Способ получения средства, обладающего противовоспалительной активностью
Владельцы патента RU 2331429:
Институт общей и экспериментальной биологии Сибирского Отделения Российской Академии Наук (ИОЭБ СО РАН) (RU)
Изобретение относится к области фармации и касается способа получения средства, обладающего противовоспалительной активностью, путем экстрагирования растительной смеси, содержащей, мас.ч.: черные листья бадана толстолистного - 3,0; цветы ромашки аптечной - 2,8; траву тысячелистника обыкновенного - 2,4; листья мяты перечной - 1,8. Растительную смесь, измельченную до размера частиц 0,5-2,0 мм, дважды экстрагируют 80%-ным этанолом при комнатной температуре при соотношении сырье:экстрагент 1:(10-12) в течение 2 ч, затем дважды 40%-ным этанолом при температуре 90±5°С в течение 1 ч, отфильтрованные спиртовые извлечения упаривают, объединяют, концентрируют, высушивают в вакуум-сушильном шкафу для получения сухого экстракта. Полученное средство проявляет выраженную противовоспалительную активность. 10 табл.
Изобретение относится к фармации и касается способа получения средства из растительного сырья, обладающего противовоспалительной активностью.
Воспаление, как общебиологическая реакция на различные патогенные раздражители, лежит в основе многочисленной группы заболеваний и нередко приводит к потере трудоспособности и инвалидизации населения. Применение синтетических препаратов с противовоспалительным действием в эксперименте и клинике сопровождается развитием выраженных побочных реакций и осложнений. Недостатки используемых средств и возрастающие требования современной терапии актуализируют изыскание новых, эффективных и малотоксичных антифлогистиков среди лекарственных растений, которые могли бы оказывать комплексное действие, обеспечивать пролонгированный эффект с минимумом побочных явлений и возможностью длительного применения.
Целью предлагаемого способа является повышение выхода экстрактивных веществ за счет использования смеси из широко распространенных видов растительного сырья. Технический результат изобретения - получение средства из смеси растительного состава, обладающего противовоспалительной активностью.
Указанная цель достигается посредством того, что способ включает экстракцию 80%-ным и 40%-ным раствором этанола высушенной и измельченной до размера частиц 0,5-2,0 мм смеси следующего растительного состава:
черные листья бадана толстолистного - 3,0 ч.
цветки ромашки аптечной - 2,8 ч.
трава тысячелистника обыкновенного - 2,4 ч.
листья мяты перечной - 1,8 ч.
Растительную смесь экстрагируют дважды 80% этанолом в соотношении сырье:экстрагент 1:(10-12) при комнатной температуре и постоянном помешивании в течение 2 ч. Спиртовые извлечения объединяют, удаляют спирт, оставшийся шрот экстрагируют дважды 40% этанолом при 90±5°С в соотношении сырье:экстрагент 1:(10-12) при постоянном помешивании в течение 1 ч. Спиртовые извлечения объединяют, удаляют спирт, водный экстракт объединяют с водным остатком после экстракции 80% этанолом, концентрируют до 1/5 первоначального объема. Конечный продукт получают сепарированием и затем высушиванием сгущенного экстракта в вакуум-сушильном шкафу. Предлагаемый способ получения суммы экстрактивных веществ достаточно прост, не требует трудоемких затрат, позволяет получить продукт постоянного состава.
Выявленные отличительные признаки позволяют сделать вывод о соответствии предлагаемого способа критерию «новизна». Для доказательства существенности предложенных признаков способа, а именно концентрации экстрагента, соотношения сырье:экстрагент, длительности и кратности процесса экстракции были проведены серии экспериментов, данные которых представлены ниже.
Измельчение сырья проводили согласно требованиям ГФ XI издания. Выбор оптимальных параметров экстракции контролировали по выходу действующих веществ - каротиноидов и полифенолов. Содержание каротиноидов в извлечениях определяли спектрофотометрическим [О.В.Евдокимова, И.А.Самылина, О.В.Нестерова. Определение содержания], полифенолов (дубильных веществ) - титриметрическим [Государственная Фармакопея СССР: Вып.1. Общие методы анализа. МЗ СССР. - 11-е изд., доп. - М.: Медицина. - 1987. - 337 с.] методами.
