Способ определения осмотической резистентности эритроцитов

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике. Способ включает исследование крови и количественное определение степени гемолиза в растворах натрия хлорида различной концентрации, при этом измеряют оптическую плотность надосадочных жидкостей трех проб капиллярной крови: с дистиллированной водой, с 0,9% раствором натрия хлорида и с 0,45% раствором натрия хлорида на спектрофотометре при длине волны 414 нм в кювете с длиной поглощающего слоя 1 см против дистиллированной воды, оценивают степень гемолиза при исходном физиологическом физико-химическом состоянии мембран эритроцитов в 0,9% растворе натрия хлорида и при осмотической нагрузочной пробе в 0,45% растворе натрия хлорида по сравнению со степенью гемолиза в пробе с дистиллированной водой, которую принимают за 100%, и при значении степеней гемолиза 1,61±0,23% в 0,9% растворе натрия хлорида и 25,16±1,83% в 0,45% растворе натрия хлорида осмотическую резистентность эритроцитов интерпретируют как нормальную. Изобретение обеспечивает выявление гемолитических состояний при скрининговых исследованиях. 1 табл.

 

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике.

Определение осмотической резистентности эритроцитов (ОРЭ) является одним из наиболее доступных в лабораторной диагностике методом оценки физико-химических свойств мембран эритроцитов. Изменения ОРЭ наблюдаются при ряде заболеваний, так при гемолитических анемиях (наследственная микросфероцитарная, аутоиммунная) значения этого показателя снижаются, при талассемии, гемоглобинопатиях, механической желтухе - повышаются.

В качестве прототипа авторы предлагают способ определения ОРЭ в модификации Л.И.Идельсона (Медицинские лабораторные технологии. Справочник в 2-х томах / Под редакцией профессора А.И.Карпищенко. - Санкт-Петербург: Интермедика, 2002. - Т.1. - 408 с., ил.). Сущность метода состоит в том, что эритроциты под воздействием растворов с различной концентрацией натрия хлорида способны к разрушению в зависимости от своей осмотической стойкости. Метод основан на количественном определении степени гемолиза в забуференных гипотонических растворах хлорида натрия, в которых, как известно, происходит набухание и гемолиз эритроцитов. Способ заключается в приготовлении основного раствора, который по осмотической концентрации соответствует 10% раствору хлорида натрия с рН 7,4, для чего в 2 литрах дистиллированной воды растворяют 27,31 г натрия фосфата двузамещенного безводного (Na₂HPO₄) или 34,23 г двухводного (Na₂HPO₄·2Н₂O), 4,86 г натрия фосфата однозамещенного двухводного (NaH₂PO₄·2Н₂О) и 180 г натрия хлорида (NaCl). Раствор можно хранить в закрытой посуде в холодильнике в течение нескольких месяцев. Основной раствор разводят в 10 раз дистиллированной водой, получают раствор, по своей осмотической концентрации соответствующий 1% раствору хлорида натрия. Из этого раствора готовят 14 рабочих растворов, соответствующих растворам хлорида натрия следующих концентраций: 1%, 0,85%, 0,75%, 0,70%, 0,65%, 0,60%, 0,55%, 0,50%, 0,45%, 0,40%, 0,35%, 0,30%, 0,20%, 0,10%. Рекомендуют готовить по 100 мл каждого рабочего раствора, которые при хранении в холодильнике пригодны в течение двух недель. В две стерильные пробирки с 2 каплями гепарина (500 Ед.) вносят по 1,5 мл венозной крови, перемешивают и одну их них используют для исследования, а вторую оставляют на сутки в термостате при 37°С. В 14 центрифужных пробирок помещают по 5,0 мл всех рабочих растворов натрия хлорида от 1% до 0,10%. Затем в каждую пробирку вносят по 0,02 мл гепаринизированной венозной крови и перемешивают. Пробирки инкубируют в течение 30 минут при комнатной температуре, а затем их центрифугируют в течение 5 минут при 2000 оборотов в минуту. Оптическую плотность надосадочных жидкостей из каждой пробирки измеряют на фотоэлектроколориметре при длине волны 500-560 нм (зеленый светофильтр) в кювете с толщиной поглощающего слоя 1 см. В качестве холостой пробы используют надосадочную жидкость из пробирки, содержащей 1% раствор натрия хлорида. ОРЭ, выраженную в процентах, определяют путем расчета степени гемолиза в каждой пробирке, приняв за 100% степень гемолиза оптическую плотность супернатанта в пробирке с 0,1% раствором натрия хлорида. Вычисляют процент гемолиза в каждой пробирке, сравнивая величину экстинкции надосадочной жидкости с экстинкцией, принятой за 100%, по формуле

100·E_x/E₁,

где: E₁ - экстинкция надосадочной жидкости в пробирке с 0,1% раствором хлорида натрия,

E_x - экстинкция исследуемой пробы,

100 - полный гемолиз в пробирке с 0,1% раствором хлорида натрия.

