворимого хитозана, может эффективно применяться для стимуляции образования костной ткани и сращения кости посредством стимуляции на ранней фазе и сокращения периода сращения кости.
ПРИМЕРЫ
Практические и предпочтительные в настоящее время варианты осуществления настоящего изобретения приведены с целью иллюстрации.
Однако следует принимать во внимание, что на основании раскрытия настоящего изобретения специалист в данной области техники может вносить изменения и усовершенствования, не выходя за пределы существа и объема настоящего изобретения.
Пример 1: Получение композиции
Авторы настоящего изобретения получали композицию для стимуляции образования костной ткани и сращения кости посредством добавления к триполифосфату материала, стимулирующего образования костной ткани и сращения кости. Конкретно, авторы настоящего изобретения получали композицию посредством добавления 0,5 мл 5% хитозана к 0,5 мл 5% триполифосфата и называли ее «группа, получавшая хитозан».
Пример 2: Получение композиции
Авторы настоящего изобретения получали композицию для стимуляции образования костной ткани и сращения кости посредством добавления 0,5 мл водорастворимого хитозана, содержащего β ig-h3 в концентрации 450 мкг/мл, к 0,5 мл 5% триполифосфата в соответствии с описанным выше в примере 1 способом, и называли ее «группа, получавшая β ig-h3».
Пример 3: Получение композиции
Авторы настоящего изобретения получали композицию для стимуляции образования костной ткани и сращения кости посредством добавления 0,5 мл водорастворимого хитозана, содержащего BMP-4 в концентрации 200 нг/мл, к 0,5 мл 5% триполифосфата в соответствии с описанным выше в примере 1 способом, и называли ее «группа, получавшая BMP-4».
Экспериментальный пример 1: Исследование действия композиций по настоящему изобретению на образование костной ткани и сращение кости
Для проверки того, могут ли композиции для стимуляции образования костной ткани и сращения кости, полученные в соответствии с примерами 1-3 по настоящему изобретению, стимулировать образование костной ткани и сращение кости на ранней фазе, авторы настоящего изобретения сначала произвели операцию по вытяжению кости на челюстной кости собак с последующим введением композиций для стимуляции образования костной ткани и сращения кости и наблюдением за происходящими изменениями.
Конкретно, для экспериментов использовали 16 собак в возрасте 5-8 месяцев, разделив их на 4 группы по 4 собаки в каждой группе, получив контрольную группу, группу, получавшую хитозан, группу, получавшую β ig-h3, и группу, получавшую BMP-4.
После общей анестезии и выбривания операционного поля с последующей стерилизацией, дыхание собаки поддерживали при помощи введенных в легкие трубок. Производили разрез кожи длиной 3-4 см вдоль нижнего края челюстной кости, приподнимали жевательную мышцу и выделяли нижнюю часть челюстной кости. Затем проводили с применением электропилы вертикальную остеотомию на центральной части нижней челюсти и полностью перерезали челюстную кость. На разрезанной части в 1 см справа и слева от зоны разреза закрепляли штифты внешнего фиксатора. В процессе закрепления штифтов на челюстной кости при помощи дрели участок крепления промывали солевым раствором во избежание пережога участков крепления. Штифты вводили на глубину, при которой они едва проходили через челюстную кость, а затем накрепко их фиксировали. После закрепления двух штифтов их подсоединяли к аппарату для вытяжения кости (Molina Distractors, Wells Johnson Company) (фиг.1).
На область разреза накладывали швы 5-0 викрилом и 5-0 нейлоном слой поверх слоя и выводили собаку из состояния анестезии. Каждые 12 часов в течение 7 суток после операции вводили пенициллин путем внутримышечной инъекции (100000 мкг/кг), а для обезболивания каждые 4-6 часов перорально вводили анодин. В течение двух суток после операции собаку кормили мягкой пищей, а на третьи сутки обеспечивали обычным питанием. На пятые сутки после операции начинали выполнять вытяжение кости на 2 мм в сутки в течение 5 суток (всего до 10 мм).
В день окончания вытяжения кости для формирования новой крепкой кости группам вводили 5% водорастворимый хитозан, 5% содержащий BMP-4 водорастворимый хитозан (200 нг/мл) (R&D System Inc.) и 5% содержащий β ig-h3 водорастворимый хитозан (450 мкг/мл) в том же самом количестве, что и 0,5 мл 5% триполифосфата (TPP); для каждой группы с целью немедленного затвердевания при смешивании данных материалов введение осуществляли одновременно с применением сдвоенного шприца (фиг.2), что препятствовало распространению вводимых материалов в другие участки. Наоборот, в контрольной группе вводили только 1 мл 5% триполифосфата.
После окончания введения собакам композиций по настоящему изобретению, стимулирующих образование костной ткани и сращение кости, аппарат для вытяжения кости сохраняли на собаках в течение 7 недель для сращения и восстановления кости. Через 4 недели после вытяжения кости по 2 собаки из каждой группы умерщвляли путем инъекции сверхдозы фенобарбитала (40-50 мг/кг), а оставшиеся 8 собак умерщвляли через 7 недель после вытяжения кости (фиг.3).
