Способ определения остаточной силанольной активности обращенно-фазовых хроматографических сорбентов

Изобретение относится к высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), а именно к способам определения остаточной силанольной активности обращенно-фазовых хроматографических сорбентов, и может быть использовано в практике научно-исследовательских лабораторий и фармацевтических предприятий. Способ определения остаточной силанольной активности обращенно-фазовых хроматографических сорбентов основан на определении времени удерживания тест-вещества методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. В качестве тест-вещества используют дифенгидрамина гидрохлорид, время удерживания которого определяют при двух концентрациях калия фосфата однозамещенного в подвижной фазе, рассчитывают соответствующие коэффициенты емкости, величину а, которая при наличии у сорбента остаточной силанольной активности отрицательна по знаку и тем больше по абсолютной величине, чем больше остаточная силанольная активность. Изобретение обеспечивает сокращение времени определения остаточной силанольной активности. 2 ил., 2 табл.

 

Изобретение относится к высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), а именно к способам определения остаточной силанольной активности (ОСА) обращенно-фазовых хроматографических сорбентов, и может быть использовано в практике научно-исследовательских лабораторий и фармацевтических предприятий. Способ относится к числу специальных.

ОСА определяется концентрацией свободных силанольных групп на поверхности сорбента. Эта величина может быть достаточно точно измерена в единицах концентрации (мкМ/м²) с помощью физико-химических методов, например, ядерно-магнитного резонанса (Alex B.Sholten, Henk A. Claessens, Jan W. de Haan, Carel A. Cramers. Chromatographic activity of residual silanols of alkylsilane derivarized silica surfaces. J. chromatogr. A. 1997. V.759. №.1-2. Р.37-46).

При использовании хроматографических тестов для определения ОСА ее величину оценивают или характеристиками формы пика («хвостовой» фактор), или характеристиками удерживания (время удерживания, фактор емкости). При этом концентрацию свободных силанольных групп на поверхности сорбента не определяют, но получают величину, характеризующую уровень ОСА исследуемого сорбента. Эта величина позволяет сравнивать различные сорбенты между собой и судить о их пригодности для разделения той или иной смеси веществ. Преимущества хроматографических тестов по сравнению с физико-химическими методами - относительная техническая простота, экспрессность, наглядность и удобство применения полученных результатов при дальнейшем использовании изученного сорбента при разработке метода разделения смеси веществ.

Методики анализа, описанные в фармацевтической нормативной документации, содержат только самые общие указания на тип используемой хроматографической колонки. Например, Британская Фармакопея и Фармакопея США чаще всего предписывают использовать для обращенно-фазовых методик сорбенты типа L1 или L7. В переводе на более понятный большинству хроматографистов язык это означает С18 или С8. Вместе с тем ассортимент выпускаемых в настоящее время хроматографических колонок огромен. Так, только две из крупнейших фирм - Waters и Agilent Technologies предлагают десятки колонок этого типа. Для некоторых лекарственных препаратов выбор конкретной хроматографической колонки не играет принципиальную роль и анализ может быть проведен практически на любой колонке, предназначенной для данного режима жидкостной хроматографии. Речь идет, в первую очередь, об относительно несложных препаратах, содержащих не более 2-3 компонентов - нейтральных веществ, не подверженных ионизации в условиях определения. Однако подавляющее большинство лекарственных веществ являются ионными. При анализе таких веществ большое значение имеет как выбор наиболее подходящей хроматографической колонки, так и поиск оптимальных условий анализа. В большинстве случаев при поиске оптимальных условий изучают влияние рН подвижной фазы (ПФ) и содержания в ней органического модификатора. Безусловно, эти факторы являются определяющими. В то же время очевидно и влияние на удерживание ионогенных веществ ионной силы ПФ, определяемой типом и концентрацией используемого буферного раствора. По мнению автора заявки, это направление перспективно для направленного изменения хроматографической селективности, но пока неоправданно мало используется хроматографистами. Кроме этого, по мнению автора, влияние концентрации буферного раствора на удерживание оснований в условиях обращенно-фазовой ВЭЖХ может быть использовано и для тестирования хроматографических колонок, в частности, оценки ОСА сорбентов.

