Комплексный препарат-пробиотик в иммобилизованной и лиофилизированной форме и способ его получения
Владельцы патента RU 2317089:
Закрытое акционерное общество "Вектор-БиАльгам" (RU)
Изобретение относится к препаратам медицинского и ветеринарного назначения и способам их получения и может быть использовано в биотехнологии, медицине и сельском хозяйстве. Комплексный препарат-пробиотик включает носитель, представляющий собой пористый энтеросорбент СУМС-1 на основе оксида алюминия, и клетки бактерий-эубиотиков с питательной и защитной средами, иммобилизованные на указанном носителе-энтеросорбенте. Клетки бактерий-эубиотиков с питательной средой представляют собой лиофилизированный концентрат консорциума бифидобактерий, или лактобактерий, или их смесь с титром 108-1010 КОЕ/г, а в качестве пористого модифицированного углеродом энтеросорбента СУМС-1 он содержит энтеросорбент СУМС-1, дополнительно обработанный раствором соли металла при следующем соотношении компонентов препарата в лиофилизированном виде, мас.%: клетки с питательной средой консорциума бифидо-, или лактобактерий-эубиотиков, или их смесь с титром 108-1010 КОЕ/г 1,0-10,0; защитная среда 0,1-10,0; энтеросорбент СУМС-1, дополнительно обработанный раствором соли металла, - остальное до 100%. Способ получения препарата включает обработку пористого энтеросорбента СУМС-1 раствором соли металла в объемном соотношении не более 1:1 и его отмывку от реагента 2-3-кратным объемом дистиллированной воды, смешивание энтеросорбента и бактерий-эубиотиков с питательной и защитной средами в соотношении не более 1:1 и выдерживание смеси до полной иммобилизации бактериальных клеток на энтеросорбент с последующим его замораживанием и лиофильной сушкой, перед стерилизацией. В качестве бактерий используют концентрат консорциума бифидобактерий, или лактобактерий, или их смесь с титром 108-1010 КОЕ/г. Комплексный препарат-пробиотик обеспечивает более высокую эффективность сорбции и десорбции клеток бактерий энтеросорбентом СУМС-1, определяющей его клиническую эффективность, и более высокую колонизационную активность бактерий-эубиотиков. 2 н. и 7 з.п. ф-лы, 2 табл.
Изобретение относится к препаратам медицинского и ветеринарного назначения и способам их получения и может быть использовано в биотехнологии, медицине и сельском хозяйстве.
Для профилактики и лечения многих патологических состояний, обусловленных нарушением эндоэкологии, широкое распространение получили энтеросорбенты. Это различные типы активных углей, например карбактин, карболонг, микросорб, полифепан и т.д. (Сенов П.Л. Фармацевтическая химия. - М.: Медицина, 1978, с.132-133; патент РФ N2029546, МПК6 А61К 9/16, опубл. 27.02.95 г.), природные материалы и их аналоги (кристаллическая микроцеллюлоза, цеолиты, хитозаны, пектины и т.д.), синтетические минеральные сорбенты и другие материалы, которые используются для очищения организма от шлаков, радионуклидов, тяжелых металлов и токсинов. Энтеросорбенты снижают эффекты экзо- и эндотоксикозов.
Однако энтеросорбенты не устраняют причин, вызывающих эффекты экзо- и эндотоксикозов, как правило, они не селективны, работают в основном на избыток субстрата, могут оказывать негативное действие из-за сорбции нужных для организма метаболитов (витаминов, гормонов) и не обеспечивают активно нормализацию микробиоценоза.
Функции нормальной микрофлоры в организме являются жизненно важными и очень обширными: синтезирующая, регуляторная, десенсибилизирующая, дезинтоксикационная, ферментативная, защитная и иммуностимулирующая. Для нормализации микробиоценоза широкое распространение получили препараты живых бактериальных клеток: бифидобактерий (межд. заявка (WO) № 85/03848), МКИ А23С 9/12, опубл. 12.09.85 г.), лактобактерий (заявка ЕПВ № 0154614, МКИ А23С 9/123, опубл. 11.09.85 г.), колибактерий и т.д.
Недостатками этих препаратов являются довольно короткие сроки их хранения, если они находятся в жидкой форме, или высокая стоимость, если они изготовлены в сухой форме, а также слабая устойчивость к инактивирующим факторам внешней среды и желудочно-кишечного тракта организма при применении.
Известен комплексный препарат, включающий пористый неорганический носитель и иммобилизованные на нем клетки микроорганизмов (заявка ФРГ №3410650, МКИ С12N 11/14, опубл. 03.10.85 г.). В качестве носителей применяют сталактитовые подложки с двойной структурой пор. Подложки имеют сквозные макропоры, которые делают возможным свободный обмен жидкости и газа из внутренней части носителя в окружающую среду. Размер макропор лежит в пределах величины клеток микроорганизмов.
