Способ получения полимерных гидрогелей, содержащих физиологически активные вещества

Изобретение относится к области химии полимеров, биохимии и медицины, а именно к способу получения полимерных гидрогелей, содержащих физиологически активные вещества, обладающих антикоагулянтным действием и используемых для профилактики и лечения сердечно-сосудистых заболеваний. Способ включает получение полимерных гидрогелей, содержащих физиологически активные вещества, путем иммобилизации физиологически активного вещества в объеме сшитого полимера, модифицированного овомукоидом из белка утиных яиц, сшитый полимер дополнительно модифицирован ингибитором α-амилазы из семян пшеницы, а в качестве физиологически активного вещества используют гепарин или гирудин. Сшитый полимер, модифицированный овомукоидом и ингибитором α-амилазы, получают путем химической модификации полимера смесью овомукоида и ингибитора α-амилазы, количество которых составляет 0,5-15 мг овомукоида на 1 г набухшего сшитого полимера и 0,5-5,0 мг ингибитора α-амилазы на 1 г набухшего сшитого полимера. Изобретение обеспечивает получение гидрогелей, обладающих антикоагулянтными свойствами и пригодных к пероральному применению. 1 з.п. ф-лы, 1 табл.

 

Предлагаемое изобретение относится к области химии полимеров, биохимии и медицины, а именно к способу получения полимерных гидрогелей, содержащих физиологически активные вещества и используемых для профилактики и лечения сердечно-сосудистых заболеваний, которые в настоящее время являются одной из основных причин смерти человека.

При образовании тромба в просвете артерии возникает нарушение притока крови к области, снабжаемой данным сосудом. Так, при тромбозе коронарных артерий сердца возникает инфаркт миокарда, тромбоз сосудов мозга может привести к инсульту, тромбоз крупных артерий конечностей - к развитию гангрены. Одними из наиболее распространенных лекарственных средств, применяемых для предотвращения и лечения этих заболеваний, являются антикоагулянты крови - вещества, активно воздействующие на свертывающую систему крови и предотвращающие образование тромба. Наибольшее распространение в качестве антикоагулянта крови в настоящее время находит гепарин - кислый мукополисахарид с молекулярной массой от 10000 до 30000. Гепарин не является полисахаридом в чистом виде: его углеводная цепь связана с белковым компонентом. Соотношение белкового и углеводного компонентом зависит от источника и способа выделения гепарина. В наибольших количествах он содержится в печени и легких, меньше - в скелетных мышцах, селезенке, мышце сердца. Гепарин добывают из легких крупного рогатого скота [Ульянов А.М., Ляпина Л.А. Современные данные о гепарине и его биохимических свойствах. Успехи современной биологии. 1977. Т.83. №1. С.69-85].

Гепарин является естественным противосвертывающим фактором. Механизм действия гепарина, в основном, заключается в нейтрализации свертывающей активности тромбина путем ускорения его реакции с антитромбином III [Зубаиров Д.М. Биохимия свертывания крови // М., Медицина. 1978. 259 с.]. Применяют для профилактики и терапии различных тромбоэмболических заболеваний и их осложнений: для предотвращения или ограничения (локализации) тромбообразования при остром инфаркте миокарда, при тромбозах и эмболиях магистральных вен и артерий, сосудов мозга, глаза, при операциях на сердце и кровеносных сосудах, для поддержания жидкого состояния крови в аппаратах искусственного кровообращения и аппаратуре для гемодиализа, а также для предотвращения свертывания крови при лабораторных исследованиях [Машковский А.Д. Лекарственные средства. М., Медицина. 1993. Т.2. С.79-81].