Известен способ оценки ОСА обращенно-фазовых сорбентов, основанный на определении некоторых хроматографических свойств анилина, фенола, N,N-диметиланилина и трех изомерных толуидинов (Alex B.Sholtea, Henk A Claessens, Jan W. de Haan, Carel A. Cramers. Chromatographic activity of residual silanols of alkylsilane derivatized silica surfaces J. chromatogr. A. 1997. V.759. N.1-2. Р.37-46). Согласно этому способу сорбент является пригодным для разделения оснований, если анилин элюируется до фенола; соотношение «хвостовых факторов, анилина и фенола меньше 1 и 3; три изомерных толуидина разделяются с трудом, соотношение их коэффициентов емкости k меньше 1,3; N,N-диметиланилин элюируется до фенола. Недостатком данного способа является его техническая сложность и длительность: для оценки сорбентов используются несколько тест-веществ и оцениваются несколько показателей. Недостатком является также и отсутствие количественного выражения у некоторых показателей (например, «элюируется до»).

Наиболее близким к заявляемому изобретению по техническому решению и достигаемым результатам является способ определения ОСА обращенно-фазовых хроматографических сорбентов, основанный на исследовании зависимости удерживания тест-вещества - бретилиума тозилата от рН мобильной фазы (Uwe D. Neue, Charles H. Phoebe, Kimvan Tran, Yung-Fong Cheng, Ziling Lu. Dependence of reversed-phase retention of ionizible analytes on pH, concentration of organic solvent and silanol activity. J. chromatogr. A. 2001. V.925. №.1-2. Р.49-67). Способ основан на особом свойстве используемого тест-вещества - практическом отсутствии зависимости степени его ионизации от рН. Следовательно, наблюдаемые изменения связаны прежде всего с наличием в сорбенте остаточных силанольных групп и изменением степени их ионизации при изменении рН.

Недостатками способа являются техническая сложность, поскольку необходимо готовить несколько мобильных фаз с разными рН, а также отсутствие количественного выражения полученных графических характеристик, удобного для практического применения.

Задачей настоящего изобретения является разработка технически простого и экспрессного способа определения ОСА обращенно-фазовых хроматографических сорбентов с количественным выражением получаемых характеристик.

Поставленная задача достигается методом обращенно-фазовой ВЭЖХ с помощью предлагаемого способа, который заключается в том, что определяют время удерживания t_R дифенгидрамина гидрохлорида (ДФГА) для концентраций калия фосфата однозамещенного в мобильной фазе, равных 0,01 и 0,04 М и рассчитывают параметр а, характеризующий остаточную силанольную активность сорбента, по формуле:

Способ осуществляется следующим образом: 10,0 мкл раствора ДФГА с концентрацией 0,02 мг/мл (растворитель 5 об.% ацетонитрила в воде) последовательно хроматографируют на жидкостном хроматографе с ультрафиолетовым детектором (220 нм) и обращенно-фазовой хроматографической колонкой в изократическом режиме с использованием в качестве ПФ:

1. Смеси 36 об.% ацетонитрила с 0,01 М раствором калия фосфата однозамещенного. Расход ПФ 1,0 мл/мин.

2. Смеси 36 об.% ацетонитрила с 0,04 М раствором калия фосфата однозамещенного. Расход ПФ 1,0 мл/мин.

Определяют t_R дифенгидрамина для ПФ (1) и (2). Рассчитывают коэффициенты емкости k для ПФ (1) и (2) по формуле (X.Энгельгардт. Жидкостная хроматография при высоких давлениях. М.: Мир. 1980. С.14):

где t_R - время удерживания ДФГА, t₀ - мертвое время колонки, определяемое по времени пика растворителя при инжекции воды (согласно X. Энгельгардт. Жидкостная хроматография при высоких давлениях. М.: Мир. 1980. С.53, при использовании в качестве ПФ смесей, содержащих воду, в качестве вещества для определения t_o можно применять и воду, и органический компонент ПФ).

Рассчитывают параметр а, характеризующий остаточную силанольную

активность сорбента, по формуле (1).

Выбор в качестве тест-вещества ДФГА объясняется следующим образом. ДФГА - довольно сильное основание (рК 8,5 согласно нашим данным). Поэтому при рН проведения теста (5,1) ДФГА находится в протонированном состоянии и активно взаимодействует с остаточными силанольными группами сорбента, которые в этих условиях диссоциированы и отрицательно заряжены. ДФГА - лекарственное вещество, но вместе с этим является легко доступным для широкого круга химиков, так как включено в коммерческие каталоги (например, Chemicals & Reagents. Merck KGaA. Darmstadt. 2005. P.373).