Недостатком данного препарата является то, что он не предназначен для использования в качестве медицинского или ветеринарного препарата в связи с отсутствием данных о влиянии сталактитового носителя с нанесенными на нем микроорганизмами на микробиоценоз желудочно-кишечного тракта организма человека или животного.
Известен комплексный фармацевтический препарат, включающий фармацевтически приемлемый носитель и иммобилизованные на нем микроорганизмы (межд. заявка (WO) №91/09608, МКИ А61К 35/74, опубл. 11.07.91 г.). Носитель не нарушает жизнеспособности микроорганизмов. В качестве микроорганизмов используют штамм L1a Streptococcus lactis. Препарат предназначен для борьбы с патогенной микрофлорой кишечника человека и животных, вызывающей диарею и другие желудочно-кишечные расстройства.
Недостатком препарата является то, что используемый в нем штамм L1a Streptococcus lactis влияет в основном на патогенную микрофлору кишечника человека и животных, т.е. проявляет антагонистические свойства, но слабо участвует в восстановлении микрофлоры желудочно-кишечного тракта. Кроме того, отсутствуют данные об антацидных свойствах носителя, что свидетельствует о слабой защите носителем иммобилизованных клеток Streptococcus lactis при действии внутренней среды организма с низкими значениями рН.
Известен комплексный бактериальный препарат, включающий носитель и иммобилизованные на нем микробные клетки в концентрации на 1 мм2 2,1×103-1,0×105 (патент РФ №2017486, МПК6 А61К 31/00, опубл. 15.08.94 г.). В качестве носителя используют активированный уголь в виде порошка с размером частиц менее 30 мкм, а в качестве микроорганизмов используют лактобактерии и кишечные палочки.
Недостатком такого препарата является то, что активированный уголь, используемый в качестве носителя, является тонкопористым сорбентом с преобладанием микропор и высокой удельной поверхностью. Вследствие этого микробные клетки расположены на поверхности частиц сорбента и недостаточно защищены при неблагоприятном воздействии окружающей среды. Активированные угли активно поглощают низкомолекулярные биологически активные вещества, витамины и газы кишечника, что ухудшает работу перистальтики. Они быстро забиваются и работают преимущественно в верхних отделах желудочно-кишечного тракта. Кроме того, угли не обладают антацидными свойствами, что не способствует выживаемости нанесенных на них клеток при действии сред с низкими значениями рН. Препарат не предусматривает использование одновременно нескольких штаммов микроорганизмов разных видов, например смеси бифидо- и лактобактерии, что значительно снижает эффективность действия препарата особенно при восстановлении микрофлоры желудочно-кишечного тракта.
Известен препарат-пробиотик в иммобилизованной форме, включающий носитель, представляющий собой сорбент, и клетки эубиотиков, иммобилизованные на указанном носителе, причем клетки эубиотиков используют совместно с питательной средой, а в качестве сорбента используют материал с антацидными свойствами, развитой мезо- и макропористой структурой и объемом макропор не менее 0,01 см3/г в виде порошка с размером частиц не более 0,1 мм, или в виде гранул размером (0,1-5,0) мм, или в виде таблеток при следующем количественном соотношении компонентов препарата, мас. %: клетки эубиотиков с питательной средой и титром 108-108 КОЕ/мл - 1,0-50,0; носитель-сорбент - остальное до 100%.
В качестве сорбента используют пористый материал на основе оксида алюминия с гидрофильно-гидрофобной топохимией поверхности, например энтеросорбент типа СУМС-1, модифицированный углеродом, или энтеросорбент типа СИАЛ, модифицированный кремнийорганическим полимером. В качестве эубиотиков используют бифидо- или лактобактерии или их смесь (патент РФ №2118535, МПК6 А61К 35/74, опубл. 10.09.98 г.).
Однако используемые в указанном препарате сорбенты обладают недостаточной эффективностью сорбции и десорбции бактерий-эубиотиков, а также имеет низкую колонизационную активность входящих в состав препарата бактерий-эубиотиков.
Известен способ получения комплексного препарата бактерий-эубиотиков (патент РФ №2067114, МПК А61К 35/74, опубл. 27.09.96 г.), включающий выращивание в условиях глубинного культивирования культуры штаммов бифидобактерий и стрептококка, смешивание биомассы с защитной средой следующего состава (мас.%): сахароза 25-30; желатин 2-3; сухое молоко 3-5; глутамат натрия 0,5-1 и контактно-сорбционное обезвоживание целевого продукта, которое проводят охлажденным до минус 8-10°С сорбентом, например окисью алюминия, с остаточной влажностью менее 1% при массовом соотношении 1:10-12, соответственно, а досушивание осуществляют в течение 18-20 часов при температуре 0-5°С в замкнутом объеме.
Однако используемый в указанном способе сорбент обладает недостаточной эффективностью сорбции и десорбции бактерий-эубиотиков, а также имеет низкую колонизационную активность бактерий-эубиотиков.