Для определения полноты извлечения экстрактивных веществ из растительной смеси проведена последовательная исчерпывающая экстракция смеси растворителями разной полярности в аппарате Сокслета. Для этого 30,0 г растительной смеси, измельченной до размера частиц 0,5 мм, поместили в пакетик из фильтровальной бумаги, пакетик поместили в аппарат Сокслета, экстрагировали последовательно гексаном, хлороформом, 96% этанолом, 40% этанолом и кипящей водой до полного истощения сырья. Получено 0,86 г (2,87%) маслянистого остатка гексанового: 2,61 г (8,7%), маслянистого хлороформного: 6,37 г (21,23%), маслянистого 96% спиртового: 4,33 г (14,43%), 40% спиртового и 1,44 г (4,80%) водного извлечения. Общий выход экстрагируемых липофильных и гидрофильных веществ составил 52,03%. Большая часть экстрактивных веществ (68,5% от суммы экстрагируемых всеми растворителями веществ) извлекается спиртом высокой и средней (96% и 40%) концентрации.
Для подбора типа экстрагента изучены процессы экстрагирования сырья горячей водой, этиловым спиртом различной концентрации: 20, 40, 60, 80, 96%. Результаты анализа приведены в таблице 1.
| Таблица 1 Влияние концентрации экстрагента на выход каротиноидов и полифенолов | |||
| Экстрагент | Выход экстрактивных веществ, % | Выход каротиноидов, мг % | Выход полифенолов, % |
| Вода (90-100°С) | 32,07 | - | 4,32 |
| Этанол 20% | 30,07 | - | 4,68 |
| 40% | 30,01 | 0,22 | 5,64 |
| 60% | 27,34 | 0,73 | 5,30 |
| 80% | 24,20 | 4,76 | 3,48 |
| 96% | 9,7 | 5,98 | 2,01 |
| Примечание: прочерк означает, что вещества не обнаружены. |
Установлено, что каротиноиды наиболее полно извлекаются спиртом высокой концентрации - 80-96% этанолом, а 40% этанол экстрагирует максимальное количество полифенолов. Извлечения, полученные экстракцией 96% спиртом после удаления спирта, представляют собой маслянистую массу, плохо смешивающуюся с водным остатком 40%-ного этанольного извлечения. Для извлечения каротиноидов выбран 80% этанол, для полифенолов - 40% этанол.
Для изучения влияния степени измельчения растительной смеси на выход каротиноидов и полифенолов смесь измельчали до размера частиц, проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 0,5; 1,0; 2,0; 3,0; 5,0 мм. Установлено, что оптимальной степенью измельчения для растительной смеси является размер частиц 0,5-2,0 мм (табл.2).
| Таблица 2 Выход каротиноидов и полифенолов в зависимости от степени измельчения сырья | ||
| Степень измельчения сырья, мм | Выход каротиноидов, мг % | Выход полифенолов, % |
| 0,5 | 5,08 | 6,28 |
| 1,0 | 4,87 | 5,82 |
| 2,0 | 4,71 | 5,62 |
| 3,0 | 4,02 | 5,16 |
| 5,0 | 3,25 | 4,72 |
Проведено изучение зависимости выхода действующих веществ от соотношения сырье:экстрагент, данные анализа представлены в таблице 3. Оптимальное соотношение составляет 1:(10-12), дальнейшее увеличение объема экстрагента нецелесообразно, так как выход действующих веществ существенно не повышается.
| Таблица 3 Выход каротиноидов и полифенолов в зависимости от соотношения сырье:экстрагент | ||
| Соотношение сырье:экстрагент | Выход каротиноидов, мг % | Выход полифенолов, % |
| 1:8 | 4,71 | 4,42 |
| 1:10 | 4,91 | 5,01 |
| 1:11 | 4,98 | 5,94 |
| 1:12 | 5,13 | 6,34 |
| 1:15 | 5,20 | 6,45 |
| 1:20 | 5,82 | 6,93 |
Изучена зависимость выхода полифенолов от температуры экстракции. Настаивание смеси проводили при температуре 40; 60; 80; 90; 100 (кипящая водяная баня) °С. Оптимальный температурный режим экстракции составляет 90±5°С, при котором достигается максимальный выход полифенолов (табл.4). Учитывая термолабильность каротиноидов, извлечение их проводят при комнатной температуре.