В противоположность гепарину антикоагулянтное действие гирудина не зависит от присутствия в плазме крови антитромбина III. По своей химической природе гирудин является полипептидом, состоящим из 65-68 аминокислотных остатков [Markwardt F. Hirudin as an inhibitor of thrombin. // Methods in Enzymol. 1970. V.19. P.924-932]. Изучение действия гирудина на отдельные стадии процесса свертывания крови показало, что гирудин специфически ингибирует действие тромбина. Гирудин не вступает в реакцию с другими факторами системы свертывания крови и оказывает свое ингибирующее действие на тромбин без участия каких-либо находящихся в крови компонентов [Markwardt F., Walsmann P. // Hoppe-Seyler's Zeitschrift fur physiologische Chemic. 1960. V.1-4. P.64-77]. В связи с этим гирудин получил широкое распространение при лечении заболеваний или состояний, при которых гепаринотерапия оказывается недостаточно эффективной, например в остром периоде инфаркта миокарда, при нестабильной стенокардии и т.д. Основным способом введения антикоагулянтов в организм являются внутривенные, внутримышечные или подкожные инъекции. Попытки введения антикоагулянтов наиболее физиологическим и удобным для больных пероральным путем (через рот) оказались безуспешными, поскольку эти соединения легко гидролизуются ферментами пищеварительной системы, в первую очередь, протеолитическими ферментами и α-амилазой, с потерей биологической активности.

Известен способ получения полимерных гидрогелей, содержащих физиологически активные вещества, путем иммобилизации физиологически активного вещества в объеме сшитого полимера, модифицированного ингибитором ферментов [Greenley R.Z., Brown T.M., Garlow J., Vogt C.E., Zia H., Rodgers R.L., Christie M., Luzzi L.A., Polymer Matrices for Oral Delivery/ Polymer Preprints. 1990. V.31. №2. P.182-173]. В качестве физиологически активного вещества используют инсулин, в качестве сшитого полимера используют акриловую или метакриловую кислоты, сшитые триэтиленгликольди(мет)акрилатом, а в качестве ингибитора ферментов используют апротенин - панкреатический ингибитор трипсина.

Недостатком этого способа является низкая биологическая активность иммобилизованного физиологически активного вещества при пероральном применении (пероральное введение полученного полимерного гидрогеля кроликам в количестве, соответствующем 50 единиц инсулина, не приводит к уменьшению концентрации глюкозы в крови, в то время как подкожная инъекция кроликам всего 0.23 единиц инсулина приводит к снижению концентрации глюкозы в крови на 74%), а также невозможность использования гидрогеля в качестве антикоагулянта.

Наиболее близким (прототип) к заявляемому по технической сущности является способ получения полимерных гидрогелей, содержащих физиологически активные вещества, путем иммобилизации физиологически активного вещества в объеме сшитого полимера, модифицированного ингибитором ферментов [Патент РФ №2066551, МКИ А61К 38/28, Бюл. №26. 1996]. В качестве сшитого полимера используют сшитые полиакриламид, полиакриловую кислоту, полиметакриламид, поли-N-винилпирролидон, полигидроксиэтилметакрилат, в качестве физиологически активного вещества используют инсулин, а в качестве ингибитора ферментов используют овомукоид из белка утиных яиц. Получаемый полимерный гидрогель обладает высокой биологической активностью (активность инсулина при пероральном введении его в составе гидрогеля составляет 60-70% от активности исходного инсулина при его подкожном применении).

Недостатком этого способа является невозможность использования синтезированных полимерных гидрогелей в качестве антикоагулянта.

Задачей предлагаемого изобретения является получение гидрогелей, обладающих антикоагулянтными свойствами и пригодных к пероральному применению.

Решение поставленной задачи достигается тем, что в способе получения полимерных гидрогелей, содержащих физиологически активные вещества, путем иммобилизации физиологически активного вещества в объеме сшитого полимера, модифицированного овомукоидом из белка утиных яиц, сшитый полимер дополнительно модифицирован ингибитором α-амилазы из семян пшеницы, а в качестве физиологически активного вещества используют гепарин или гирудин.

Сшитый полимер, модифицированный овомукоидом и ингибитором α-амилазы, получают путем химической модификации полимера смесью овомукоида и ингибитора α-амилазы, количество которых составляет 0,5-15 мг овомукоида на 1 г набухшего сшитого полимера и 0,5-5,0 мг ингибитора α-амилазы на 1 г набухшего сшитого полимера.