Наиболее близким техническим решением (прототипом) является препарат-пробиотик в иммобилизованной и лиофилизированной форме (патент РФ №2164801, МПК А61К 35/74, опубл. 10.04.01). Препарат включает носитель, представляющий собой сорбент, и клетки пробиотиков, иммобилизованные на указанном носителе, причем клетки пробиотиков используют совместно с питательной средой, а в качестве сорбента используют материал с антацидными свойствами, развитой мезо- и макропористой структурой и объемом макропор не менее 0,01 см3/г в виде порошка с размером частиц не более 0,1 мм, или в виде гранул размером (0,1-5,0) мм, или в виде таблеток, согласно изобретению препарат дополнительно содержит защитную среду, а клетки пробиотиков с питательной средой представляют собой сухой концентрат бифидобактерий на молочной основе с титром 108-1010 КОЕ/г и содержанием аминокислот (мг/100 г сухой биомассы): глутаминовая кислота - 15,0-68,0; глутамин - 8,0-20,0; лейцин - 10,0-50,0; аргинин - 20,0-30,0; цистеин - 50,0-80,0 при следующем соотношении компонентов препарата в сухом виде мас.%: клетки эубиотиков с питательной средой и титром 108-1010 КОЕ/г - 0,1-10,0; защитная среда - 0,1-10,0; носитель-сорбент - остальное до 100%. В качестве защитной среды используют желатин, сахарозу, аскорбиновую кислоту и хлористый натрий при следующем содержании компонентов, мас.%: желатин - 8,5-11,5; аскорбиновая кислота - 0,8-1,2; хлористый натрий - 1,7-3,0; сахароза - остальное до 100%. В качестве сорбента используют пористый материал на основе оксида алюминия с гидрофильно-гидрофобной топохимией поверхности, например энтеросорбент типа СУМС-1, модифицированный углеродом. Препарат в качестве бактерий-пробиотиков дополнительно содержит сухую закваску вязких штаммов ацидофильных бактерий Lactobacillus acidophilus типа АВ, соотношение которых с сухим концентратом бифидобактерий составляет 1:(8-9) соответственно. В качестве бифидобактерий в сухом концентрате используют бактерии Bifidum bifidum №1, или №791, или ЛВА-3, или Bifidobacterium longum 379, или Bifidobacterium adolescentis MC-42, или смесь бактериальных клеток указанных штаммов, взятых в равных весовых долях.
Наиболее близким способом (прототипом) является способ получения комплексного препарата-пробиотика в иммобилизованной и лиофилизированной форме, приведенный в описании к патенту РФ №2164801, МПК А61К 35/74, опубл. 10.04.01, включающий отмывку и стерилизацию пористого энтеросорбента СУМС-1, модифицированного углеродом, и его охлаждение до комнатной температуры, смешивание энтеросорбента и бактерий-эубиотиков с питательной и защитной средами в соотношении не более 1:1 и выдерживание смеси в течение не менее 1 часа при перемешивании и температуре +4°С до полной иммобилизации бактериальных клеток на энтеросорбент, отмывку полученного комплексного препарата в изотоническом солевом растворе с последующим его замораживанием и лиофильной сушкой.
Однако используемые в указанном препарате и способе его получения сорбенты также обладают недостаточной эффективностью сорбции и десорбции бактерий-эубиотиков. Кроме того, наблюдается низкая колонизационная активность входящих в состав препарата бактерий-эубиотиков.
Техническим результатом заявляемых технических решений является создание такого комплексного препарата-пробиотика со способом его получения, который обеспечивал бы более высокую эффективность сорбции и десорбции клеток бактерий энтеросорбентом СУМС-1, определяющей его клиническую эффективность, и более высокую колонизационную активность бактерий-эубиотиков.
Указанный технический результат достигается тем, что в комплексном препарате-пробиотике в иммобилизованной и лиофилизированной форме, включающем носитель, представляющий собой пористый энтеросорбент СУМС-1 на основе оксида алюминия, модифицированный углеродом с гидрофильно-гидрофобной топохимией поверхности, и клетки бактерий-эубиотиков с питательной и защитной средами, иммобилизованными на указанном носителе-энтеросорбенте, согласно изобретению клетки бактерий-эубиотиков с питательной средой представляют собой лиофилизированный концентрат консорциума бифидобактерий, или лактобактерий, или их смесь с титром 108-1010 КОЕ/г, а в качестве пористого модифицированного углеродом энтеросорбента СУМС-1 он содержит энтеросорбент СУМС-1, дополнительно обработанный раствором соли металла в соответствии со способом по п.п.5 и 6 формулы изобретения при следующем соотношении компонентов препарата в лиофилизированном виде, мас.%:
| клетки с питательной средой консорциума бифидо-, | |
| или лактобактерий-эубиотиков, или их смесь | |
| с титром 108-1010 КОЕ/г | 1,0-10,0 |
| защитная среда | 0,1-10,0 |
| энтеросорбент СУМС-1, дополнительно обработанный | |
| раствором соли металла | остальное до 100%. |
Препарат с содержанием микробной биомассы менее 0,1 мас.% имеет низкий биотитр с преобладанием прочно связанных с сорбентом клеток, т.е. действует преимущественно как энтеросорбент. Количество микробных клеток, вводимых в препарат, не превышает 15 мас.%, вследствие чего вся биомасса бактерий препарата находится в защищенном состоянии. При этом энтеросорбент СУМС-1 в препарате сохраняет основные свои свойства, обеспечивающие связывание и выведение из кишечника токсинов, продуктов незавершенного метаболизма и патогенных микроорганизмов.