<1-1> Наблюдения невооруженным глазом
Изменения после проведенных выше экспериментов были заметны невооруженным глазом. Все собаки хорошо оправились после анестезии и хирургической операции, аппарат для вытяжения кости был закреплен надежно, а вокруг аппарата не наблюдалось признаков инфекции. Исследование образцов кости, отобранных через 4 недели и через 7 недель после вытяжения кости, подтвердило тот факт, что в контрольной группе участок вытяжения кости становился тверже, но слегка гнулся при сгибании. Между тем, участки вытяжения кости в исследованных через 4 недели группе, получавшей BMP-4, группе, получавшей β ig-h3, и группе, получавшей хитозан, были тверже, чем участки вытяжения кости в исследованной через 7 недель контрольной группе, и через 7 недель во всех группах, за исключением контрольной группы, было отмечено формирование очень жесткой и твердой новой кости.
<1-2> Рентгенографическое исследование
Рентгенографическое исследование каждой группы животных с проведенной операцией вытяжения кости проводили еженедельно, и через 4 недели и через 7 недель на рентгенограммах было отмечено образование костной ткани и сращение кости, соответственно.
В результате в контрольной группе широкая рентгенопрозрачная зона между подвергнутыми вытяжению разрезанными частями челюстной кости наблюдалась как через 4 недели, так и через 7 недель после завершения вытяжения кости, тогда как прилегающая с обеих сторон к разрезанным частям челюстной кости рентгеноконтрастная зона была едва видна через 4 недели после вытяжения кости, и через 7 недель после вытяжения кости картина не претерпевала изменений. Между тем, со временем в каждой группе, получавшей BMP-4, получавшей β ig-h3 и получавшей хитозан, в которых животным вводили соответствующий материал для стимуляции роста кости, в участке вытяжения челюстной кости наблюдалась кальцификация. В этих группах рентгенопрозрачная зона между подвергнутыми вытяжению разрезанными частями кости почти соединялась с прилегающей с обеих сторон к разрезанным частям кости рентгеноконтрастной зоной, что было подтверждено на полученных на 4 неделе рентгенограммах. На 7 неделе плотность рентгеноконтрастной зоны становилась в два раза большей по сравнению с таковой, исследованной на 4 неделе. По сравнению с другими группами особо более темное и более плотное рентгеноконтрастное затемнение наблюдали в группе, получавшей BMP-4.
<1-3> Измерение минеральной плотности кости
На основании рентгенограмм (фиг.4b, 5b, 6b и 7b), полученных на 7 неделе в приведенных выше примерах <1-2>, авторы настоящего изобретения при помощи компьютерной программы измеряли минеральную плотность кости, используя тот факт, что в процессе образования костной ткани рентгеноконтрастная зона на рентгенограмме становится ярче.
В результате показано, что на 4 неделе минеральная плотность кости в исследованных группах была выше, чем в контрольной группе. Наибольшая минеральная плотность кости была обнаружена в группе, получавшей BMP-4, после которой в порядке убывания шли группа, получавшая β ig-h3, группа, получавшая хитозан, и контрольная группа (фиг.8a). На 7 неделе удивительно высокая минеральная плотность кости по сравнению с другими группами все еще наблюдалась в группе, получавшей BMP-4, после которой в порядке убывания шли группа, получавшая β ig-h3, группа, получавшая хитозан, и контрольная группа (фиг.8b). Минеральная плотность кости отражает яркость рентгенограммы, другими словами степень рентгеноконтрастности в участке вытяжения между разрезанными частями челюстной кости. Поэтому, чем выше плотность, тем эффективнее идет процесс формирования новой кости. В результате было подтверждено, что в группах, которым вводили стимулирующие образование костной ткани и сращение кости композиции, образование костной ткани шло быстрее и лучше, чем в контрольной группе.
<1-4> Гистологическое исследование
Образцы кости отбирали при помощи электрической пилы из подвергнутой вытяжению челюстной кости, включая прилегающие нормальные костные ткани. Полученные разрезанные части кости подвергали фиксации 10% нейтральным формалином в течение 1 недели, а затем декальцинировали в 10% азотной кислоте и 10% цитрате натрия в течение 2 суток. Пробы весом 4-6 г получали путем дегидратации и фиксации парафином, следуя обычным методикам. Пробы окрашивали гематоксилином&эозином для наблюдения гистологических изменений с применением светового микроскопа.
В результате в контрольной группе обнаружено, что на 4 неделю после вытяжения кости весь участок вытяжения кости заполнен фиброзной тканью, а общее образование костной ткани не происходит, несмотря на то, что вблизи разреза челюстной кости начиналось формирование новой кости путем реакции надкостницы (см. фиг.9a). По краю участка вытяжения происходило образование костной ткани и образование хряща, а во многих местах также были обнаружены кровеносные сосуды и нервная ткань (см. фиг.9b и 9c).