Зависимость удерживания ДФГА от концентрации калия фосфата однозамещенного в ПФ для ряда изученных в настоящей работе хроматографических колонок представлена в табл.1. Обработка этих данных по методу наименьших квадратов с помощью электронных таблиц Excel показала, что в интервале концентраций калия фосфата однозамещенного 0,01÷0,04 М зависимость lnk от этого фактора близка к линейной (коэффициент корреляции больше 0,9):

Рассчитанные значения коэффициента линейной регрессии а приведены в табл.1. Фактически а представляет собой производную натурального логарифма коэффициента емкости по концентрации фосфата:

Для сорбентов типа Nova Pak, на которых удерживание ДФГА при росте концентрации фосфата снижается, а<0, для сорбентов типа Symmetry C18, на которых удерживание ДФГА при росте концентрации фосфата растет, а>0.

В первом случае величина а характеризует ОСА сорбента. Во втором - с точки зрения рассматриваемого фактора можно говорить о нулевой ОСА, а большое положительное значение а свидетельствует о высокой гидрофобности исследуемого сорбента.

Согласно полученным данным, максимальную ОСА проявляют сорбенты типов Waters Spherisoib и Nova Pak, минимальную - сорбенты типа Inertsil и Symmetry.

Для практического использования предлагаемого теста, по мнению автора заявки, нет необходимости изучать удерживание ДФГА при четырех концентрациях калия фосфата однозамещенного. Достаточно определить t_R для концентраций фосфата 0,01 и 0,04 М, рассчитать разность lnk и разделить ее на разность концентраций.

Способ иллюстрируется следующим примером.

Определение остаточной силанольной активности сорбента Nova Pak C18

Для определения остаточной силанольной активности исследуемого сорбента

1. Готовили раствор ДФГА с концентрацией 0,02 мг/мл в смеси ацетонитрил - вода (1:19 по объему).

2. Готовили ПФ двух составов смешением ацетонитрила и раствора калия фосфата однозамещенного:

- смесь ацетонитрил (36 об.%) - 0,04 М калия фосфат однозамещенный;

- смесь ацетонитрил (36 об.%) - 0,01 М калия фосфат однозамещенный.

Колонку 150×3,9 мм Nova Pak C18 4,0 мкм устанавливали в термостат хроматографа при температуре 40°С и промывали ПФ с концентрацией калия фосфата однозамещенного 0,01 М до стабилизации базовой линии при расходе ПФ 1,0 мл/мин. Детектирование вели при 220 им. Вводили в колонку 10,0 мкл воды и определяли мертвое время колонки t_o, не зависящее от состава ПФ (X.Энгельгардт. Жидкостная хроматография при высоких давлениях. М.: Мир. 1980. С.53). Вводили в колонку 10,0 мкл раствора ДФГА, регистрировали хроматограмму и определяли время удерживания ДФГА t_R1. Рассчитывали коэффициент емкости ДФГА k₁ по формуле (2). Затем промывали эту же колонку ПФ с концентрацией калия фосфата однозамещенного 0,04 М до стабилизации базовой линии при расходе ПФ 1,0 мл/мин. Вводили в колонку 10,0 мкл раствора ДФГА, регистрировали хроматограмму и определяли время удерживания ДФГА t_R2. Рассчитывали коэффициент емкости ДФГА k₁ по формуле (2). Рассчитывали значение а по формуле (1). Для колонки размером 150×3,9 мм с сорбентом Nova Pak C18 с размером частиц 4,0 мкм были получены следующие значения:

t₀=1,409 мин;

t_R1=6,341 мин; k₁=3,500;

t_R2=3,751 мин; k₂=1,662;

a=(lnk₂-lnk₁)/(c₂-с₁)=ln(1,662/3,500/(0,04-0,01)=-24,825

Полученное значение a незначительно отличается от приведенного в таблице, поскольку табличное значение рассчитано для четырех концентраций калия фосфата однозамещенного в ПФ по уравнению линейной регрессии. Высокое отрицательное значение a характеризует высокую ОСА данного сорбента.

ОСА хроматографических сорбентов можно оценить не только с помощью ДФГА, но и по характеристикам удерживания на них и других органических оснований. Так, нами было изучено удерживание некоторых соединений на сорбентах Nova Pak C18 и Symmetry C18 при разных концентрациях калия фосфата однозамещенного в ПФ. Полученные результаты представлены в табл.2. Независимо от природы основания во всех случаях для сорбента Nova Pak C18 при возрастании концентрации КН₂PO₄ в ПФ удерживание снижается, для сорбента Symmetry C18 наблюдается противоположная зависимость. Для иллюстрации приводим фиг.1 и 2, на которых наглядно представлены соответствующие изменения при анализе кодеина фосфата на данных типах сорбентов.

