Способ дифференциальной диагностики хронического пиелонефрита у детей
Владельцы патента RU 2318447:
ГОУ ВПО Смоленская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию (RU)
Изобретение относится к области медицины, в частности к педиатрии, иммунологии. В периферической крови больных определяют методом непрямой иммунофлюоресценции с применением моноклональных антител уровень экспрессии молекул адгезии CD11β и CD54 лимфоцитов и при содержании молекул CD11β менее 17,18% и молекул CD54 менее 16,75% определяют хроническое течение пиелонефрита. Способ прост и информативен. Он позволяет быстро и объективно в течение 2,5 часов после взятия крови оценить показатели адгезии лейкоцитов и их трансэндотелиальной миграции, с высокой информативностью обеспечивает дифференциальную диагностику хронического течения пиелонефрита и своевременное и рациональное проведение комплекса терапевтических мероприятий. 1 табл.
Изобретение относится к медицине, в частности к педиатрии, иммунологии. Оно может быть использовано в клинике для диагностики хронического пиелонефрита (ХП) у детей.
Известен способ диагностики ХП по клиническим признакам, согласно которому ХП дифференцируют от цистита, гломерулонефрита, интерстициального нефрита, наследственного нефрита и других заболеваний (Возианов А.Ф., Майданник В.Г., Бидный В.Г., Багдасарова И.В. Основы нефрологии детского возраста. - К.: Книга плюс, 2002. - С.22-91).
Известен способ диагностики пиелонефрита по определению уровня цитокинов, который выбран в качестве ближайшего аналога. Этот способ включает выявление повышения уровня цитокинов (фактора некроза опухоли-альфа, трансформирующего фактора роста-бета1) в плазме крови иммуноферментным методом (Хворостов И.Н., Смирнов И.Е., Зоркин С.Н., Кучеренко А.Г. Цитокины при обструктивных уропатиях у детей // Вопросы современной педиатрии. - Приложение №1: Сборник материалов Х Съезда педиатров России «Пути повышения эффективности медицинской помощи детям». - 2005. - Т.4. - С.572). Недостатком данного способа является его высокая стоимость.
Целью изобретения является повышение точности, эффективности и объективизация дифференциальной диагностики хронического пиелонефрита, что обеспечит быстроту постановки диагноза, экономичность, а также своевременное и рациональное проведение комплекса терапевтических мероприятий.
Сущность предложенного способа диагностики состоит в том, что наряду с клиническими данными и исследованием мочи определяют уровень молекул адгезии CD11β и CD54 лимфоцитов в периферической крови ребенка методом непрямой иммунофлюоресценции с применением моноклональных антител и при содержании CD11β менее 17,18% и молекул CD54 менее 16,75% диагностируют хроническое течение пиелонефрита.
Выход клеток иммунной системы из сосудистого русла и миграция их в очаг проникновения инфекционных агентов являются ключевым этапом в системе защиты организма. Взаимодействие CD11β (Mac-1, интегрин, рецептор iC3b) с CD54 (ICAM-1, лиганд для LFA-1 и Мас-1) имеет важное значение в регуляции отдельного этапа адгезии лейкоцитов и их трансэндотелиальной миграции. ICAM-1 и его рецептор LFA-1 являются дополнительными факторами активации Т-лимфоцитов. Молекулы адгезии CD11β и CD54 индуцируются медиаторами воспаления, такими как IL-1, TNFα и IFNγ. При хроническом течении пиелонефрита в условиях длительной персистенции антигенов отмечается нарушение регуляции экспрессии молекул адгезии и снижение уровня молекул адгезии CD11β и CD54 лимфоцитов.