В качестве консорциума бифидобактерий он содержит штаммы бифидобактерий: Bifidobacterium bifidum 8-3, Bifidobacterium longum ДВА-13 и Bifidobacterium adolescentis ГО-13 в соотношении 8:1:1.
В качестве консорциума лактобактерий он содержит штаммы лактобактерий Lactobacillus acidophilus 57S, Lactobacillus plantarum П-75, Lactobacillus casei С6 в соотношении 4:1,0:1,0.
Смесь консорциумов бифидо- и лактобактерий имеет соотношение от 1:1 до 3:1.
Указанный технический результат достигается также тем, что в способе получения комплексного препарата-пробиотика в иммобилизованной и лиофилизированной форме, включающем отмывку и стерилизацию пористого энтеросорбента СУМС-1, модифицированного углеродом, и его охлаждение до комнатной температуры, смешивание энтеросорбента и бактерий-эубиотиков с питательной и защитной средами в соотношении не более 1:1 и выдерживание смеси в течение не менее 1 часа при перемешивании и температуре не выше +4°С до полной иммобилизации бактериальных клеток на энтеросорбент, отмывку полученного комплексного препарата в изотоническом солевом растворе с последующим его замораживанием и лиофильной сушкой, согласно изобретению перед стерилизацией энтеросорбент СУМС-1 обрабатывают раствором соли металла в объемном соотношении не более 1:1 и отмывают от реагента 2-3-кратным объемом дистиллированной воды, а в качестве бактерий-эубиотиков используют концентрат консорциума бифидобактерий, или лактобактерий, или их смесь с титром 108-1010 КОЕ/г.
В качестве раствора соли металла используют 3%-ный раствор сульфата магния.
В качестве консорциума бифидобактерий используют штаммы бифидобактерий: Bifidobacterium bifidum 8-3, Bifidobacterium longum ДВА-13, Bifidobacterium adolescentis ГО-13 в соотношении 8:1:1, а в качестве консорциума лактобактерий используют штаммы лактобактерий Lactobacillus acidophilus 57S, Lactobacillus plantarum П-75 и Lactobacillus casei С6 в соотношении 4:1,0:1,0. Смесь консорциумов бифидо- и лактобактерий имеет соотношение от 1:1 до 3:1.
Штамм бифидобактерий: Bifidobacterium bifidum 8-3 депонирован во ВНИИгенетика в ВКПМ под №В 5799. Штамм Bifidobacterium longum ДВА-13 депонирован во ВНИИгенетика в ВКПМ под №В 5894. Штамм Bifidobacterium adolescentis ГО-13 депонирован во ВНИИгенетика в ВКПМ под № В 2944.
Штамм лактобактерий Lactobacillus acidophilus 57S депонирован во ВНИИгенетика в ВКПМ под №В 5863. Штамм Lactobacillus plantarum П-75 депонирован во ВНИИгенетика в ВКПМ под №В 3962. Штамм Lactobacillus casei С6 депонирован во ВНИИгенетика в ВКПМ под №В 5724.
Введение в препарат сухой микробной биомассы с биотитром 108-1010 КОЕ/г обеспечивает ему оптимальную биологическую активность. Если исходная микробная биомасса имеет титр меньше 108 КОЕ/г, то препарат обладает недостаточной биологической активностью и при введении в желудочно-кишечный тракт проявляет слабый лечебно-профилактический эффект. Титр сухой микробной биомассы более 1010 КОЕ/мл значительно увеличивает стоимость препарата без значительного увеличения лечебно-профилактического эффекта.
Основу жидкой бактериальной суспензии для сушки составляют клетки-эубиотики в молочной питательной среде с повышенным титром клеток (109-1010 КОЕ/мл) - жидкий концентрат бифидобактерий. Молочная питательная среда с клетками-эубиотиками содержит повышенное количество белка (не менее 12% СОМ - сухого остатка молока). Это позволяет увеличить антибиотические свойства бактерий-пробиотиков в препарате. Кроме того, повышенное количество белка увеличивает антацидные свойства препарата. Высокая концентрация клеток в жидкой бактериальной суспензии позволяет их использовать в препарате в сухом виде в концентрации 1,0-10,0% с титром 108-1010 КОЕ/мл.
