Способ прогнозирования тяжести течения и эффективности лечения лимфом

Изобретение относится к онкогематологии. Предложен способ прогнозирования тяжести течения и эффективности лечения лимфом: до лечения в сыворотке крови пациента определяют концентрации провоспалительных цитокинов интерлейкинов IL-1β и IL-6, а в мазках костного мозга определяют относительную долю лимфоидных опухолевых клеток, несущих на своей поверхности рецепторы к цитокинам IL-1β и IL-6. В зависимости от концентрации IL-1β и относительной доле лимфоидных опухолевых клеток, несущих рецепторы к цитокинам IL-1β и IL-6, делают вывод о благоприятном или неблагоприятном прогнозе. Метод обладает высокой чувствительностью, специфичностью и прогностичностью. 12 табл.

 

Изобретение относится к медицине, конкретнее, к онкологии и гематологии.

Опухолевый процесс - один из сложнейших и в настоящее время интенсивно изучаемых разделов медицины. В последнее десятилетие большое значение придается роли цитокинов (интерлейкинов, интерферонов, факторов роста) в патогенезе онкологических заболеваний.

Однако данные литературы по этому вопросу часто являются противоречивыми. Проблема участия цитокинов в процессах роста и распространения опухолей остается до конца не изученной. Не выявлена зависимость уровня цитокинов от конкретных нозологий, не описана динамика этих показателей в ходе опухолевой прогрессии, не определены изменения уровней цитокинов, происходящие при лечении опухолей.

Наименее изученными в этом отношении являются опухоли системы кроветворения - гемобластозы. В литературе имеются лишь единичные работы, посвященные оценке цитокинов при развитии данной патологии.

Одной из наиболее распространенных и злокачественно протекающих групп гемобластозов являются лимфомы - опухоли лимфоидной ткани, характеризующиеся локальным злокачественным ростом.

Известно, что основными параметрами, влияющими на выбор терапевтической тактики при гемобластозах, помимо клинической стадии и морфологического варианта опухоли, являются факторы прогноза. В связи с этим актуальным является поиск новых эффективных методов прогнозирования агрессивности течения заболевания и эффективности применяемой терапии.

Степень тяжести течения и степень эффективности терапии лимфомы коррелируют между собой, т.к. являются отражением состояния организма.

Известны следующие способы прогнозирования агрессивности течения, эффективности терапии лимфом.

1. Определение морфологических характеристик опухоли.

В основе этого метода лежит подразделение неходжкинских лимфом (НХЛ) на лимфомы низкой степени злокачественности (НСЗ, индолентные) и высокой степени злокачественности (ВСЗ, агрессивные), принципиально отличающиеся друг от друга.

Индолентные лимфомы характеризуются медленным прогрессированием, длительной выживаемостью (5-летняя выживаемость составляет около 80%, независимо от того, достигнута ли полная клинико-гематологическая ремиссия), и, следовательно, благоприятным прогнозом. Агрессивные лимфомы имеют в целом неблагоприятный прогноз, поскольку быстро прогрессируют, и при умеренной и высокой чувствительности к лечению выживаемость больных агрессивными лимфомами значительно ниже, чем выживаемость больных индолентными лимфомами. При достижении полной клинико-гематологической ремиссии 5-летняя выживаемость составляет 50%, а при достижении частичной ремиссии - лишь 15% (Новик А.А. Классификация злокачественных лимфом. Санкт-Петербург: ЭЛБИ, 2000. 126 с.).

Недостатком метода является его низкая прогностичность. Прогноз на основе морфологических характеристик носит предварительный, ориентировочный характер, поскольку различные факторы, включая стадию процесса, состояние больного, осложнения, возникающие в ходе лечения, оказывают влияние на тяжесть течения и эффективность лечения лимфом.

2. Определение цитогенетических нарушений в опухолевых клетках.

