Конъюгат, обладающий избирательным действием по отношению к раковым опухолям

Изобретение относится к фармакологии и может быть использовано в качестве противоракового лекарственного средства направленного действия. Изобретение заключается в создании конъюгата с широким спектром действия, обладающего избирательностью и специфичностью антиангиогенных агентов в сочетании с высокой эффективностью цитотоксических препаратов, за счет использования конъюгата, содержащего полипептид, ковалентно присоединенный к молекуле цитотоксического химического препарата через кислотолабильную связь с помощью сшивающего агента. В качестве полипептида используют эндостатин или ангиостатин или их биологически активные укороченные фрагменты, а цитотоксический химический препарат в своей структуре имеет как минимум одну реакционноспособную аминогруппу, и сшивающий агент выбран из группы диальдегидов, при этом соотношение полипетида к цитотоксическому препарату равно 1:(1-3). Данное изобретение обеспечивает высокую противораковую активность в отношении раковых клеток различных линий и в отношении эндотелиальных клеток. 1 з.п. ф-лы, 3 табл.

 

Изобретение относится к фармакологии, а именно к принципиально новым противораковым лекарственным средствам направленного действия.

Предпосылки изобретения.

Одним из ключевых достижений науки XX века в области борьбы со злокачественными заболеваниями является доказательство необходимости процесса ангиогенеза для роста злокачественных солидных опухолей, а также создание концепции противоопухолевой терапии, основанной на подавлении ангиогенеза, разработанной Дж. Фолкманом [Folkman J., Angiogenesis in cancer, vascular, rheumatoid and other disease. Nat. Med., 1:27-31, 1995].

Ангиогенез - процесс роста капилляров из кровеносных сосудов, в результате чего образуются новые сосудистые сети. В здоровом организме взрослого человека ангиогенез не встречается в большинстве органов и тканей, или его интенсивность пренебрежимо мала, кроме процессов тканевой регенерации, а также образования желтого тела, эндометрия и плаценты. Однако при экспрессии опухолью факторов роста эндотелиальные клетки сосудов, находящиеся в покоящемся состоянии, пролиферируют, мигрируют и образовывают новые кровеносные сосуды. При этом патологический рост новых сосудов обуславливает прогрессию многих заболеваний, прежде всего рост и метастазирование солидных опухолей [Carmeliet P. and Jain R.K. Angiogenesis in cancer and other diseases. Nature, 407:249-257, 2000].

При нормальных физиологических условиях интенсивность ангиогенеза зависит не только от уровня экспрессии факторов роста, но и от уровня экспрессии ингибиторов ангиогенеза. Низкая интенсивность ангиогенеза обеспечивается паритетом в экспрессии как факторов роста, стимулирующих ангиогенез, так и ингибиторов последнего. Среди специфических ингибиторов ангиогенеза, воздействующих на пролиферирующие эндотелиальные клетки сосудов, одним из самых мощных является ангиостатин - белок с молекулярной массой 38-40 кДа, выделенный М. Орейлли и соавт. [O'Reilly M.S., Holmgren L, et al. Angiostatin: a novel angiogenesis inhibitor that mediates the suppression of metastases by a Lewis lung carcinoma. Cell, 79:315-328, 1994] из крови и сыворотки мышей с солидными опухолями. Еще одним ингибитором ангиогенеза у позвоночных является фрагмент коллагена-18 - эндостатин, белок с молекулярной массой 20-22 кДа [M.S.O'Reilly et al. Endostatin: An endogenous inhibitor of angiogenesis and tumor growth. Cell, 88:277-285, 1997]. Недавно было открыто, что, в свою очередь, различной длины полипептидные фрагменты ангиостатина и эндостатина также обладают антиангиогенными и другими биологическими свойствами, характерными для полноразмерных белков, причем для некоторых фрагментов отмечено даже более высокое значение индекса ингибирования ангиогенеза по сравнению с целостными ингибиторами. Кроме того, подобные фрагменты могут быть получены синтетически, но их искусственное происхождение не ведет к ослаблению антиангиогенной активности [Léger R. et al. Kringle 5 peptide-albumin conjugates with anti-migratory activity. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 14:841-845 (2004); Cattaneo M.G. et al. Human endostatin-derived synthetic peptides possess potent antiangiogenic properties in vitro and in vivo. Exp Cell Res, 283:230-236 (2003)].