Носитель-сорбент представляет собой механически прочные частицы порошка, или гранулы, или таблетки, выполненные из оксида алюминия, поверхность которых модифицирована углеродом при получении сорбента типа СУМС-1 черного цвета. Сорбенты имеют удельную поверхность до 300 м2/г и развитую структуру мезо- и макропор. Размеры макропор сорбента соизмеримы с размерами микробных клеток, что позволяет заполнять макропоры указанными клетками. Регулированием процентного содержания углерода в сорбенте с последующими окислительно-восстановительными его обработками обеспечивается получение носителя с заданными гидрофильно-гидрофобными и другими топохимическими характеристиками. Сорбенты типа СУМС-1 в меньшей степени, чем другие аналогичные материалы, извлекают витамины и гормоны из организма и не нарушают перистальтику, что делает возможным их применение длительными курсами. Наличие в сорбенте оксида алюминия придает его поверхности определенные буферные антацидные свойства, что способствует лучшему сохранению активности и выживанию иммобилизованных на нем микробных клеток, например, при прохождении препарата через желудок (устраняет отрицательное влияние желудочного сока на микробные клетки) или при других неблагоприятных условиях (низких рН).
Макропористая структура носителя-сорбента, ячейки которого заполнены микробными клетками, также способствует защите этих иммобилизованных клеток от инактивирующих факторов внешней среды. Причем микробные клетки, находящиеся в порах, и клетки, находящиеся близко к внешней поверхности носителя-сорбента, отличаются по своим десорбционным способностям, и такая неоднородность свойств клеток обеспечивает пролонгированное действие препарата и способствует колонизации не только верхних, но и нижних отделов кишечника. Пористый носитель, являясь энтеросорбентом, снимает эффекты местного (а через него и общего) токсикоза, что способствует выживаемости бактерий препарата и микрофлоры кишечника, а также снижает нагрузку на органы детоксикации человека или животного. Кроме того, при использовании в препарате в качестве микробных клеток консорциума бифидобактерий, или консорциума лактобактерий, или смеси консорциумов бифидо- и лактобактерий обеспечивается не только вытеснение из желудочно-кишечного тракта патогенных микроорганизмов (за счет антагонистических свойств указанных бактерий), но и восстановление сильно сокращенной микрофлоры кишечника при дисбактериозе и других заболеваниях.
Ниже приведены примеры составов предлагаемого комплексного препарата бактерий-эубиотиков в иммобилизованной и лиофилизированной форме.
Пример 1. Препарат-пробиотик "Экофлор" в виде порошка с размером частиц (40-100) мкм (мас.%):
| клетки с питательной средой консорциума лактобактерий | |
| с титром 1010 КОЕ/г | 1,0 |
| защитная среда, в том числе: | |
| желатин | 0,085 |
| аскорбиновая кислота | 0,008 |
| хлористый натрий | 0,017 |
| сахароза | 0,89 |
| энтеросорбент СУМС-1, дополнительно обработанный | |
| 3%-ным раствором сульфата магния | остальное до 100%. |
Пример 2. Препарат-пробиотик "Экофлор" в виде порошка с размером частиц (40-100) мкм (мас.%):
| клетки с питательной средой консорциума бифидобактерий | |
| с титром 109 КОЕ/г | 7,0 |
| защитная среда, в том числе: | |
| желатин | 0,85 |
| аскорбиновая кислота | 0,08 |
| хлористый натрий | 0,17 |
| сахароза | 8,9 |
| энтеросорбент СУМС-1, дополнительно обработанный | |
| 3%-ным раствором сульфата магния | остальное до 100%. |
Пример 3. Препарат-пробиотик "Экофлор" в виде гранул размером (0,5-5,0) мм (мас.%):
| клетки с питательной средой и | |
| титром 108 КОЕ/г смеси консорциумов | |
| бифидо- и лактобактерий в | |
| соотношении 1:1 | 10,0 |
| защитная среда, в том числе: | |
| желатин | 0,575 |
| аскорбиновая кислота | 0,06 |
| хлористый натрий | 0,15 |
| сахароза | 4,215 |
| энтеросорбент СУМС-1, дополнительно обработанный | |
| 3%-ным раствором сульфата магния | остальное до 100%. |
Пример 4. Препарат-пробиотик "Экофлор" в виде гранул размером (0,5-5,0) мм (мас.%):
| клетки с питательной средой и титром 109 КОЕ/г | |
| смеси консорциумов бифидо- и лактобактерий в | |
| соотношении 3:1 | 5,0 |
| защитная среда, в том числе: | |
| желатин | 0,85 |
| аскорбиновая кислота | 0,08 |
| хлористый натрий | 0,17 |
| сахароза | 8,9 |
| энтеросорбент СУМС-1, дополнительно обработанный | |
| 3%-ным раствором сульфата магния | остальное до 100%. |
Пример 5. Технология получения готовых форм препарата "Экофлор".