Установлено, что у больных НХЛ уровень экспрессии гена Bcl-2 сказывается на частоте 5-летних полных ремиссий - гиперэкспрессия ее уменьшает (Herbst H., Tippelmann G., Anagnostopoulos I. et al. Immunoglobulin and T-cell receptor gene rearrangements in Hodgkin's disease and Ki-1-positive anaplastic large cell lymphoma: issociation between phenotype and genotype // Leuk Res., 1989; 13(2): 103-16). Диагностически и прогностически важной является транслокация t(2; 5)(p23; q35), характерная для анапластических крупноклеточных лимфом (Мазуров В.И., Криволапов Ю.А. Классификация лимфом. Морфология, иммунофенотип, молекулярная генетика неходжкинских лимфом // Практическая онкология, 2004, т.5, №3, с.169-175). Экспрессия генов множественной лекарственной устойчивости (MDR1, LRP, MRP) свидетельствует о возможности развития резистентности опухоли к терапии и, следовательно, неблагоприятном прогнозе (Ставровская А.А. Резистентность больных гемобластозами к лекарственной терапии // Клиническая онкогематология. - Под ред. М.А.Волковой. - Москва: Медицина, 2001).

К недостаткам этого метода можно отнести то, что прогностическое значение цитогенетических характеристик злокачественных клеток, за редкими исключениями, изучено недостаточно. Кроме того, значимость цитогенетических маркеров при оценке прогноза онкогематологического заболевания со временем утрачивается. Высокодозная полихимиотерапия нивелирует цитогенетические характеристики. Иными словами, если у пациента, у которого кариотип лейкемических клеток отнесен к неблагоприятному, достигнута ремиссия, и она сохраняется более года, то данный признак теряет прогностическое значение.

3. Определение иммунологических характеристик опухоли.

В основе этого метода лежит оценка иммунологического фенотипа лимфомной клетки, что позволяет определить вариант опухоли, а, следовательно, и прогноз тяжести течения и эффективности лечения заболевания на основе его принадлежности к той или иной группе в морфологической классификации. Иммунологический способ позволяет также определить пролиферативную активность лимфом по маркеру Ki-67 и чувствительность к проводимой терапии по маркеру P-gp (белок множественной лекарственной устойчивости). По количеству клеток, несущих данные мембранные маркеры, устанавливается низкая, умеренная или высокая пролиферативная активность опухоли и наличие или отсутствие чувствительности к проводимой цитостатической терапии. Чем выше этот показатель, тем более агрессивно и неблагоприятно протекает злокачественный процесс (Тупицын Н.Н. Иммунодиагностика гемобластозов // Клиническая онкогематология. - под ред. М.А.Волковой. - Москва: Медицина, 2001).

Недостатки метода: высокодозная полихимиотерапия оказывает влияние на иммунологические характеристики опухоли, уменьшает процент клеток, несущих на своей поверхности молекулярные маркеры. Следовательно, после лечения прогностическая значимость метода утрачивается. Кроме того, следует отметить, что проточная цитометрия, используемая при определении иммунологических характеристик гемобластозов, не является рутинным методом в клинике и сложна в применении.

Прототипом предлагаемого способа прогнозирования тяжести течения, эффективности лечения лимфом выбран прогностический алгоритм, разработанный ВОЗ и группами по изучению гемобластозов для агрессивных и индолентных лимфом. Этот способ получил наибольшее распространение в клинике и относительно прост в использовании. Для каждой группы заболеваний метод имеет определенные нюансы, но в целом опирается на совокупность клинических и лабораторных параметров.

Для агрессивных лимфом используется способ прогнозирования тяжести течения, эффективности терапии злокачественных лимфом с помощью суммы независимых факторов риска, которые были положены в основу Международного прогностического индекса (МПИ, IPI) (Shipp М.А., Harrington D.P., Andersen J. et al. International Non-Hodgkin's lymphoma prognostic factors project. A predictive model for aggressive non-Hodgkin's lymphoma /N. Engl. J. Med. 1993; 329: 987-94; Поддубная И.В. Клиническая онкогематология/ Под ред. М.А.Волковой. - Москва: «Медицина», 2001 г., с.344-345). Наиболее значимыми из этих факторов являются: возраст старше 60 лет, повышение уровня сывороточной лактатдегидрогеназы (ЛДГ), общее состояние больного, соответствующее 2-4 степени по шкале ECOG, III-VI стадии болезни, наличие более одного экстранодального очага поражения, вовлечение в опухолевый процесс костного мозга, размер опухоли более 5 см (табл.1).