Аналогичное исследование со второй порцией крови, инкубированной сутки в термостате, выполняют на следующий день.

У здоровых людей в свежей крови гемолиз (минимальная резистентность эритроцитов) начинается при концентрации хлорида натрия 0,50-0,45%, а полный гемолиз (максимальная резистентность эритроцитов) наблюдается в 0,40-0,35% растворе хлорида натрия.

К недостаткам прототипа относятся:

- необходимость использования венозной крови в объеме 3 мл;

- трудоемкость приготовления 14 растворов с различными концентрациями натрия хлорида, что требует существенных затрат времени, большого расхода реактивов и сопряжено с возможными неточностями в навесках солей, измерении объемов растворителя, что может сказаться на точности получения необходимых концентраций растворов;

- использование двукратно 14 рабочих пробирок с кровью требует соответствующего количества лабораторной посуды, количества измерений на фотоэлектроколориметре, что увеличивает время выполнения теста, время дезинфекции, мойки лабораторной посуды, расхода дезинфицирующих средств;

- необходимость повторной постановки теста на следующий день со второй порцией крови, инкубированной сутки в термостате, и использование результатов этого повторного исследования не известно;

- для определения малых концентраций гемоглобина применяемая для фотометрии длина волны 500-560 нм не дает достаточную чувствительность измерения, так как миллимолярный коэффициент экстинкции гемоглобина при этой длине волны ниже, чем при другой длине волны;

- при интерпретации результатов учитываются только концентрации натрия хлорида, вызывающие начало появления гемолиза (минимальная резистентность эритроцитов) и полный гемолиз (максимальная резистентность эритроцитов), тогда как степени гемолиза при всех рабочих концентрациях натрия хлорида рассчитываются, но не учитываются при оценке результатов.

Авторы предлагают способ определения осмотической резистентности эритроцитов капиллярной крови с использованием аптечных растворов - изотонического раствора натрия хлорида (0,9% раствор NaCl), воды для инъекций (дистиллированная вода), которые используются самостоятельно, а также для приготовления 0,45% раствора натрия хлорида.

Техническим результатом предлагаемого способа определения осмотической резистентности эритроцитов капиллярной крови является выявление гемолитических состояний по оценке физико-химических свойств мембран эритроцитов при скрининговых исследованиях.

Авторы предлагают определять ОРЭ капиллярной крови в 0,45% и 0,9% растворах натрия хлорида. Проведение исследования с использованием изотонического 0,9% раствора натрия хлорида, являющегося физиологическим для организма человека, характеризует исходное физико-химическое состояние мембран эритроцитов. Однако определение ОРЭ только с 0,9% раствором натрия хлорида недостаточно для ее полной характеристики. Концентрация 0,45% NaCl выбрана на основании результатов проведенных многочисленных определений ОРЭ с использованием прототипной технологии. Было выявлено, что конфигурация кривых динамики гемолиза различных образцов крови однотипна, и что основные различия наблюдаются при концентрациях 0,4%-0,6% натрия хлорида. Проведение исследования с использованием 0,45% раствора натрия хлорида является осмотической нагрузочной пробой, которая характеризует степень резистентности, то есть резервные возможности, мембран эритроцитов при изменении осмотического давления.

По данным литературы (Кушаковский М.С. Клинические формы повреждения гемоглобина: этиология, патогенез, спектрофотометрические и биохимические методы исследования, диагностика, лечение. - Л.: Медицина, 1968, - 325 с.) в видимой области спектра поглощения гемоглобина среди трех хорошо заметных полос имеется наиболее интенсивная полоса (Soret) в области 400-430 нм с максимумом поглощения при длине волны 414 нм, при которой миллимолярный коэффициент экстинкции максимальный, что позволяет обеспечить необходимую чувствительность определения экстинкции при измерении малых концентраций гемоглобина, поэтому авторы предлагают использовать для исследования степени гемолиза при определении осмотической резистентности эритроцитов длину волны 414 нм.