По специальной технологии готовят исходные сорбенты типа СУМС-1 (патент РФ №2026733), в котором оксид алюминия модифицирован углеродом, с требуемой пористой структурой, химической природой поверхности и размером частиц или гранул. Далее мерное количество энтеросорбента СУМС-1 засыпают в цилиндрическую емкость, заливают дистиллированной водой в объемном соотношении 1:1 и тщательно перемешивают. Отмывают не менее 3-х раз дистиллированной водой до полного исчезновения угольной пленки и взвеси. Далее энтеросорбент СУМС-1 обрабатывают раствором соли металла, а именно 3%-ным раствором сульфата магния в объемном соотношении 1:1. Отмывают от сульфат-ионов 2-3-кратным объемом дистиллированной воды. После обработки энтеросорбента СУМС-1 3%-ным раствором сульфата магния эффективность его биосорбции увеличивается в 1,4 раза, а эффективность биодесорбции, определяющая клинический эффект от действия препарата, равна 1.
Стерилизацию СУМС-1 ведут сухим жаром в сушильном шкафу россыпью слоем не более 1,5-2,0 см при температуре (160±2)°С в течение 2 часов. Контроль стерильности СУМС-1 определяют микробиологически. Контроль процесса стерилизации СУМС-1 осуществляют с помощью химических тестов.
Процесс иммобилизации СУМС-1 проводят в асептических условиях. Для иммобилизации берут равные по объему (1:1) количества энтеросорбента СУМС-1 и культуры консорциумов микроорганизмов. Для иммобилизации используют консорциум бифидобактерий (с титром не менее 1010 КОЕ/мл), или консорциум лактобактерий (с титром не менее 108 КОЕ/мл), или их смесь в объемном соотношении 9:1 соответственно в соответствии с примерами 1-3. Биомассу бактерий приготавливают на молочной питательной среде, содержащей повышенное количество белка (не менее 12% СОМ - сухого остатка молока) по стандартной технологии.
Смесь энтеросорбента СУМС-1 с клетками бактерий-эубиотиков тщательно перемешивают в течение 5 мин и помещают на шейкер на 1 час при интенсивности 100 колебаний в минуту при температуре 6±2°С. Процесс иммобилизации возможно вести в стеклянной посуде на роллерной установке. Для определения качества иммобилизации из исходного титра бифидобактерий и лактобактерий в концентрате бифидо- и лактобактерий вычитают полученный результат биотитрования. Процесс считается завершенным, если в растворе осталось не более 50% от исходного количества бифидо- и лактобактерий.
Далее продукт однократно промывают в изотоническом растворе NaCl. Мутный раствор стерильно сливают, отбирают пробы и проводят контроль полноты процесса иммобилизации по МУК 4.2.577-96 (Методы микробиологического контроля продуктов детского, лечебного питания и их компонентов", п.7.1 и п.7.10). Процесс считается завершенным, если в растворе осталось не более 50% от исходного количества бифидо- и лактобактерий.
Отмытый продукт замораживают в низкотемпературном холодильнике типа "Кельвинатор" при температуре минус (40-45)°С в течение (24-48) часов. Кассеты с предварительно замороженным препаратом перегружают в сушильную камеру при достижении температуры плит минус (20-30)°С и камеру вакуумируют. Готовый препарат "Экофлор" в сухой иммобилизованной форме фасуют во флаконы и герметично закрывают пробками. Массовая доля влаги составляет не более 3,0 мас.%.
В таблице 1 приведены адсорбционные емкости СУМС-1 после модификации поверхности (измерялась по адсорбции метиленового синего согласно ФС 42-3283-96).
| Таблица 1 Данные по адсорбционной емкости энтеросорбента СУМС-1 после обработки солями металлов | |||
| № п/п | Наименование солей | Адсорбционная емкость | рН сорбента |
| 1 | СУМС-1 чистый | 0,017±0.002 г | 8,2 |
| 2 | СУМС-1+AlCl3 (0,36%) | 0,018±0.002 г | 6,1 |
| 3 | СУМС-1+AlCl3 (0,75%) | 0,018±0.002 г | 5,8 |
| 4 | СУМС-1+AlCl3 (3%) | 0,012±0.001 г | 3,26 |
| 5 | СУМС-1+MgSO4 (1%) | 0,017±0.001 г | 6,7 |
| 6 | СУМС-1+MgSO4·6Н2O (3%) | 0,024±0.002 г | 6,5 |
| 7 | СУМС-1+MgSO4·6Н2О (5%) | 0,027±0.003 г | 6,3 |
| 8 | СУМС-1+MgCl2 (1%) | 0,015±0.002 г | 6,5 |
| 9 | СУМС-1+MgCl2 (3%) | 0,018±0.002 г | 6,6 |
| 10 | СУМС-1+NiCl2 (3%) | 0,016±0.002 г | 5,9 |
| 11 | СУМС-1+ZnCl2 (3%) | 0,019±0.001 г | 5,5 |
Обработанная поверхность СУМС-1 оценивалась в биологических тестах по:
1) эффективности биосорбции (отношение количества сорбированных клеток к общему количеству бактерий в исходной суспензии),
2) эффекивности биодесорбции (отношение количества бактерий, десорбированных с поверхности СУМС-1, к количеству сорбированных бактерий).