На основании количества имеющихся неблагоприятных факторов делают прогноз о степени тяжести течения заболевания, эффективности терапии:

- отсутствие неблагоприятных факторов или присутствие лишь одного из них позволяет прогнозировать низкую степень тяжести заболевания, хороший эффект от терапии (обозначим эту группу 1-ой группой по МПИ);

- наличие 2-х факторов позволяет прогнозировать низкую/промежуточную степень тяжести заболевания, хороший/промежуточный эффект от терапии (2-я группа по МПИ);

- наличие 3-х факторов позволяет прогнозировать промежуточную/высокую степень тяжести заболевания, промежуточный/низкий эффект от терапии (3-я группа по МПИ);

- наличие 4-х факторов позволяет прогнозировать высокую степень тяжести заболевания, неэффективность терапии (4-я группа по МПИ).

Наличие двух и более факторов отчетливо отрицательно сказывается на прогнозе тяжести течения заболевания, эффективности лечения независимо от морфологического варианта опухоли. При МПИ=0-1 частота полных ремиссий после 1-й линии полихимиотерапии (ПХТ) составляет 80%, а 5-летняя выживаемость - 73%. При МПИ=4-5 полные ремиссии достигаются у 40% больных, 5-летняя выживаемость составляет всего 25% (И.В.Поддубная. Клиническая онкогематология / Под ред. М.А.Волковой. - М.: «Медицина», 2001 г., с.345).

При определении прогноза у пациентов с лимфомами низкой степени злокачественности учитываются несколько иные факторы: возраст пациента, стадия заболевания, число нодальных областей поражения, сывороточный уровень ЛДГ, уровень гемоглобина (Solay-Celigny P., Roy P., Colombat P. et a. Follicular lymphoma international prognostic index // Blood, 2004, 104(5), 1258-1265).

Данный способ имеет следующие недостатки:

- не учитывает молекулярно-биологические механизмы опухолевого роста и опухолевой прогрессии злокачественного клона;

- не содержит ранних факторов прогноза (работает только на генерализованных стадиях III-IV); не обладает превентивностью оценки на начальных стадиях заболевания;

- зависит от программы ПХТ (высокодозная ПХТ оказывает влияние на общие клинические характеристики опухоли, следовательно, после лечения прогностическая значимость метода утрачивается);

- характеризуется недостаточно высокой чувствительностью и специфичностью.

Раскрытие изобретения

Сущность предлагаемого способа прогнозирования тяжести течения, эффективности лечения лимфом заключается в том, что до лечения в сыворотке крови пациента определяют концентрации провоспалительных цитокинов интерлейкинов IL-1β и IL-6, а в мазках костного мозга определяют доли тех лимфоидных опухолевых клеток среди всех лимфоидных опухолевых клеток, которые несут на своей поверхности рецепторы к цитокинам IL-1β и IL-6, и при концентрации IL-1β, равной или превышающей 93 пкг/мл, концентрации IL-6, равной или превышающей 44 пкг/мл, доле лимфоидных опухолевых клеток, несущих рецепторы к цитокину IL-1β, равной или превышающей 38% от всех лимфоидных опухолевых клеток, доле лимфоидных опухолевых клеток, несущих рецепторы к цитокину IL-6, равной или превышающей 30% от всех лимфоидных опухолевых клеток, а также в случае, когда значения трех параметров из указанных четырех равны их значениям в точках разделения или превышают их, делают вывод о неблагоприятном прогнозе, а при концентрации IL-1β ниже 93 пкг/мл, концентрации IL-6 ниже 44 пкг/мл, доле лимфоидных опухолевых клеток, несущих рецепторы к цитокину IL-1β, ниже 38% от всех лимфоидных опухолевых клеток, доле лимфоидных опухолевых клеток, несущих рецепторы к цитокину IL-6, ниже 30% от всех лимфоидных опухолевых клеток, а также в случае, когда значения трех параметров из указанных четырех ниже их значений в точках разделения, делают вывод о благоприятном прогнозе.

Точка разделения - указанное выше значение каждого исследуемого параметра, с которым сравнивают его значение у пациента. Благоприятный прогноз - низкая и низкая/промежуточная степень тяжести заболевания, хороший и хороший/промежуточный эффект от терапии. Неблагоприятный прогноз - промежуточная/высокая, высокая степень тяжести заболевания; промежуточный/низкий эффект от терапии, неэффективность терапии.