| Таблица 4 Выход полифенолов в зависимости от температуры экстракции | |
| Температура экстракции, °С | Выход полифенолов, % |
| 40±5 | 4,72 |
| 60±5 | 5,25 |
| 80±5 | 5,75 |
| 90±5 | 5,94 |
| 100 (кипящая водяная баня) | 6,03 |
Продолжительность настаивания и кратность числа экстракции определены отдельно для экстракции 80% и 40% этанолом (табл.5-6).
1. Экстракция растительной смеси 80% этанолом. К 5,0 г (точная навеска) смеси приливали 50 мл 80% этанола, экстрагировали в течение 2 ч при постоянном помешивании на механической мешалке. Через определенный промежуток времени (1 ч; 2 ч; 4 ч; 6 ч) извлечение фильтровали (I контакт фаз). В тех же условиях проводили последующие 2 экстракции шрота, добавляя каждый раз 80% этанол в объеме, равном слитому (II и III контакт фаз). В извлечениях определяли содержание каротиноидов. Установлено, что при постоянном помешивании в течение 2 ч растительной смеси извлекается до 75% каротиноидов, при втором контакте фаз - 21% (табл.5). Для полноты извлечения каротиноидов достаточно двукратной экстракции 80% этанолом в течение 2 ч при постоянном помешивании.
| Таблица 5 Выход каротиноидов в зависимости от времени и кратности экстракции | |||
| Время экстракции, час | Выход каротиноидов, мг % | ||
| I контакт фаз | II контакт фаз | III контакт фаз | |
| 1 ч | 3,32 | 1,24 | 0,60 |
| 2 ч | 5,07 | 1,41 | 0,25 |
| 4 ч | 5,17 | 1,40 | 0,20 |
| 6 ч | 5,21 | 1,44 | 0,19 |
2. Экстракция 40% этанолом. К 5,0 г (точная навеска) смеси приливали 50 мл 40% этанола, колбу присоединяли с обратным холодильником, экстрагировали на водяной бане при температуре 90±5°С. Через определенный промежуток времени (0,5 ч; 1 ч; 1,5 ч; 2 ч, 2,5 ч; 3,0 ч) извлечение фильтровали (I контакт фаз). В тех же условиях провели последующие 2 экстракции шрота, прибавляя каждый раз 40% этанол в объеме, равном слитому (II и III контакт фаз). В извлечениях определяли содержание полифенолов. Установлено, что 40% этанол при температуре 90±5°С в течение 1 ч извлекает до 79% полифенолов, при втором контакте фаз - 16%, при третьем - 5% (табл.6). Для полноты извлечения полифенолов достаточно двукратной экстракции 40% этанолом в течение 1 ч при температуре 90±5°С.
В результате проведенных анализов установлено, что оптимальными условиями экстрагирования растительной смеси являются: 80% этанол для извлечения каротиноидов при комнатной температуре, 40% этанол для извлечения полифенолов при температуре 90±5°С, соотношение сырье:экстрагент - 1:(10-12), степень измельчения сырья - 0,5-2,0 мм, кратность экстракции - 4 (по две экстракции 80%-ным в течение 2 ч каждая и 40%-ным этанолом в течение 1 ч каждая).