Специфически ингибируя ангиогенез, можно проводить терапию злокачественных новообразований. Ряд антиангиогенных препаратов, например ангиостатин, эндостатин, скволамин, 2-метоксиэстрадиол и др., находятся в настоящее время на стадии клинических испытаний в странах Западной Европы и США [Ziche M. et al. Development of new drugs in angiogenesis, Curr Drug Targ, 5:389-406, 2004]. В связи с этим поиск новых ингибиторов ангиогенеза становится важной научно-прикладной задачей современной медицины.

В то же время известно, что традиционная цитотоксическая терапия опухолей отличается высоким уровнем побочных эффектов, связанных со слабой избирательностью действия химиопрепаратов. Антиангиогенная терапия опухолей пока недостаточно эффективна, но препараты, разработанные в рамках этого направления, характеризуются направленностью действия и практическим отсутствием токсичности. Например, часто применяемый в химиотерапии препарат доксорубицин, наряду с другими антрациклиновыми антибиотиками, несмотря на высокую эффективность обладает токсическими дозозависимыми побочными эффектами: кумулятивной кардиотоксичностью, стоматитами, поражениями желудочно-кишечного тракта и др. Все эти эффекты обусловлены отсутствием избирательности действия доксорубицина.

Известны конъюгаты биологически активных веществ с α-фетопротеином, обладающие избирательным действием по отношению к раковым опухолям. Конъюгированные части соединены высокоустойчивой к действию протеаз и других ферментов биологических жидкостей химической связью. К таким связям относятся тиоэфирные (простые эфиры), альдиминные связи, амидные связи (типа амидной связи в капроне) и др. (пат. РФ 2071351). В качестве биологически активных веществ можно использовать цитотоксические препараты, дифтерийные токсины, рицин и др. Транспортным белком в данном конъюгате является α-фетопротеин, не обладающий биологической активностью.

Наиболее близким к предлагаемому (прототип) является техническое решение, представляющее собой конъюгат полипептида с доксорубицином, обладающий избирательным действием в отношении раковых опухолей. Доксорубицин присоединен к полипептиду формулы MYIEALDSYAC через кислотолабильную азометиновую связь с помощью сшивающего агента, в качестве которого выбран глутаровый альдегид (пат. РФ 2196604). Данный пептид не обладает собственной цитотоксической активностью в отношении опухолевых клеток, а лишь выполняет функцию вектора - доставляет активное вещество, например доксорубицин, в раковую опухоль. Недостатком данного конъюгата является узкий спектр действия - возможность его применения для лечения только тех опухолей, клетки которых несут на поверхности рецепторы эпидермального фактора роста, с которыми способен связываться полипептид. Кроме того, лишь один из составляющих компонентов конъюгата - доксорубицин - обладает цитотоксической активностью.

Указанные выше известные конъюгаты сохраняли в полном объеме функциональные свойства исходной части при ее соединении химической связью, высокоустойчивой к действию протеаз и др. ферментов (сыворотки крови, лимфы, внутриклеточного содержимого), цитотоксический эффект проявлялся без высвобождения действующего начала из конъюгата.

Цель данного изобретения - создание конъюгата с широким спектром действия, обладающего избирательностью и специфичностью антиангиогенных агентов в сочетании с высокой эффективностью цитотоксических препаратов.

Поставленная цель достигается за счет использования конъюгата, обладающего избирательным действием по отношению к раковым опухолям, содержащего полипептид, ковалентно присоединенный к молекуле цитотоксического химического препарата через кислотолабильную связь с помощью сшивающего агента. В качестве полипептида используют эндостатин или ангиостатин или их биологически активные укороченные фрагменты, а цитотоксический химический препарат в своей структуре имеет как минимум одну реакционноспособную аминогруппу, и сшивающий агент выбран из группы диальдегидов, при этом соотношение полипетида к цитотоксическому препарату равно 1:(1-3).