От прототипа предлагаемый метод отличает:

- патогенетический подход к оценке характера развития заболевания;

- возможность применения на ранних стадиях заболевания;

- отсутствие зависимости от проводимой терапии;

- более высокая чувствительность, специфичность и прогностичность по сравнению с прототипом.

Предлагаемый способ был разработан на основе результатов исследования группы больных с НХЛ.

Клиническая характеристика больных

В группу обследованных вошли 63 пациента с НХЛ Городского гематологического центра города Новосибирска. Исследовали концентрации провоспалительных цитокинов IL-1β и IL-6 в сыворотке крови больных и уровень экспрессии рецепторов к IL-1β и IL-6 на поверхности лимфоидных опухолевых клеток костного мозга (в мазках костного мозга была определена доля лимфоидных опухолевых клеток костного мозга, несущих рецепторы к IL-1β и IL-6, по отношению ко всем лимфоидным опухолевым клеткам костного мозга).

У 40 пациентов было отмечено поражение костного мозга опухолевым процессом (уровень лимфоидных опухолевых клеток составлял или превышал 10%), а у 23 пациентов отмечалось вовлечение костного мозга в опухолевый процесс (уровень лимфоидных опухолевых клеток был ниже 10%).

В исследованной группе пациентов было 36 женщин (57%), 27 мужчин (43%). Средний возраст больных составил 49,6±2,4 года.

Больные были распределены по прогностическим группам согласно МПИ; в зависимости от наличия поражения костного мозга опухолевым процессом или вовлечения в него; наличия Б-симптомов, к которым относятся лихорадка более 38°, проливные ночные поты и снижение массы тела на 10% за последние 6 месяцев. Согласно МПИ пациенты были разделены на следующие 3 группы: 1-я группа - с прогнозом низкой степени тяжести заболевания, хорошего эффекта от терапии - 13 человек (20,6%), 2-я группа - с прогнозом низкой/промежуточной степени тяжести заболевания, хорошего/промежуточного эффекта от терапии - 24 человека (38%), 3-я группа - с прогнозом промежуточной/высокой степени тяжести заболевания, промежуточного/низкого эффекта от терапии - 26 пациентов (41,4%). Пациенты с прогнозом высокой степени тяжести заболевания и неэффективности терапии в нашем исследовании не встречались. В таблицах 2 и 3 пациенты 1-й и 2-й групп по МПИ объединены в одну группу в связи с отсутствием достоверных различий между показателями данных групп. Поражение костного мозга имело место у 40 человек (63,5%), вовлечение костного мозга в опухолевый процесс - у 23 человек. Б-симптомы были отмечены у 32-х пациентов (50,7%). 52 человека (62,6%) имели III-IY стадии заболевания.

Согласно ВОЗ-классификации, в зависимости от степени злокачественности выделялись лимфомы: агрессивные (высокой степени злокачественности), (31 человек, 49,2%), к которым относились иммунобластная, центробластная, анапластическая крупноклеточная, мантийноклеточная лимфома, и индолентные (низкой степени злокачественности), (32 человека, 50,8%), к которым относились пролимфоцитарная, центроцитарная, лимфоплазмоцитарная, MALT-лимфома, лимфома маргинальной зоны. У 53 (84,1%) пациентов были диагностированы В-клеточные лимфомы и у 10 больных - Т-клеточные НХЛ.

Больные были обследованы до лечения и после него.

Все больные, включенные в исследование, в зависимости от стадии заболевания получили от 4 (при I-II стадии) до 6-8 (при III-IV стадии) курсов полихимиотерапии. В терапии использовались стандартные и высокодозные протоколы I-II линии: при агрессивных лимфомах - CHOP (циклофосфан, доксорубицин, винкристин, преднизолон), СНОЕР (циклофосфан, доксорубицин, винкристин, этопозид, преднизолон), DHAP (цитозар, цисплатин, дексаметазон); при индолентных - СОР (циклофосфан, винкристин, преднизолон). Эффект полихимиотерапии оценивался по общему состоянию больного, выраженности Б-симптомов, состоянию лимфоузлов, внутренних органов, анализам периферической крови и костного мозга, биохимическому исследованию, инструментальным методам обследования.