| Таблица 6 Выход полифенолов в зависимости от времени и кратности экстракции | |||
| Время экстракции, час | Выход полифенолов, % | ||
| I контакт фаз | II контакт фаз | III контакт фаз | |
| 0,5 ч | 4,80 | 0,91 | 0,35 |
| 1,0 ч | 5,75 | 1,16 | 0,29 |
| 1,5 ч | 5,73 | 1,13 | 0,21 |
| 2,0 ч | 5,66 | 1,23 | 0,33 |
| 2,5 ч | 5,76 | 1,21 | 0,34 |
| 3,0 ч | 5,81 | 1,36 | 0,27 |
Предлагаемый способ позволяет получить продукт постоянного состава с выраженной противовоспалительной активностью, что обусловливается большим содержанием липофильных и гидрофильных веществ. В полученных сухих экстрактах определено содержание каротиноидов, аскорбиновой кислоты, флавоноидов в пересчете на рутин, антоцианов в пересчете на цианидин-3,5-дигликозид, полифенолов по методикам ГФ XI изд. Полученный по предложенному способу сухой экстракт (условно названный «Фитокол») представляет собой негигроскопичный порошок темно-коричневого цвета со специфическим запахом, содержит 9,77±0,17% полифенолов в пересчете на таннин; 16,29±0,07 мг % каротиноидов в пересчете на β-каротин; 6,58±0,05% аскорбиновой кислоты; 1,35±0,01% антоцианов в пересчете на цианидин-3,5-дигликозид; 0,14±0,01% флавоноидов в пересчете на рутин.
Примеры конкретного выполнения способа
Пример 1. 1000 г растительной смеси, состоящей из 300 г черных листьев бадана толстолистного, 280 г цветков ромашки аптечной, 240 г травы тысячелистника обыкновенного, 180 г листьев мяты, измельченных до размера частиц 0,5 мм, загружали в экстрактор, заливали 10,0 л 80% этилового спирта, экстрагировали при комнатной температуре и постоянном помешивании в течение 2 ч. Извлечение сливали в сборник, отфильтровывали под вакуумом. Объем слива - 7,87 л, шрот заливали 80% спиртом в объеме, равном слитому, и экстрагировали в тех же условиях в течение 2 ч. Второе извлечение отфильтровывали, объем II слива - 7,60 л. Объединенный 80% спиртовый экстракт (15,47 л) упаривали на роторном испарителе для удаления спирта. Оставшийся шрот заливали 10,0 л 40% этилового спирта, экстрагировали при температуре 90±5°С в течение 1 ч при постоянном помешивании. Третье извлечение сливали, отфильтровывали под вакуумом, объем слива - 9,80 л. Шрот заливали 40% этиловым спиртом в объеме, равном слитому, и экстрагировали в тех же условиях в течение 1 ч. Четвертое извлечение сливали, отфильтровывали, объем слива - 9,70 л. Объединенный 40% этанольный экстракт (19,50 л) упаривали на роторном испарителе для удаления спирта, водный остаток объединяли с водным остатком 80% этанольного экстракта, очищали на сепараторе от балластных веществ и растительной пыли. Кубовой остаток от четырех извлечений упаривали до сиропообразного состояния (1,5 л), высушивали в вакуум-сушильном шкафу в течение 8 ч при температуре 60±5°С. Получили 350,0 г сухого экстракта темно-коричневого цвета, выход - 35,0% от массы исходного сырья. Потеря в массе при высушивании - 3,45%.
Изучение острой токсичности водного раствора фитокола при однократном внутрибрюшинном и внутрижелудочном способе введения проводили на крысах обоего пола линии Wistar массой 140-150 г с использованием пробит-анализа по Литчфильду и Уилкоксону [Беленький М.Л. Элементы количественной оценки фармакологического эффекта. - Л., 1963. - С.81-107]. Наблюдение за общим состоянием животных и их поведением осуществляли в течение 14 дней. Одновременно регистрировали наблюдаемые признаки интоксикации: общее состояние животных, особенности их поведения, интенсивность и характер двигательной активности, наличие судорог, нарушение координации движений, изменение тонуса скелетных мышц, реакцию на тактильные, звуковые и световые раздражители, частоту и глубину дыхательных движений, ритм сердечных сокращений, состояние шерстного покрова, окраску слизистых оболочек, размер зрачка, потребление корма, частоту мочеиспускания и окраску мочи. Также регистрировали сроки развития интоксикации и гибели животных. Погибших в эксперименте животных вскрывали и проводили макроскопический осмотр внутренних органов, а также осуществляли патоморфологическое исследование жизненно важных органов (степень кровенаполнения органов, наличие изъязвлений слизистых оболочек и др.).