Поскольку в зоне локализации опухоли уровень рН в среднем на 1-1,5 единицы ниже, чем в нормальных тканях, кислотолабильная сшивка конъюгата будет гидролизоваться в малигнизированных тканях. Это обеспечивает эффективное высвобождение активных компонентов и проявление ими своего терапевтического потенциала в опухоли, то есть способствует направленному транспорту препаратов. При разрыве сшивки каждый из биологически активных компонентов конъюгата не теряет своей активности. Антиангиогенный компонент препарата будет поражать кровеносные сосуды опухоли, вызывая апоптоз эндотелиальных клеток, что лишает опухоль оксигенации и нутриентов. Цитотоксический компонент, например доксорубицин, векторно доставленный в опухолевые клетки, проявит свое поражающее действие только на злокачественные ткани. Побочные эффекты цитотоксического агента будут сведены до минимума, поскольку в составе конъюгата цитотоксический агент не способен проникнуть в нормальные ткани. Избирательность действия также обеспечивается за счет взаимодействия ангиостатина с интегринами α_vβ₃ и α_vβ₅, гиперэкспрессированными на поверхности опухолевого эндотелия.

Все это позволит добиться резкого снижения системной токсичности цитотоксических препаратов в составе конъюгатов при лечении опухолей эпителиального и мезенхимального происхождения. С получением подобных препаратов открываются возможности применения их в терапии онкологических заболеваний, сопровождающихся несбалансированной неоваскуляризацией, то есть всех типов солидных опухолей.

Пример 1. Получение конъюгата ангиостатина с доксорубицином.

Синтез конъюгата осуществляли следующим образом. Ангиостатин растворяли в 0.01 М фосфатном буфере (рН 7.4) (концентрация 2 мг/мл) и добавляли при перемешивании 100 мкл 25%-ного раствора глутарового альдегида (Sigma) на 1 мл раствора белка. Реакционную смесь инкубировали в течение 30 минут при 4°С.

Доксорубицин растворяли в дистиллированной воде (рН 5.5) до концентрации 3 мг/мл. К реакционной смеси при перемешивании добавляли по каплям доксорубицин, предварительно растворенный в дистиллированной воде (концентрация доксорубицина - 3 мг/мл). Объем добавленного раствора доксорубицина составил 200 мкл. После добавления доксорубицина смесь инкубировали в течение 30 минут при комнатной температуре. Синтезированный конъюгат отделяли от исходных веществ на колонке PD-10 Sephadex G-25 (Pharmacia, Sweden). Конъюгат анализировали методом ОФ ВЭЖХ на колонке Nucleosil C18 250×4.6. Градиентное элюирование конъюгата с колонки проводили в системе растворителей: ацетонитрил /0.1% трифторуксусная кислота/ вода.

Концентрацию ангиостатина в конъюгате определяли спектрофотометрически с использованием бицинхониновой кислоты. Содержание доксорубицина в конъюгате определяли спектрофотометрически при длине волны λ=495 нм. Молярное соотношение ангиостатин:доксорубицин в конъюгате составляет 1:3.

Аналогично примеру 1 были получены следующие схемы конъюгатов, сведенные в таблицу 1.

Таблица 1
№№	полипептид	цитотоксический химический препарат (ЦП)	бифункциональных сшивающих реагентов	Молярное соотношение полипептид:ЦП в конъюгате
1	Ангиостатин	доксорубицин	глутаровый альдегид	1:3
2	Ангиостатин	карминомицин	3,4-дигидроксиадипиновый альдегид	1:3
3	Биологически активный укороченный фрагмент эндостатина	винбластин	2-этил-3-гидроксипимелиновый альдегид	1:1
4	Биологически активный укороченный фрагмент ангиостатина	Дауномицин	3-гидрокси-4-метиладипиновый альдегид	1:2
5	Эндостатин	паклитаксел	терефталевый альдегид	1:1
6	Эндостатин	доцетаксел	3,4-дигидроксиадипиновый альдегид	1:1
7	Биологически активный укороченный фрагмент ангиостатина	винкристин	3-гидрокси-4-метиладипиновый альдегид	1:1
8	Биологически активный укороченный фрагмент эндостатина	мелфалан	глутаровый альдегид	1:1
9	Эндостатин	цитарабин	терефталевый альдегид	1:1

Пример 2. Эффективность конъюгата ангиостатина с доксорубицином в отношении раковых клеток различных линий, оцениваемая по выживаемости.

Действие конъюгата было исследовано на следующих линиях клеток: карцинома молочной железы человека линии (MCF-7), фибросаркома человека линии (НТ1080), карцинома предстательной железы человека линии (DU145), мышиная меланома линии В16.