Группу контроля составили 20 клинически здоровых доноров из отделения переливания крови Областного центра крови. Средний возраст доноров был равен 34,4±1,4 годам. Распределение по полу было следующим: 10 (50%) женщин и 10 (50%) мужчин.

Методы клинического, лабораторного и инструментального обследования больных

Обязательный комплекс обследования больных включал сбор жалоб, анамнеза, лабораторные методы: общий анализ крови и мочи, биохимические тесты (общий белок, билирубин, АЛТ, ACT, щелочная фосфатаза, K, Na, протромбиновый индекс, альбумин), уровень ЛДГ и фибриногена для определения биохимической активности опухолевого процесса. Всем пациентам проводилось ультразвуковое исследование органов брюшной полости, рентгенологическое исследование органов грудной клетки, компьютерная томография (КТ) или МРТ (магнитно-резонансная томография) органов грудной клетки и брюшной полости по показаниям, исследование костно-мозгового пунктата, трепанобиоптата. Диагноз заболевания устанавливался на основании гистологического исследования биоптатов лимфоузлов, а также подсчета миелограмм с иммуноцитохимической верификацией опухоли с использованием 37 моноклональных антител к кластерам дифференцировки гемопоэтических клеток.

Получение сыворотки для определения концентрации цитокинов

Кровь забирали из вены, центрифугировали, полученную сыворотку хранили до исследования при температуре -20°С.

Определение концентрации цитокинов IL-1β и IL-6

Концентрации IL-1β и IL-6 в сыворотке крови определялись методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) с применением пероксидазы хрена в качестве индикаторного фермента. Для этой цели использовали тест-системы ProCon IL-1β, ProCon IL-6. Один тип антител иммобилизировали на внутренних поверхностях ячеек планшетов для микротитрования. Другой тип моноклональных антител к независимому эпитопу молекулы искомого интерлейкина находится в наборе для исследования в виде конъюгата с биотином. Индикаторным компонентом является конъюгат пероксидазы хрена со стрептавидином, имеющим очень высокое сродство к биотину. После инкубации и промывок планшетов с иммобилизованными антителами в их ячейки вносили конъюгат пероксидазы со стрептавидином, вновь инкубировали, промывали, вносили субстрат (сыворотку крови пациента) и измеряли активность связанной пероксидазы с использованием автоматического вертикального спектрофотометра для микропланшетов «Multiscan MCC 340». Количественное содержание цитокинов в сыворотке крови выражалось в пкг/мл. Чувствительность метода при определении IL-1β и IL-6 составила 20 пкг/мл. Для количественной оценки результатов твердофазного ИФА цитокинов проводили построение графиков зависимости оптической плотности от концентрации для стандартного антигена и сравниваемых с ним исследуемых образцов.

Определение уровня экспрессии рецепторов к цитокинам IL-1β и IL-6

Определение уровня экспрессии рецепторов к цитокинам IL-1β и IL-6 проводилось в цитологических мазках костного мозга методом иммуноцито-химического исследования с помощью кроличьих поликлональных антител против одного из пептидных концов рецепторов к IL-6, IL-1β («Santa Cruz Biotechnology», США) и моноклональных антикроличьих IgG, конъюгированных с щелочной фосфатазой («SIGMA», США). В качестве системы визуализации использовался субстрат-хромоген («DAKO»). Цитологические субстраты, полученные путем тонкоигольной пункции, наносили на стекло тонким слоем. Приготовленные мазки высушивали при комнатной температуре в течение 2-4 ч, заворачивали каждый отдельно в алюминиевую фольгу и помещали в морозильную камеру (-18°-20°C) до момента использования. Далее мазки размораживались в течение 30 минут при комнатной температуре и в течение 10 минут фиксировались в ацетоне. После фиксации на поверхность мазка наносили первичные кроличьи моноклональные антитела против рецепторов к цитокинам и выдерживали в течение 1 часа в водяной камере согласно инструкции фирмы-производителя антител. Далее мазки промывали в течение 3 минут в фосфатном буфере (РН 7,6) и на поверхность мазка наносили моноклональные антикроличьи IgG, конъюгированные с щелочной фосфатазой, и выдерживали в течение 30 минут в водяной камере. Далее цитологические мазки вновь промывали в фосфатном буфере в течение 3 минут, наносили раствор субстрат-хромогена и выдерживали в течение 15 минут в водяной камере. Далее мазки промывали в течение 3 минут в дистиллированной воде и докрашивали в течение 15 минут гематоксилин-эозином. После удаления избытка гематоксилин-эозина мазки просушивали и производили подсчет клеток, позитивных на наличие рецепторов к цитокинам под световым микроскопом. В каждом поле подсчитывалось не менее 100 клеток костного мозга, среди них определяли количество лимфоидных опухолевых клеток, по отношению к которым определяли долю тех лимфоидных опухолевых клеток, которые несли рецепторы к цитокинам IL-1β и IL-6.