Способ осуществляется следующим образом: из пробы (4-5 мл) гепаринизированной крови взятой натощак у больных детей выделяют лимфоциты на градиенте фиколл-верографина, затем 1-0,1 млн лимфоцитов в объеме 50 мкл вносят в лунки 96-луночного круглодонного планшета. К клеткам добавляют 5 мкл тестируемых моноклональных антител (CD11β, CD54) и инкубируют 30-45 мин при +4°С. Затем добавляют 150 мкл раствора Хенкса и центрифугируют 5 мин при 200 g. После удаления супернатанта вносят 50 мкл раствора Хенкса, клетки суспендируют, добавляют 150 мкл раствора Хенкса и центрифугируют 5 мин при 200 g. К осадку отмытых клеток добавляют 50 мкл F(ab˜)2-фрагментов овечьих антител к Ig мыши, меченных ФИТЦ и разведенных 1:100 (для разведения используют раствор Хенкса, содержащий 0,5% желатины и 0,1% азида натрия). Клетки суспендируют и инкубируют 30 мин при +4°С, затем клетки 2 раза отмывают как указано выше. Окрашенные клетки анализируют с помощью люминесцентного микроскопа. Клетки суспендируют, переносят на предметное стекло, накрывают покровным стеклом, и препарат просматривают под иммерсией с увеличением (×3; объектив ×90). Количество антигенпозитивных клеток определяют как % флюоресцирующих клеток при просматривании 200 лимфоцитов за вычетом % флюоресцирующих клеток, наблюдаемых в препарате отрицательного контроля. В качестве отрицательного контроля используют препараты, подготовленные аналогичным образом, но без обработки моноклональными антителами. При содержании молекул адгезии CD11β менее 17,18% и молекул CD54 менее 16,75% устанавливают хроническое течение пиелонефрита.
Пример.
Девочка Д., 5 лет. Год назад находилась на стационарном лечении по поводу острого пиелонефрита; отмечались симптомы интоксикации, болевой абдоминальный синдром, мочевой синдром, представленный лейкоцитурией, бактериурией. Два дня назад после кратковременного переохлаждения повысилась температуры тела до 38,5°С, появились боли в животе, в поясничной области. При поступлении в стационар состояние средней тяжести, температура 38,5°С, кожные покровы бледные, параорбитальный цианоз. Отеков и пастозности тканей нет. В легких везикулярное дыхание. ЧДД 20 в 1 мин. Тоны сердца удовлетворительной звучности. Пульс 122 в 1 мин, АД 100/60 мм рт.ст. Живот мягкий, болезненный при пальпации в области правого фланка. Область почек не изменена, почки не пальпируются, симптом Пастернацкого справа положительный. Стул оформленный. Мочеиспускания учащены до 10 раз в сутки, безболезненные.
В общем анализе крови нейтрофильный лейкоцитоз, увеличение СОЭ. Биохимический анализ крови: уровень общего белка, мочевины, креатинина в пределах нормы, С-реактивный белок - отриц. В общем анализе мочи - лейкоцитурия, оксалурия. Анализ мочи по Нечипоренко: лейкоциты - 25.500 в 1 мл (нейтрофилы 82%, лимфоциты 18%), эритроциты - 1000 в 1 мл. Бактериологическое исследование мочи: Е. coli 100000 КОЕ в 1 мл, чувствительна к цефтриаксону, цефтазидиму, гентамицину, норфлоксацину. Снижена антикристаллобразующая способность мочи к оксалатам кальция. По результатам исследования клиренса по эндогенному креатинину, анализа мочи по Зимницкому - функция почек сохранена.
УЗИ почек и мочевого пузыря: неоднородность центрального эхокомплекса за счет гиперэхогенных сигналов, нарушено соотношение паренхимы и чашечно-лоханочной системы справа, эхопризнаки воспалительного процесса правой почки. Экскреторная урография: выделение контрастного вещества не нарушено, отмечается сглаженность форниксов правой почки. Консультация гинеколога: признаков воспаления наружных половых органов не выявлено.
Уровень экспрессии молекул адгезии CD11β лимфоцитами периферической крови 14,00%, молекул CD54 - 15,00%.
Диагноз. Хронический вторичный (дисметаболический) пиелонефрит, рецидивирующее течение, активная стадия. Функция почек сохранена.
Данные показывают, что молекулы CD11β и CD54 могут служить дополнительным критерием дифференциальной диагностики ХП.