Протокол испытаний был общим для всех проведенных испытаний и состоял в следующем. Клетки культивировали в пластиковых флаконах ("Costar") в среде RPMI ("Sigma"), содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки ("Sigma"), 100 ед./мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина, в увлажненной атмосфере 5% CO₂ при 37°С. Клетки рассевали в 96-луночные планшеты (Costar) по 10 тысяч клеток/лунку, добавляя исследуемые препараты в различных концентрациях, и инкубировали 72 ч. За 2-4 ч до окончания инкубации в каждую лунку добавляли по 50 мкл раствора МТТ (3-[4,5-диметилтиазол-2-ил]-2,5-дифенилтетразолия бромид, Sigma) (1 мг/мл) в среде для культивирования клеток. После развития окраски среду удаляли, растворяли кристаллы формазана в 150 мкл диметилсульфоксида и спектрофотометрически измеряли интенсивность окраски по интенсивности поглощения при 540 нм. Выживаемость клеток, подвергшихся воздействию доксорубицина и конъюгата, оценивали в процентах, принимая за 100% выживаемость контрольной культуры.

Данные о выживаемости клеток после их инкубации с конъюгатом ангиостатин-доксорубицин и свободным доксорубицином приведены в табл.2. Из представленных данных следует, что предлагаемый конъюгат полипептида с доксорубицином оказывает сравнимое (DU145), а в ряде случаев более высокое токсическое действие в отношении опухолевых клеток человека линий (НТ1080, MCF-7), а также в отношении клеток мышиной меланомы В 16, чем свободный доксорубицин.

Таблица 2
Линия клеток	Цитотоксичность (IC50)
Доксорубицин	Конъюгат ангиостатина с доксорубицином
MCF-7	180 нМ	100 нМ
НТ1080	100 нМ	65 нМ
DU145	110 нМ	90 нМ
В16	80 нМ	45 нМ

Пример 3. Эффективность конъюгата ангиостатина с доксорубицином в отношении эндотелиальных клеток, оцениваемая по выживаемости.

Действие конъюгата ангиостатина с доксорубицином было исследовано на эндотелиальных клетках линии SVEC 4-10, имитирующих эндотелий опухолевых кровеносных сосудов (Протокол испытаний см. п.4). Конъюгат оказывал более выраженное цитотоксическое действие в отношении эндотелиальных клеток исследуемой линии (IC₅₀=93 нМ) по сравнению с неконъюгированными компонентами - ангиостатином и доксорубицином (IC₅₀=190 и 125 нМ соответственно).

Из примеров 2 и 3 видно, что полученный конъюгат способен оказывать эффективное цитотоксическое действие в отношении как опухолевых, так и эндотелиальных клеток. При этом в отношении эндотелия опухолевых сосудов конъюгат проявляет цитотоксическую активность, превышающую активность свободного (неконъюгированного) ангиостатина, что обусловлено вкладом доксорубицина, гидролизовавшегося от конъюгата в результате разрыва сшивки.

Аналогичные данные были получены по эффективности конъюгатов, указанных в таблице 1, в отношении раковых клеток различных линий и в отношении эндотелиальных клеток.

Дополнительно было проведено сравнение терапевтического действия коньюгата-прототипа (полипептид MYIEALDSYAC-доксорубицин, RU2196604) с действием заявляемого препарата, также включающего доксорубицин. Исследуемые препараты вводились экспериментальным животным в эквимолярных дозах по доксорубицину. Как видно из табл.3, эффект от предлагаемых препаратов, включающих доксорубицин (пп.2-5), существенно превосходит эффект от применения конъюгата-прототипа.

Пример 4. Противоопухолевая активность конъюгатов по примеру 1 при терапии мышей с привитыми солидными опухолями меланомы В16.

Клетки меланомы линии В16 поддерживали путем еженедельной внутрибрюшинной перевивки мышам С57В1/6. Для индукции солидных опухолей мышам вводили подкожно клеточную суспензию (2·10⁵ клеток в 0,1 мл физиологического раствора). Конъюгаты или входящие в их состав компоненты (в эквимолярных дозах) вводили опытным животным внутривенно. Однократные дозы конъюгатов содержали: 90 мг/кг ангиостатина, эндостатина или их фрагментов. Препараты вводили внутривенно 10 дней подряд, начиная с 7-го дня после прививки опухоли. Каждая экспериментальная группа состояла из шести животных, контрольная - из десяти. Размер солидных опухолей измеряли один раз в 2-3 дня. Объем опухоли вычисляли по формуле

,

где а - короткий, b - длинный диаметр опухоли. Относительный размер опухолей (ОРО) определяли по формуле:

,

где Р_оп - средний размер опухолей в опытной группе, Р_к - средний размер опухолей у контрольных животных.