Использовали все формы внутреннего контроля достоверности иммуноцитохимической реакции.

Статистические методы исследования

Для обработки полученных результатов использовали альтернативный анализ, методы вариационной статистики: вычисление средней арифметической (М) и ее ошибки (m), метод оценки достоверности различий показателей между группами по критерию Стьюдента (t) с определением показателя статистической достоверности (ρ<0,05), (Петри А., Сэбин К. Наглядная статистика в медицине. - Москва: Гэотар - Мед. - 2003).

Ниже представлены результаты проведенного исследования.

Сведения, обосновывающие предлагаемый способ

Результаты исследования показывают, что концентрация исследованных цитокинов интерлейкинов IL-1β, IL-6 (табл.2) и уровень экспрессии рецепторов RIL-1β, RIL-6 (табл.3) коррелирует с известными прогностическими факторами тяжести течения, эффективности лечения лимфом: наличием-отсутствием Б-симптомов, поражением костного мозга, концентрацией ЛДГ, уровнем фибриногена, индексом МПИ. Известные факторы чаще всего связаны с распространенностью процесса, массой опухоли и определяют прогноз тяжести течения опухолевого процесса, эффективность терапии.

В нашем исследовании концентрация цитокинов IL-1β, IL-6 и уровень экспрессии рецепторов к IL-1β, IL-6 были достоверно выше у пациентов, относящихся к группе промежуточного/высокого риска в соответствии с МПИ (3-я группа), у больных с Б-симптомами, высоким уровнем ЛДГ и фибриногена, а также с поражением опухолевым процессом костного мозга (КМ), (табл.2, 3).

В таблице 4 приведены сведения, которые показывают наличие корреляции между концентрацией цитокинов IL-1β, IL-6 в сыворотке крови пациентов и уровнем экспрессии рецепторов к данным цитокинам. Высокая концентрация исследуемых цитокинов в сыворотке крови коррелирует с высоким уровнем экспрессии рецепторов к данным цитокинам.

Проведенные исследования показывают также, что эффективность лечения больных НХЛ коррелирует с концентрацией цитокинов IL-1β, IL-6 в сыворотке крови пациентов и уровнем экспрессии рецепторов RIL-1β, RIL-6 на опухолевых клетках КМ до начала лечения (табл.5 и 6).

Группа больных, у которых наблюдался положительный ответ на лечение (исчезновение или уменьшение лимфоузлов, признаков клинической активности, улучшение или нормализация показателей периферической крови и костного мозга), обозначена в табл.5 и 6 знаком «+»; группа больных, у которых отсутствовал эффект от лечения или заболевание прогрессировало, обозначена знаком «-».

У больных группы «-» концентрация цитокинов IL-1β, IL-6 в сыворотке крови и уровень экспрессии рецепторов к данным цитокинам на клетках КМ до начала лечения были достоверно более высокими по сравнению с данными показателями у больных группы «+».

Таким образом, результаты проведенного исследования показывают, что концентрация провоспалительных цитокинов IL-1β, IL-6 и уровень экспрессии рецепторов RIL-1β, RIL-6 могут служить факторами прогноза тяжести течения НХЛ, эффективности терапии данного заболевания.

В таблицах 7 и 8 приведены индивидуальные значения концентрации IL-1β, IL-6 и уровня экспрессии рецепторов RIL-1β, RIL-6, а также значения МПИ у пациентов, лечение которых оказалось эффективным (группа «+»), и у пациентов, лечение которых оказалось неэффективным (группа «-»). Тяжесть течения заболевания оценивали на основе МПИ: первая и вторая группа по МПИ - низкая и низкая/промежуточная степень тяжести заболевания; третья группа по МПИ - промежуточная/высокая степень тяжести заболевания. На основе данных таблиц 7 и 8 были построены таблицы 9-12 для расчета чувствительности, специфичности и прогностичности предлагаемого способа и МПИ.