В результате проведенных исследований установлено, что при однократном внутрибрюшинном введении фитокола DL50 составляла 2500 мг/кг (2440,1÷2670). Животные погибали преимущественно через 1-3 суток с момента введения испытуемого фитоэкстракта. В первые часы после введения фитокола в высоких дозах наблюдались признаки интоксикации в виде тахикардии, учащения дыхания, снижения двигательной активности, потери аппетита. В последующем у животных, получавших высокие дозы испытуемого фитоэкстракта, дыхание становилось поверхностным, появлялась цианостичность видимых слизистых оболочек, подергивания отдельных групп мышц, а также развивались судороги клонико-тонического характера. Гибель животных наступала при остановке дыхания. При макроскопическом и микроскопическом осмотре внутренних органов погибших крыс отмечались гемодинамические нарушения во внутренних органах в виде полнокровия сосудов с явлениями стаза, мелкоточечных кровоизлияний под плевру легких и эпикард, в легких встречались крупные и мелкие геморрагические участки, по краям легких наблюдали явления очаговой эмфиземы.
При однократном внутрижелудочном введении фитокола во всех исследованных дозах (от 500 до 8000 мг/кг) гибели животных в течение всего периода наблюдения (14 суток) не отмечали. Максимальная доза фитокола составила 8000 мг/кг (максимальное количество испытуемого фитосредства, растворение которого возможно в объеме воды, исходя из расчета 10 мл/кг). При введении высоких доз фитокола (7500 - 8000 мг/кг) в течение первых двух суток у животных наблюдали признаки общей интоксикации в виде гиподинамии, потери аппетита, незначительного учащения дыхания. В последующие дни наблюдения признаки интоксикации животных не регистрировались и DL50 установить не удавалось.
Таким образом, при внутрижелудочном введении фитокол характеризуется хорошей переносимостью и относится к малотоксичным веществам - IV классу токсичности по классификации токсичности химических веществ, принятой в России и ВОЗ [Сидоров К.К. О классификации токсичности ядов при парентеральных способах введения. // Токсикология новых промышленных химических веществ. - М., 1973. - Вып.13. - С.47-51].
В дальнейшем исследовали противовоспалительную активность фитокола с использованием моделей асептического воспаления, позволяющих оценить его влияние на основные стадии воспалительного процесса: экссудацию, альтерацию и регенерацию. Также исследовали анальгезирующее действие фитокола.
Полученные данные обработаны статистически с использованием U-критерия Манна-Уитни [Сергиенко В.И., Бондарева И.Б. Математическая статистика в клинических исследованиях. - М., 2000. - 263 с.]. Различия считали достоверными при Р≤0,05.
Изучено влияние фитокола на экссудативную фазу воспалительного процесса.
Антиэкссудативную активность фитокола определяли на модели острого асептического воспаления задней конечности крыс с применением флогогенного агента формалина. Исследование проведено на крысах обоего пола линии Wistar массой 160-170 г. Воспроизведение острого асептического воспаления конечности осуществляли по методу Ю.В.Стрельникова [Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. - М., 2005. - 832 с.]. Фитокол вводили внутрижелудочно в дозах 250 (1/10 DL50), 200 и 150 мг/кг в объеме 10 мл/кг за 3 часа до субплантарного введения крысам в правую заднюю лапку 0,1 мл 3% раствора формалина, а затем через 5 и 18 часов после этого. Животным контрольной группы по аналогичной схеме в равном объеме вводили воду очищенную. В качестве препарата сравнения использовали сбор, состоящий из травы зверобоя продырявленного, листьев мяты перечной, цветков ромашки аптечной, плодов укропа огородного, корней и корневищ валерианы обыкновенной [Лебедев В.П. Клиническая фитотерапия. - Новосибирск, 2003. - 368 с.]. Указанный сбор назначали в виде отвара в объеме 10 мл/кг по аналогичной схеме. Через 24 часа после введения формалина проводили оценку антиэкссудативного эффекта фитокола онкометрическим методом с использованием формулы:
% угнетения отека = Рк-Р/Рк, где:
Рк - разность объема лапок с отеком и без отека у животных контрольной группы;
Р - разность объема лапок с отеком и без отека у животных опытной группы, получавших фитокол.