Результаты эксперимента приведены в табл.3. Как видно из таблицы, во всех случаях терапевтический эффект конъюгата в отношении развития опухолей превосходил эффекты от применения отдельных компонентов, что обусловлено особенностями распределения конъюгата в организме (преимущественное накопление в опухоли по сравнению с неконъюгированным цитотоксическим компонентом), а также комбинированным ингибирующим воздействием на опухоль и ее кровеносные сосуды.

Аналогичные результаты были получены в случае конъюгатов ангиостатина, эндостатина или их фрагментов с другими цитотоксическими препаратами - представителями групп противоопухолевых антибиотиков, алкалоидов, производных фенилаланина, пиримидиновых производных.

Таблица 3. Относительный размер солидных опухолей меланомы В16 у мышей при терапии конъюгатами или их компонентами на 20 день после прививки опухолей.
№№	Препарат	ОРО, %
цитотоксический компонент	полипептид	конъюгат
1	Прототип (полипептид MYIEALDSYAC-доксорубицин)	81,4	103,6	67,3
2	Конъюгат (ангиостатин-доксорубицин)	81,4	70,3	53,7
3	Конъюгат (эндостатин-доксорубицина)	81,4	66,7	48,0
4	Конъюгат (фрагмент ангиостатина-доксорубицина)	81,4	66,8	45,1
5	Конъюгат (фрагмент эндостатина-доксорубицина)	81,4	63,9	51,5
6	Конъюгат (ангиостатин-карминомицин)	79,6	70,3	48,9
7	Конъюгат (фрагмент эндостатина-винбластина)	91,3	64,2	53,0
8	Конъюгат (фрагмент ангиостатина-дауномицина)	96,3	67,9	58,4
9	Конъюгат (эндостатин-паклитаксел)	76,2	66,7	50,9
10	Конъюгат (эндостатин-доцетаксел)	78,7	66,7	44,6
11	Конъюгат (фрагмент ангиостатина-винкристина)	92,0	67,9	53,6
12	Конъюгат (фрагмент эндостатина-мелфалана)	95,1	64,2	55,8
13	Конъюгат (эндостатин-цитарабин)	93,7	66,7	57,8
14	Конъюгат (ангиостатин-метотрексат)	85,4	70,3	46,1
15	Конъюгат (фрагмент эндостатина-нитрозометилмочевины)	89,8	70,1	64,0
16	Конъюгат (эндостатин-сарколизин)	97,3	66,7	50,8
17	Конъюгат (фрагмент ангиостатина-эпирубицина)	75,6	65,4	48,7

В таблице 3 представлены также другие соединения указанных групп, например противоопухолевый антибиотик - эпирубицин.

Аналогичные результаты были получены в случае конъюгатов ангиостатина, эндостатина или их фрагментов с другими цитотоксическими препаратами - антиметаболитов (пример 14 - метотрексат), алкилирующих соединений (пример 15 - нитрозометилмочевина, пример 16 - сарколизин).

1. Конъюгат, обладающий избирательным действием по отношению к раковым опухолям, содержащий полипептид, ковалентно присоединенный к молекуле цитотоксического химического препарата через кислотолабильную связь с помощью сшивающего агента, отличающийся тем, что в качестве полипептида используют эндостатин или ангиостатин или их биологически активные укороченные фрагменты, а цитотоксический химический препарат выбран из группы: противоопухолевые антибиотики, алкалоиды, пиримидиновые производные фенилаланина, имеющие в своей структуре реакционноспособную аминогруппу, и сшивающий агент выбран из группы диальдегидов, при этом соотношение полипетида к цитотоксическому препарату равно 1:(1-3).

2. Конъюгат по п.1, отличающийся тем, что в качестве цитотоксического препарата содержит доксорубицин, карминомицин, дауномицин, паклитаксел, доцетаксел, винбластин, винкристин, мелфалан, цитарабин.