Способ диагностики хронического пиелонефрита у детей по уровню экспрессии молекул адгезии CD11β и CD54 лимфоцитами периферической крови был апробирован на 38 детях с предварительным диагнозом хронический пиелонефрит, поставленным на основании клинических признаков (основная группа). Группу сравнения составили 14 детей с диагнозом острый пиелонефрит, контрольную группу - 30 детей с первой группой здоровья, с нормальными анализами крови и мочи.
Всем обследованным производился забор крови и определение уровня экспрессии молекул CD11β и CD54 лимфоцитов периферической крови перечисленным выше способом.
Результаты проведенного исследования представлены в таблице 1. Для обработки полученного материала и проведения статистического анализа в исследованных группах была использована программа статистической обработки информации «STATGRAPHICS PLUS». Вычисляли среднюю и ошибку средней (М±m). Сравнение в исследованных группах проводили попарно при помощи параметрических методов, так как изучаемые выборки могли быть аппроксимированы нормальным законом распределения. Сравнение осуществляли с помощью критериев Стьюдента (t) (сравнение средних) и Фишера (сравнение средних квадратических отклонений). Уровень достоверности оценивали значением р. Различия при сравнении считали достоверными с вероятностью более 95% при Р<0,05.
| Таблица 1 | |||||
| СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ ХРОНИЧЕСКОГО ПИЕЛОНЕФРИТА У ДЕТЕЙ | |||||
| Хронический пиелонефрит (n=38) | Острый пиелонефрит (n=14) | Здоровые (n=30) | |||
| М±m (min, max) | M±m (min, max) | M±m (min, max) | |||
| CD11β (%) | CD54 (%) | CD11β (%) | CD54 (%) | CD11β (%) | CD54 (%) |
| 15,30±0,94* | 15,65±0,55* | 30,10±1,88* | 37,00±1,87* | 18±0,17* | 22±0,21* |
| (13,42-17,18) | (14,55-16,75) | (26,34-33,86) | (33,26-40,74) | (17,66-18,34) | (21,79-22,41) |
| Примечание: * - р<0,05 - достоверность различия в группах при сравнении. |
Молекулы адгезии CD11β (Мас-1, интегрин, рецептор iC3b) и CD54 (ICAM-1, лиганд для LFA-1 и Mac-1) индуцируются медиаторами воспаления, такими как IL-1, TNFα и IFNγ. Взаимодействие лейкоцитарного β2-интегрина с ICAM-1 имеет важное значение в регуляции отдельного этапа адгезии лейкоцитов и их трансэндотелиальной миграции. ICAM-1 и его рецептор LFA-1 являются дополнительными факторами активации Т-лимфоцитов.
У здоровых детей молекулы адгезии CD11β экспрессируют не менее 17,66% лимфоцитов периферической крови, молекулы CD54 - не менее 21,79%. У детей, больных острым пиелонефритом, молекулы адгезии CD11β экспрессируют не менее 26,34% лимфоцитов периферической крови, молекулы CD54 - не менее 33,26%.
Полученные данные показали, что при ХП уровень молекул адгезии CD11β и CD54 лимфоцитов периферической крови достоверно снижается по сравнению с уровнем у детей с ОП и контрольной группой, следовательно, уровень экспрессии молекул CD11β и CD54 лимфоцитами периферической крови можно считать высоко чувствительным маркером при ХП.
Использование предложенного способа диагностики имеет следующие преимущества:
1) высокую информативность для дифференциальной диагностики ХП;
2) быструю диагностику;
3) обеспечивает своевременное и рациональное проведение комплекса терапевтических мероприятий.
Способ диагностики хронического пиелонефрита, включающий исследование периферической крови, отличающийся тем, что определяют степень экспрессии лимфоцитами молекул адгезии CD11β и CD54 методом непрямой иммунофлюоресценции с помощью моноклональных антител и при содержании молекул CD11β менее 17,18% и молекул CD54 менее 16,75% считают наличие хронического течения пиелонефрита подтвержденным.