Полученные данные приведены в таблице 7.
| Таблица 7 Влияние фитокола на экссудативную фазу воспаления при формалиновом отеке лапок у крыс | |||
| Группы животных | Доза, мг/кг | Разность объема лапок с отеком и без отека, мл | % угнетения отека |
| Контрольная (формалин + вода очищенная) | - | 0,75±0,04 | - |
| Опытная 1 (формалин + фитокол) | 250 | 0,50±0,01* | 34,0 |
| Опытная 2 (формалин + фитокол) | 200 | 0,58±0,02* | 23,0 |
| Опытная 3 (формалин + фитокол) | 150 | 0,60±0,01* | 20,0 |
| Опытная 4 (формалин + калефлон) | 100 | 0,61±0,02* | 19,0 |
| *Примечание: - здесь и далее разность достоверна по сравнению с контролем при Р≤0,05 |
Из приведенных в таблице 7 данных следует, что фитокол в дозах от 150 до 250 мг/кг оказывает антиэкссудативное действие, снижая выраженность отечности лапок крыс на 20,0-34,0% по сравнению с показателями у крыс контрольной группы, причем наиболее выраженный антиэкссудативный эффект фитокола проявляется в дозе 250 мг/кг. В связи с этим в дальнейших исследованиях использовали указанную дозу фитокола. Препарат сравнения калефлон также оказывает антиэкссудативное действие, но в менее выраженной степени.
Пример 2. 1000 г растительной смеси, состоящей из 300 г черных листьев бадана толстолистного, 280 г цветков ромашки аптечной, 240 г травы тысячелистника обыкновенного, 180 г листьев мяты, измельченных до размера частиц 1,0 мм, загружали в экстрактор, заливали 11,0 л 80% этилового спирта, экстрагировали при комнатной температуре и постоянном помешивании в течение 2 ч. Извлечение сливали в сборник, отфильтровали под вакуумом. Объем слива - 8,50 л, шрот заливали 80% спиртом в объеме, равном слитому, и экстрагировали в тех же условиях в течение 2 ч. Второе извлечение отфильтровали, объем II слива - 8,90 л. Объединенный 80% спиртовый экстракт (16,80 л) упаривали на роторном испарителе для удаления спирта. Оставшийся шрот заливали 11,0 л 40% этилового спирта, экстрагировали при температуре 90±5°С в течение 1 ч при постоянном помешивании. Третье извлечение сливали, отфильтровали под вакуумом, объем слива - 10,60 л. Шрот заливали 40% этиловым спиртом в объеме, равном слитому, и экстрагировали в тех же условиях в течение 1 ч. Четвертое извлечение сливали, отфильтровали, объем слива - 10,20 л. Объединенный 40% этанольный экстракт (20,80 л) упарили на роторном испарителе для удаления спирта, водный остаток объединили с водным остатком 80% этанольного экстракта, очистили на сепараторе от балластных веществ и растительной пыли. Кубовой остаток от четырех извлечений упарили до сиропообразного состояния (1,6 л), высушили в вакуум-сушильном шкафу в течение 8 ч при температуре 60±5°С. Получили 323,0 г сухого экстракта темно-коричневого цвета, выход - 32,3% от массы исходного сырья. Потеря в массе при высушивании - 2,15%.
Изучено влияние фитокола на фазу альтерации воспалительного процесса. Опыты проведены на крысах обоего пола линии Wistar массой 150-170 г. Моделирование воспалительного процесса осуществляли по методу Менкина [Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. - М., 2005. - 832 с.] путем подкожного введения 0,5 мл 9% раствора уксусной кислоты (СН3СООН) в область спины с предварительно выстриженной шерстью. Одновременно с этим крысам внутрибрюшинно вводили раствор декстрана в дозе 300 мг/кг. Первое внутрижелудочное введение фитокола в дозе 250 мг/кг в объеме 10 мл/кг осуществляли за 1 час до введения уксусной кислоты, а затем ежедневно 1 раз в сутки в течение 25 дней. Животные контрольной группы получали воду очищенную по аналогичной схеме в эквиобъемных количествах. В качестве препарата сравнения использовали сбор, состоящий из травы зверобоя продырявленного, листьев мяты перечной, цветков ромашки аптечной, плодов укропа огородного, корней и корневищ валерианы обыкновенной [Лебедев В.П. Клиническая фитотерапия. - Новосибирск, 2003. - 368 с.]. Указанный сбор назначали в форме отвара в объеме 10 мл/кг по аналогичной схеме. На 2, 9 и 25 сутки эксперимента оценивали площадь некротизированной ткани планиметрическим методом. Полученные данные представлены в таблице 8.