Эффективность биодесорбции является важным показателем, во многом определяющим клиническую эффективность ИКЭ. Результаты биологических тестов приведены в табл. 2.
| Таблица 2 Данные биологического тестирования энтеросорбента СУМС после обработки солями металлов | ||||||
| Модификация поверхности | Эффектив. десорбции LgT4/LgT3 | Эффектив. сорбции LgT1/LgT3 | Исходный титр Т1 (КОЕ/мл) | Сорбция Т3=(Т1-Т2) | Десорбция Т4 | |
| T3 | Т2 | |||||
| Иммобилизация консорциума бифидобактерий | ||||||
| AlCl3 - 0,01% | 0,8714 | 1,001 | 1·1010 | 4·108 | 9,6·109 | 5·108 |
| AlCl3 - 0,36% | 0,8781 | 1,0004 | 1·1010 | 7·107 | 9,93·109 | 6·108 |
| AlCl3 - 0,75% | 0,9009 | 1,000 | 1·1010 | 1·108 | 9,99·109 | 1·109 |
| MgSO4·6Н2O - 3% | 1,0000 | 1,015 | 1·1010 | 3·109 | 7·109 | 7·109 |
| MgSO4·6Н2О - 3% | 0,9344 | 1,004 | 1·1010 | 1·109 | 9·109 | 2·109 |
| Иммобилизация смеси консорциумом бифидо- и лактобактерий | ||||||
| MgSO4·6Н2O - 3% | 0,9068 | 1,007 | 1·1010 | 1,6·109 | 8,4·109 | 1·109 |
| Иммобилизация консорциума лактобактерий | ||||||
| MgSO4·6Н2O - 3% | 0,7839 | 1,005 | 6·108 | 6·107 | 5,4·108 | 7·106 |
| Примечание: Т1 (КОЕ/мл) - исходный титр биомассы бактерий; Т2 (КОЕ/мл) - титр биомассы бактерий, оставшейся после иммобилизации на энтеросорбент; |
| Т3=Т1-T2 - титр (КОЕ/мл) бактериальных клеток, иммобилизованных на сорбенте; Т4 - титр (КОЕ/мл) бактериальных клеток после десорбции, определяющий клинический эффект от действия препарата |
Таким образом, по результатам исследований обработанной поверхности СУМС-1 солями металлов вариант №6 (табл.1) обработки MgSO4·6H2О (3%) является наиболее оптимальным. После обработки энтеросорбента СУМС-1 3%-ным раствором сульфата магния эффективность его биосорбции увеличивается в 1,4 раза (отношение сорбированных клеток к общему количеству бактерий в исходной суспензии), а эффективность биодесорбции, определяющая клинический эффект от действия комплексного препарата (отношение количества бактерий, десорбированных с поверхности СУМС-1 к количеству сорбированных на нем бактерий), равна 1, что показывает о том, что практически все бактерии могут десорбироваться в желудочно-кишечном тракте.
Результаты доклинических исследований
Проведенные исследования подтвердили, что комплексный препарат «Экофлор» нетоксичен для лабораторных животных, восстанавливает нормобиоценоз кишечника, элиминирует условно-патогенную и патогенную микрофлору, не вызывает побочных и непредвиденных нежелательных реакций, стимулирует процессы адаптации организма к неблагоприятным факторам внешней среды. Основные результаты исследования:
1) морфометрические показатели животных в экспериментальных группах нарастали в соответствии с популяционным стандартом;
2) лабораторные анализы крови оставались в пределах физиологической нормы;
3) гистологические исследования органов показали отсутствие токсического воздействия;
4) подтверждено отсутствие повреждающего действия на структуру кишечного эпителия со стороны препарата;
5) патолого-анатомическое вскрытие подтвердило состояние органов в норме. Полученные результаты свидетельствуют о том, что комплексный препарат «Экофлор» успешно прошел доклинические испытания.
Результаты клинических исследований комплексного препарата «ЭКОФЛОР»
Все пациенты (45 человек - экспериментальная группа и 25 человек - группа сравнения) имели хроническую патологию: атопический дерматит - в 44,4% случаев; острый аллергоз - в 11,1% случаев; вторичный хронический пиелонефрит - в 22,2% случаев; сахарный диабет - в 11,1% случаев; бронхиальная астма - в 11,1% случаев.