Таблица 1 Зависимость удерживания дифенгидрамина гидрохлорида на разных обращенно-фазовых сорбентах от содержания калия фосфата однозамещенного в подвижной фазе (lnk=f(c(KH2PO4))
№№	Сорбент	C(KH2PO4), M	а (n=12; α=0,05)
0	0,010	0,020	0,030	0,040
1	Waters Spherisorb ODS2	н/п	2,718	2,222	1,944	1,787	-30,693±3,057
2	Waters Spherisorb CN	н/п	0,937	0,415	0,158	0,008	-30,416±3,384
3	NovaPakCNHP	н/п	0,521	0,094	-0,108	-0,213	-24,050±2,932
4	Nova Pak C18	н/п	1,253	0,829	0,631	0,508	-24,316±2,761
5	Zorbax SB-CN	н/п	0,857	0,559	0,423	0,336	-16,985±1,941
6	Zorbax SB-C18	н/п	0,707	0,476	0,363	0,313	-12,948±1,636
7	Zortbax SB-C8	н/п	0,664	0,481	0,383	0,356	-10,204±1,403
8	Hypersa BDS-C18	н/п	0,384	0,252	0,191	0,152	-7,590±0,859
9	Zorbax Rx C18	н/п	0,369	0,210	0,146	0,134	-7,701±1,332
10	Zorbax Eclipse XDB-C 18	н/п	0,403	0,297	0,248	0,221	-5,953±0,720
11	Zorbax Eclipse XDB-C8	н/п	0,138	0,093	0,062	0,031	-3,492±0,136
12	Xterra RP18	н/п	0,560	0,528	0,505	0,493	-2,217±0,183
13	Symmetry C18	-0,520	0,061	0,165	0,201	0,232	5,496±0,702
14	Inertsil ODS3	-2,777	-0,030	0,109	0,151	0,192	7,079±0,958
15	Symmetry C8	-6,244	-0,243	-0,080	-0,034	0,006	7,919±1,190

Таблица 2 Зависимость удерживания некоторых органических оснований на обращенно-фазовых сорбентах с разными свойствами от содержания калия фосфата однозамещенного в подвижной фазе (lnk=f(c(KH2PO4))
Вещество	Сорбент	C(KH2PO4), M
0	0,005	0,01	0,02	0,03	0,04
Дифенгидрамина гидрохлорид	Nova Pak C18	н/п	1,793	1,253	0,829	0,631	0,508
Symmetry C18	-0,520	-0,106	0,061	0,165	0,201	0,232
Диметиламино-п-фенилендиамин	Nova Pak C18	н/п	-0,182	-0,697	-1,117	-1,326	-1,464
Symmetry C18	-0,452	-0,178	-0,233	-0,253	-0,267	-0,269
Кодеина фосфат	Nova Pak C18	н/п	0,790	0,383	0,109	0,027	-0,061
Symmetry C18	-0,961	0,250	0,462	0,622	0,684	0,736
Эфедрина гидрохлорид	Nova Pak C18	н/п	1,023	0,617	0,366	0,285	0,241
Symmetry C18	н/у	0,076	0,361	0,554	0,633	0,684
Фенилэфрина гидрохлорид	Nova Pak C18	н/п	-0,272	-0,799	-1,092	-1,192	-1,247
Symmetry C18	н/у	-0,730	-0,353	-0,159	-0,056	-0,007
Фенирамина малеат	Nova Pak C18	н/п	1,022	0,372	-0,193	-0,489	-0,680
Symmetry C18	н/у	-0,878	-0,696	-0,591	-0,563	-0,548
Хлорфенирамина малеат	Nova Pak C18	н/п	1,929	1,321	0,750	0,647	0,433
Symmetry C18	н/у	0,179	0,328	0,406	0,429	0,444
Условные обозначениея: н/п - нет пика (необратимое удерживание); н/у - не удерживается, то есть tR=t0.

Способ определения остаточной силанольной активности обращенно-фазовых хроматографических сорбентов, основанный на определении времени удерживания тест-вещества методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, отличающийся тем, что в качестве тест-вещства используют дифенгидрамина гидрохлорид, время удерживания которого определяют при двух концентрациях калия фосфата однозамещенного в подвижной фазе, по формулам рассчитывают соответствующие коэффициенты емкости, величину а, которая при наличии у сорбента остаточной силанольной активности отрицательна по знаку и тем больше по абсолютной величине, чем больше остаточная силанольная активность.