| Таблица 8 Влияние фитокола на процессы альтерации и регенерации при остром асептическом воспалении у крыс | |||
| Группы животных | Площадь альтерации, см2 | ||
| 2 сутки | 9 сутки | 25 сутки | |
| Контрольная (СН3СООН + вода очищенная) | 3,35±0,03 | 2,99±0,05 | 1,41±0,01 |
| Опытная 1 (СН3СООН + фитокол) | 2,68±0,05* | 1,72±0,04* | 1,05±0,03* |
| Опытная 2 (СН3СООН + препарат сравнения) | 2,99±0,04 | 2,68±0,04 | 1,48±0,02 |
Как следует из данных, приведенных в таблице 8, введение фитокола в указанной дозе крысам оказывает антиальтеративное действие, снижая степень деструкции ткани при воздействии флогогенного агента уже на ранних сроках наблюдения. Так, через 2 и 9 суток после введения уксусной кислоты площадь альтерации уменьшается на 20 и 43% соответственно по сравнению с показателями у крыс контрольной группы. Препарат сравнения оказывает менее выраженное антиальтеративное действие.
Пример 3. 1000 г растительной смеси, состоящей из 300 г черных листьев бадана толстолистного, 280 г цветков ромашки аптечной, 240 г травы тысячелистника обыкновенного, 180 г листьев мяты, измельченных до размера частиц 2,0 мм, загружали в экстрактор, заливали 12,0 л 80% этилового спирта, экстрагировали при комнатной температуре и постоянном помешивании в течение 2 ч. Извлечение сливали в сборник, отфильтровывали под вакуумом. Объем слива - 9,45 л, шрот заливали 80% спиртом в объеме, равном слитому, и экстрагировали в тех же условиях в течение 2 ч. Второе извлечение отфильтровывали, объем II слива - 9,30 л. Объединенный 80% спиртовый экстракт (18,75 л) упаривали на роторном испарителе для удаления спирта. Оставшийся шрот заливали 12,0 л 40% этилового спирта, экстрагировали при температуре 90±5°С в течение 1 ч при постоянном помешивании. Третье извлечение сливали, отфильтровывали под вакуумом, объем слива - 11,80 л. Шрот заливали 40% этиловым спиртом в объеме, равном слитому, и экстрагировали в тех же условиях в течение 1 ч. Четвертое извлечение сливали, отфильтровывали, объем слива - 11,50 л. Объединенный 40% этанольный экстракт (23,30 л) упаривали на роторном испарителе для удаления спирта, водный остаток объединяли с водным остатком 80% этанольного экстракта, очищали на сепараторе от балластных веществ и растительной пыли. Кубовой остаток от четырех извлечений упаривали до сиропообразного состояния (1,5 л), высушивали в вакуум-сушильном шкафу в течение 8 ч при температуре 60±5°С. Получали 328,0 г сухого экстракта темно-коричневого цвета, выход - 32,8% от массы исходного сырья. Потеря в массе при высушивании - 2,07%.
Изучено влияние фитокола на пролиферативные процессы при воспалительном процессе. Эксперименты проведены на крысах линии Wistar обоего пола массой 170-180 г. Воспалительную реакцию вызывали по методу Тринус и соавт. [Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. - М., 2005. - 832 с.]: стерильные ватные шарики массой 15 мг имплантировали под кожу крыс в области спины в асептических условиях. Фитокол вводили внутрижелудочно в дозе 250 мг/кг в объеме 10 мл/кг 1 раз в сутки в течение 7 дней (опытная группа 1). Животным контрольной группы вводили в эквиобъемных количествах по аналогичной схеме воду очищенную В качестве препарата сравнения использовали сбор в форме отвара в объеме 10 мл/кг (опытная группа 2), состоящий из травы зверобоя продырявленного, листьев мяты перечной, цветков ромашки аптечной, плодов укропа огородного, корней и корневищ валерианы обыкновенной [Лебедев В.П. Клиническая фитотерапия. - Новосибирск, 2003. - 368 с.]. Через 7 суток извлекали гранулемы и проводили взвешивание на аналитических весах в сыром виде (сразу после извлечения) и после высушивания при температуре 70°С в течение 24 часов (до постоянной массы). Пролиферативную реакцию оценивали по разнице между массой сухой гранулемы и исходной массой ватного шарика (15 мг), а антиэкссудативную активность - по разнице между массой влажной и сухой гранулем. Полученные данные приведены в таблице 9.