После проведенного экспериментального курса лечения комплексным препаратом «Экофлор» были получены следующие результаты:
1) препарат «Экофлор» способствует уменьшению абдоминального болевого синдрома, проявлений диспепсического синдрома, нормализации моторной функции кишечника, регрессу кожных высыпаний;
2) применение «Экофлора» способствует уменьшению субъективных клинических (недомогание, слабость, нарушение аппетита) и объективных лабораторных критериев (нормализация лейкоцитарного индекса интоксикации и гематологического показателя интоксикации, купирование синдрома цитолиза и нормализация общего белка сыворотки крови, а также уменьшение выраженности мочевого синдрома), отражающих синдром эндогенной интоксикации;
3) при использовании препарата «Экофлор» в 62,2% наблюдается полное восстановление функций переваривания и всасывания в кишечнике, у остальных больных - тенденция к нормализации показателей;
4) препарат «Эклофлор» способствует восстановлению кишечной микрофлоры: кишечной палочки, бифидофлоры; снижению кокковых форм, кишечной палочки со слабо выраженными ферментными свойствами, лактозонегативных энтеробактерий;
5) при приеме препарата не выявлены побочные эффекты и осложнения.
Таким образом, препарат успешно прошел клинические испытания, является безвредным и высокоэффективным средством в отношении восстановления нормобиоценоза кишечника и купирования синдрома эндогенной интоксикации.
1. Комплексный препарат-пробиотик в иммобилизованной и лиофилизированной форме, включающий носитель, представляющий собой пористый энтеросорбент СУМС-1 на основе оксида алюминия, модифицированный углеродом с гидрофильно-гидрофобной топохимией поверхности, и клетки бактерий-эубиотиков с питательной и защитной средами, иммобилизованные на указанном энтеросорбенте, отличающийся тем, что клетки бактерий-эубиотиков с питательной средой представляют собой лиофилизированный концентрат консорциума бифидобактерий, или лактобактерий, или их смесь с титром 108-1010 КОЕ/г, а в качестве пористого модифицированного углеродом энтеросорбента СУМС-1 он содержит энтеросорбент СУМС-1, дополнительно обработанный раствором соли металла при следующем соотношении компонентов препарата в сухом виде, мас.%:
| клетки с питательной средой консорциума бифидо-, | |
| или лактобактерий-эубиотиков, или их смесь | |
| с титром 108-1010 КОЕ/г | 1,0-10,0 |
| защитная среда | 0,1-10,0 |
| энтеросорбент СУМС-1, дополнительно обработанный | |
| раствором соли металла | остальное |
2. Комплексный препарат-пробиотик по п.1, отличающийся тем, что в качестве консорциума бифидобактерий он содержит штаммы бифидобактерий: Bifidobacterium bifidum 8-3, Bifidobacterium longum ДВА-13 и Bifidobacterium adolescentis ГО-13 в соотношении 8:1:1.
3. Комплексный препарат-пробиотик по п.1, отличающийся тем, что в качестве консорциума лактобактерий он содержит штаммы лактобактерий Lactobacillus acidophilus 57S, Lactobacillus plantarum П-75, Lactobacillus casei Сб в соотношении 4:1,0:1,0.
4. Комплексный препарат-пробиотик по п.1, отличающийся тем, что смесь консорциумов бифидо- и лактобактерий имеет соотношение от 1:1 до 3:1.
5. Способ получения комплексного препарата-пробиотика в иммобилизованной и лиофилизированной форме, включающий отмывку и стерилизацию пористого энтеросорбента СУМС-1, модифицированного углеродом, и его охлаждение до комнатной температуры, смешивание энтеросорбента и бактерий-эубиотиков с питательной и защитной средами в соотношении не более 1:1 и выдерживание смеси в течение не менее 1 часа при перемешивании и температуре не выше +4°С до полной иммобилизации бактериальных клеток на энтеросорбент, отмывку полученного комплексного препарата в изотоническом солевом растворе с последующим его замораживанием и лиофильной сушкой, отличающийся тем, что перед стерилизацией энтеросорбент СУМС-1 обрабатывают раствором соли металла в объемном соотношении не более 1:1 и отмывают от реагента 2-3 кратным объемом дистиллированной воды, а в качестве бактерий-эубиотиков используют концентрат консорциума бифидобактерий, или лактобактерий, или их смесь с титром 108-1010 КОЕ/г.
6. Способ по п.5, отличающийся тем, что в качестве раствора соли металла используют 3%-ный раствор сульфата магния.
7. Способ по п.5, отличающийся тем, что в качестве консорциума бифидобактерий используют штаммы бифидобактерий: Bifidobacterium bifidum 8-3, Bifidobacterium longum ДВА-13, Bifidobacterium adolescentis ГО-13 в соотношении 8:1:1.
8. Способ по п.5, отличающийся тем, что в качестве консорциума лактобактерий используют штаммы лактобактерий Lactobacillus acidophilus 57S, Lactobacillus plantarum П-75 и Lactobacillus casei Сб в соотношении 4:1,0:1,0.
9. Способ по п.5, отличающийся тем, что смесь консорциумов бифидо- и лактобактерий имеет соотношение от 1:1 до 3:1.