В группе, получавшей BMP-4, на 4 неделю большая часть участка вытяжения была заполнена фиброзными тканями, хотя в центре и по краям подвергаемых вытяжению разрезанных частей кости частично наблюдалась пролиферация образующих остеоид остеобластов (см. фиг.10a и 10c). На 7 неделю наблюдалось формирование широкого участка новой кости с трабекулами перепончатой ретикулофиброзной кости, имеющими неправильную форму вследствие частичной кальцифицикации, с развитой сетью кровеносных сосудов разного размера и с узким фиброзным промежуточным пространством, расположенным сверху и снизу от центра формирования новой кости. Новая кость, формирующаяся по всему участку вытяжения, была похожа на нормальную трубчатую кость (фиг.10b и 10d).
В группе, получавшей β ig-h3, на 4 неделю в центре участка вытяжения наблюдалась частичная пролиферация образующих остеоид остеобластов (фиг.11a). На 7 неделе большое количество остеобластов формировали новую кость по направлению от края к центру участка вытяжения кости, но величина вновь формирующейся кости была меньше, чем в группе, получавшей BMP-4. Однако расположенное сверху и снизу от центра участка вытяжения фиброзное промежуточное пространство было шире, чем в группе, получавшей BMP-4 (фиг.11b и 11c).
В группе, получавшей хитозан, на 4 неделю большая часть участка вытяжения была заполнена фиброзными тканями (фиг.12a). На 7 неделю вместе с новой костью по краю участка вытяжения наблюдалось множество остеобластов, и по направлению от края к центру участка вытяжения было отмечено формирование новой кости. Объем вновь формирующейся кости был меньше, чем в группе, получавшей β ig-h3, или в группе, получавшей BMP-4, но фиброзное промежуточное пространство было шире, чем в группе, получавшей β ig-h3 (фиг.12b и 12c).
Таким образом, в получавшей BMP-4, в получавшей β ig-h3 группе и в получавшей хитозан группе, которую обрабатывали композицией по настоящему изобретению для стимуляции образования костной ткани и сращения кости, на 4 неделю после вытяжения кости происходило частичное формирование новой кости в участке вытяжения, которое продолжалось на 7 неделе. Объем вновь формирующейся кости был наибольшим в группе, получавшей BMP-4, после которой в порядке убывания шли группа, получавшая β ig-h3, и группа, получавшая хитозан. В каждой группе на 7 неделю в центре участка вытяжения было обнаружено фиброзное промежуточное пространство. Фиброзное промежуточное пространство было наиболее узким в группе, получавшей BMP-4, после которой в порядке убывания шли группа, получавшая β ig-h3, и группа, получавшая хитозан. Между тем, в контрольной группе фиброзное промежуточное пространство занимало большую часть участка вытяжения. Наблюдаемое на 7 неделю фиброзное промежуточное пространство подтверждает тот факт, что формирование новой кости все еще продолжается.
ПРИМЕНИМОСТЬ В ПРОМЫШЛЕННЫХ УСЛОВИЯХ
Композиция по настоящему изобретению, полученная путем добавления материала для стимуляции образования костной ткани и сращения кости к смеси триполифосфата и водорастворимого хитозана, может эффективно применяться для стимуляции образования костной ткани и сращения кости. А именно, композиция индуцирует формирование новой кости, обеспечивает нормальную структуру кости, предотвращает рост нежелательных соединительных тканей и в достаточной мере пригодна для восполнения потери костной массы в процессе восстановления, а также индуцирует рост кровеносных сосудов и развитие костных остеобластов на ранней стадии.
1. Композиция для стимуляции образования костной ткани и сращения кости, содержащая триполифосфат и водорастворимый хитозан.
2. Композиция для стимуляции образования костной ткани и сращения кости по п.1, которая может дополнительно содержать материал для стимуляции образования костной ткани и сращения кости, причем материал для стимуляции образования костной ткани и сращения кости выбирают из группы, состоящей из βig-h3, костного морфогенного белка, TGF-β, FGF, IGF-1 и PDGF.
3. Композиция для стимуляции образования костной ткани и сращения кости по п.1, в которой отношение триполифосфата к водорастворимому хитозану составляет 20:80-80:20 мас.%.
4. Композиция для стимуляции образования костной ткани и сращения кости по п.3, в которой отношение триполифосфата к водорастворимому хитозану составляет 50:50 мас.%.
5. Композиция для стимуляции образования костной ткани и сращения кости по п.2, в которой βig-h3 добавляют в концентрации 100 мкг/мл - 1 мг/мл.
6. Композиция для стимуляции образования костной ткани и сращения кости по п.2, в которой костный морфогенный белок добавляют в концентрации 50 - 500 нг/мл.
7. Композиция для стимуляции образования костной ткани и сращения кости по п.5, в которой βig-h3 добавляют в концентрации 300 - 600 мкг/мл.
8. Композиция для стимуляции образования костной ткани и сращения кости по п.6, в которой костный морфогенный белок добавляют в концентрации 100 - 300 нг/мл.
9. Композиция для стимуляции образования костной ткани и сращения кости по п.2, в которой костный морфогенный белок представляет собой ВМР-4.