Реакцию модификации проводят путем ацилирования овомукоида и ингибитора α-амилазы хлорангидридом акриловой кислоты в водном растворе (рН 7,0-9,0), смешиванием полученных растворов и последующей сополимеризацией полученных производных с гидрофильным мономером и бифункциональным сшивающим агентом в присутствии окислительно-восстановительной каталитической системы: персульфат аммония -N,N,N',N'-тетраметилэтилендиамин. После промывания дистиллированной водой до полного удаления непрореагировавших соединений сшитый полимер лиофильно высушивают.

Иммобилизацию антикоагулянтов проводят путем погружения лиофильно высушенного, модифицированного полимера в водный раствор антикоагулянта с концентрацией 0.04-1.5 мг антикоагулянта на 1 мл раствора до полного набухания полимера (30-60 минут). Модифицированный полимер используют в количестве 0,05-0,8 г на 1 мл раствора антикоагулянта.

Предположительный механизм действия заявленной полимерной системы заключается в следующем. Овомукоид из белка утиных яиц является гликопротеином, то есть состоит из белкового и углеводного участка [Шульгин М.Н., Валуева Т.А., Кестере А.Я., Мосолов В.В. Свойства утиного овомукоида, очищенного методом аффинной хроматографии на трипсин-сефарозе. Биохимия. 1981. Т.46. №3. С.473-480]. Молекулярная масса овомукоида равна 31000. В составе модифицированного полимера белковый участок овомукоида взаимодействует с протеолитическими ферментами и подавляет их активность, защищая антикоагулянт от действия этих ферментов, а углеводный участок способен реагировать с лектинами, содержащимися на слизистой тонкого кишечника, обеспечивая тем самым направленный транспорт всей системы на стенки тонкого кишечника, где и происходит всасывание содержащегося в сшитом полимере, но химически с ним не связанного антикоагулянта.

Ингибитор α-амилазы из семян пшеницы имеет молекулярную массу 20000 и относится к бифункциональным ингибиторам, то есть способен подавлять активность α-амилазы - фермента, ответственного за гидролиз полисахаридов, активность ряда протеолитических ферментов [Мосолов В.В., Валуева Т.А. Ингибиторы протеиназ и их функции у растений. Прикладная биохимия и микробиология. 2005. Т.41. №3. С.261-281]. Таким образом, одновременная модификация сшитых полимеров овомукоидом и ингибитором α-амилазы обеспечивает защиту введенного в полимер полисахарида - гепарина и белка - гирудина и направленный транспорт всей системы на слизистую оболочку кишечника.

Пример 1. 0,05 г лиофильно высушенного полиакриламида, модифицированного овомукоидом ингибитором α-амилазы, помещают в 1 мл водного раствора гепарина с концентрацией 0,04 мг/мл на 60 минут при комнатной температуре. В течение этого времени полимер полностью набухает в растворе и готов к употреблению. Для определения антикоагулянтной активности синтезированный полимер перорально (через рот) с помощью катетера вводят кролику и затем измеряют время свертывания крови, отобранной из ушной вены животного. Время свертывания крови равно 6,2±1,1 мин. * Исходное время свертывания крови (без добавления антикоагулянта) в стеклянной пробирке равно 3,0±0,5 мин.

Примеры 2-12. Процесс проводят по примеру 1, используя различные сшитые полимеры и их количества, различные количества овомукоида и ингибитора α-амилазы в составе сшитого полимера, различные антикоагулянты. Результаты приведены в таблице.

Примеры 13-18. Процесс проводят по примеру 1, используя сшитый полиакриламид, в котором количества овомукоида и ингибитора α-амилазы, выходят за заявленные пределы, а также растворы антикоагулянтов, в которых количества антикоагулянтов также выходят за заявленные пределы. Результаты приведены в таблице.

Примеры 19-20. Сравнительные примеры, в которых раствор антикоагулянтов вводят кроликам путем подкожной инъекции. Результаты приведены в таблице.