Для определения осмотической резистентности эритроцитов используют капиллярную кровь, взятую для клинического анализа крови в пробирку с калиевой солью ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота). Для исследования используют три центрифужные пробирки. В первую пробирку помещают 2,5 мл дистиллированной воды, во вторую - 2,5 мл изотонического раствора натрия хлорида, в третью - по 1,25 мл дистиллированной воды и изотонического раствора натрия хлорида (для получения 0,45% NaCl).

Ингредиенты	1 пробирка	2 пробирка	3 пробирка
Дистиллированная вода	2,5 мл	-	1,25 мл
Изотонический (0,9%) раствор NaCl	-	2,5 мл	1,25 мл
Капиллярная кровь	0,01 мл	0,01 мл	0,01 мл

Затем во все пробирки добавляют по 0,01 мл капиллярной крови. Перемешивают и центрифугируют в течение 10 минут при 2000 оборотов в минуту. Измеряют оптическую плотность надосадочных жидкостей трех проб на спекторофотометре при длине волны 414 нм в кювете с длиной поглощающего слоя 1 см против дистиллированной воды.

ОРЭ оценивают по степени гемолиза эритроцитов в растворах с разной концентрацией натрия хлорида по сравнению со степенью гемолиза в образце с дистиллированной водой, который принимали за 100%, принимая во внимание, что оптическая плотность надосадочных жидкостей образцов имеет прямую зависимость от степени гемолиза.

Степень гемолиза рассчитывали дважды в образцах с 0,9% и 0,45% растворами натрия хлорида по формуле

Н=100·E_оп./Е_к.,

где Н - степень гемолиза (%),

100 - степень гемолиза в образце с дистиллированной водой,

E_оп. - оптическая плотность надосадочной жидкости в образце,

Е_к. - оптическая плотность надосадочной жидкости в пробирке с дистиллированной водой.

Применив предлагаемый способ определения ОРЭ в группе 70 здоровых людей, определена осмотическая резистентность эритроцитов капиллярной крови, которая составила в исходном, физиологическом для эритроцитов состоянии в 0,9% растворе натрия хлорида - 1,61±0,23%, а при осмотической нагрузочной пробе в 0,45% растворе натрия хлорида - 25,16±1,83%.

Авторы исследовали с помощью клинического анализа капиллярную кровь 122 человек с клиническими признаками анемии для подтверждения диагноза заболевания. Для уточнения генеза заболевания для всех образцов было проведено определение ОРЭ. У 5 человек были выявлены отклонения ОРЭ, которые составили 10,13±1,57% в 0,9% растворе натрия хлорида и 93,58±3,08% в 0,45% растворе натрия хлорида, что послужило основанием для установления наличия гемолитического состояния, назначения дополнительных подтверждающих исследований и адекватной терапии.

Очевидными преимуществами предлагаемого авторами способа определения осмотической резистентности эритроцитов являются:

- использование 30 мкл капиллярной крови, что позволяет использовать пробу крови, полученную для клинического анализа без дополнительного взятия крови;

- способ технически прост и позволяет соблюсти точность концентраций натрия хлорида, так как готовят только один раствор 0,45% натрия хлорида, используя аптечные растворы изотонического раствора натрия хлорида и дистиллированную воду;

- применение способа при скрининговых исследованиях для выявления гемолитических состояний;

- способ экономически выгоден, так как позволяет сократить рабочее время персонала на приготовление растворов, измерение оптических плотностей, мойку лабораторной посуды, количество дезинфицирующих средств.

Способ определения осмотической резистентности эритроцитов, включающий исследование крови и количественное определение степени гемолиза в растворах натрия хлорида различной концентрации, отличающийся тем, что измеряют оптическую плотность надосадочных жидкостей трех проб капиллярной крови: с дистиллированной водой, с 0,9%-ным раствором натрия хлорида и с 0,45%-ным раствором натрия хлорида на спектрофотометре при длине волны 414 нм в кювете с длиной поглощающего слоя 1 см против дистиллированной воды, оценивают степень гемолиза при исходном физиологическом физико-химическом состоянии мембран эритроцитов в 0,9%-ном растворе натрия хлорида и при осмотической нагрузочной пробе в 0,45%-ном растворе натрия хлорида по сравнению со степенью гемолиза в пробе с дистиллированной водой, которую принимают за 100%, и при значении степеней гемолиза 1,61±0,23% в 0,9%-ном растворе натрия хлорида и 25,16±1,83% в 0,45%-ном растворе натрия хлорида осмотическую резистентность эритроцитов интерпретируют как нормальную.