| Таблица 9 Влияние фитокола на течение хронической пролиферативной фазы воспаления у крыс | ||
| Группы животных | Разница между массой сухой гранулемы и исходной массой ватного шарика, мг | Разница между массой влажной и сухой гранулем, мг |
| Контрольная | 40,20±1,61 | 235,22±6,31 |
| Опытная 1 | 38,23±1,64 | 264,00±8,27 |
| Опытная 2 | 38,64±2,04 | 223,23±10,21 |
В результате исследований установлено (табл.9), что фитокол в дозе 250 мг/кг практически не влияет на образование фиброзно-грануляционной ткани на фоне хронического пролиферативного воспаления у крыс
Изучали влияние фитокола на порог болевой чувствительности с использованием модели патологической боли «корчи» [Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. - М., 2005. - 832 с.]. В экспериментах использовали крыс обоего пола линии Wistar массой 160-170 г. Модель воспроизводили однократным внутрибрюшинным введением 0,75% раствора уксусной кислоты. Фитокол вводили крысам внутрь в дозе 250 мг/кг в объеме 10 мл/кг за 45-60 минут до введения уксусной кислоты. Контрольной группе крыс вводили воду очищенную в аналогичных условиях в эквиобъемных количествах. Через 10 минут после введения уксусной кислоты регистрировали количество специфических ноцицептивных ответов типа «корчи» у контрольных и опытных животных. Выраженность анальгезии оценивали по формуле:
А=(Рк-Ро)Рк×100%, где
А - коэффициент анальгезии;
Рк - количество ответов типа «корчи» за 10 минут у животных в контроле;
Ро - количество ответов типа «корчи» у животных опытной группы после введения исследуемого фитосредства. Результаты эксперимента представлены в таблице 10.
| Таблица 10 Влияние фитокола на развитие уксусных «корчей» у крыс | |||
| Группы животных | Латентный период, мин | Количество «корчей», у.е. | Анальгетический эффект, % |
| Контрольная | 6,22±0,11 | 51,60±0,96 | - |
| Опытная | 11,22±0,93* | 20,42±0,39* | 61 |
Результаты исследований показали, что фитокол в дозе 250 мг/кг проявляет анальгезирующую активность. После введения фитокола на 80% увеличивается латентный период появления «корчей», а количество специфических ноцицептивных ответов на химический раздражитель снижается на 61%.
Таким образом, данные проведенных исследований показывают, что испытуемый экстракт «фитокол» в дозе 250 мг/кг оказывает выраженное противовоспалительное действие, оптимизируя течение воспалительной реакции, что, очевидно, обусловлено наличием в нем комплекса липофильных и гидрофильных биологически активных веществ.
Способ получения средства, обладающего противовоспалительной активностью, путем экстрагирования растительного материала, отличающийся тем, что в качестве растительного материала используют смесь, содержащую, мас.ч.:
| черные листья бадана толстолистного | 3,0 |
| цветы ромашки аптечной | 2,8 |
| траву тысячелистника обыкновенного | 2,4 |
| листья мяты перечной | 1,8 |
измельченную до размера частиц 0,5-2,0 мм, экстракцию проводят дважды 80%-ным этанолом при комнатной температуре при соотношении сырье:экстрагент 1:(10-12) в течение 2 ч, третью и четвертую экстракцию проводят 40%-ным этанолом при температуре 90±5°С в течение 1 ч, отфильтрованные спиртовые извлечения упаривают, объединяют, концентрируют, высушивают в вакуум-сушильном шкафу.