Таблица.
№	Количество антикоагулянта в 1 мл исходного раствора, мг	Количество сшитого полимера*, г	Концентрация в сшитом полимере, мг/г набухшего полимера	Время свертывания крови, мин**
Гепарин	Гирудин	Овомукоид	Ингибитор α-амилазы
1	0,04	-	ПАА, 0,05	0,5	3,1	6,2±1,1
2	0,12	-	ПАА, 0,2	0,8	5,0	8,0±0,8
3	0,28	-	ПМА, 0,2	3,9	2,7	11,4±1,5
4	0,50	-	ПВП, 0,1	9,8	0,5	12,0±2,0
5	1,03	-	ПГЭМ, 0,8	12,3	0,9	14,2±2,0
6	1,50	-	ПАА, 0,1	15,0	1,4	15,7±2,5
7	-	0,04	ПАА, 0,1	0,5	3,1	11,2±1,6
8	-	0.09	ПАА, 0,2	0,8	5,0	18,6±2,0
9	-	0,18	ПМА, 0,2	3,9	2,7	21,0±2,5
10	-	0,87	ПВП, 0,1	9,8	0,5	23,5±2,0
11	-	1,25	ПГЭМ, 0,3	12,3	0,9	25,0±2,5
12	-	1,50	ПАА, 0,1	15,0	1,4	26,0±2,5
13к.	0,03	-	ПАА, 0,15	3,9	2,7	4,0±1,0
14к.	-	0,03	ПАА, 0,15	9,8	0,5	6,0±1,5
15к.	0,28	-	ПАА, 0,15	-	2,7	3,5±0,5
16к.	0,50	-	ПАА, 0,15	3,9	-	4,0±1,0
17к.	-	0,87	ПАА, 0,15	-	2,7	3,0±0,5
18к.	-	1,25	ПАА, 0,15	3,9	-	5,5±1,5
19 с.	Подкожная инъекция 0,02 мг гирудина	18,0±1,5
20 с.	Подкожная инъекция 0,1 мг гепарина	15,5±1,5
* ПАА- полиакриламид, ПМА- полиметакриламид, ПВП - поли-N-винилпирролидон, ПГЭМ - полигидроксиэтилметакрилат. ** Исходное время свертывания (без добавления антикоагулянта) 1 мл крови в стеклянной пробирке равно 3,0±0,5 мин.

Сравнительный анализ с прототипом показывает, что заявленный объект отличается химической природой используемого физиологически активного вещества и модифицированного сшитого полимера, то есть заявленное решение соответствует критерию «новизна». Оно также соответствует критерию «изобретательский уровень», так как способность смеси овомукоида и ингибитора α-амилазы, химически связанных с макромолекулами полимера, предотвращать гидролитическое расщепление полисахаридов и обеспечивать направленный транспорт всей системы на слизистую оболочку тонкого кишечника является неизвестной функцией и впервые обнаружена в данном изобретении. Использование овомукоида и ингибитора α-амилазы в модифицированном полимере в количествах, выше заявленных, нецелесообразно, так как заявленных количеств вполне достаточно для защиты терапевтических доз антикоагулянтов. Возможность перорального введения антикоагулянтов не только создает большие удобства для больных, но и позволяет усовершенствовать стратегию лечения, а главное предупреждения, ряда сердечно-сосудистых заболеваний.

1. Способ получения полимерных гидрогелей, содержащих физиологически активные вещества, путем иммобилизации физиологически активного вещества в объеме сшитого полимера, модифицированного овомукоидом из белка утиных яиц, отличающийся тем, что сшитый полимер дополнительно модифицирован ингибитором α-амилазы из семян пшеницы, а в качестве физиологически активного вещества используют гепарин или гирудин.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что концентрация овомукоида в сшитом полимере равна 0,5-15 мг/г набухшего сшитого полимера, а концентрация ингибитора α-амилазы равна 0,5-5,0 мг/г набухшего сшитого полимера.