Чувствительность определяли как долю пациентов с благоприятным прогнозом, которые до начала лечения были точно идентифицированы предлагаемым способом (т.е. по уровню исследуемых показателей были отнесены к группе благоприятного прогноза.

Специфичность определяли как долю пациентов с неблагоприятным прогнозом, которые до начала лечения были точно идентифицированы предлагаемым способом (т.е. по уровню исследуемых показателей были отнесены к группе неблагоприятного прогноза).

Прогностичность благоприятного прогноза определяли как долю пациентов, отнесенных предлагаемым способом к группе благоприятного прогноза, которые характеризовались МПИ, равным 1-2, и хорошим ответом на терапию, по отношению ко всем пациентам, которые предлагаемым способом были отнесены к группе благоприятного прогноза.

Прогностичность неблагоприятного прогноза определяли как долю пациентов, отнесенных предлагаемым способом к группе неблагоприятного прогноза, которые характеризовались МПИ, равным 3, и отсутствием ответа на терапию, по отношению ко всем пациентам, которые предлагаемым способом были отнесены к группе неблагоприятного прогноза.

Получены следующие значения чувствительности, специфичности и прогностичности предлагаемого способа по прогнозированию тяжести течения, эффективности лечения:

чувствительность: а/(а+с)=28/29=97%;

специфичность: d/(b+d)=21/21=100%;

прогностичность благоприятного прогноза: а/(a+b)=28/28=100%;

прогностичность неблагоприятного прогноза: d/(c+d)=21/22=95%.

Как показывают данные таблиц 7 и 8, неблагоприятный прогноз по тяжести течения заболевания совпадает с неблагоприятным прогнозом по эффективности терапии и благоприятный прогноз по тяжести течения заболевания совпадает с благоприятным прогнозом по эффективности терапии у 50 больных из 63 (79%). Данное обстоятельство связано, по-видимому, с недостаточно высокой чувствительностью, специфичностью и прогностичностью МПИ, который использовали для оценки тяжести течения заболевания. Вышеприведенные значения чувствительности, специфичности и прогностичности сделаны на основе табл.9, где учтены указанные 50 пациентов.

Как видно из таблицы 10, чувствительность, специфичность и прогностичность предлагаемого способа по прогнозированию тяжести течения НХЛ имеют следующие значения:

чувствительность: а/(а+с)=28/39=72%,

специфичность: d/(b+d)=21/24=87,5%,

прогностичность благоприятного прогноза: a/(a+b)=28/31=90%,

прогностичность неблагоприятного прогноза: d/(c+d)=21/32=66%.

На основе таблицы 11 рассчитаны чувствительность, специфичность и прогностичность предлагаемого способа по прогнозированию эффективности терапии:

чувствительность: а/(а+с)=31/32=97%,

специфичность: d/(b+d)=31/31=100%,

прогностичность благоприятного прогноза: а/(a+b)=31/31=100%,

прогностичность неблагоприятного прогноза: d/(c+d)=31/32=97%.

Для сравнения приводим значения чувствительности, специфичности и прогностичности МПИ при прогнозе эффективности терапии (табл.12):

чувствительность: а/(а+с)=29/32=90%,

специфичность: d/(b+d)=21/31=68%,

прогностичность благоприятного прогноза: а/(a+b)=29/39=74%,

прогностичность неблагоприятного прогноза: d/(c+d)=21/24=87%.

Таким образом, международный прогностический индекс по всем параметрам при прогнозе эффективности терапии уступает предлагаемому способу.

Клинические примеры

1) Больная Ш., 31 год.

Диагноз: Диффузная В-крупноклеточная лимфома IV с поражением подчелюстных, надключичных, паховых, внутрибрюшных лимфатических узлов, лимфатических узлов средостения, костного мозга.

Жалобы: выраженная слабость, повышенная утомляемость, профузная потливость, головные боли, лихорадка в вечернее время до 38°С, потеря массы тела 10 кг за 2 месяца, увеличение подчелюстных, надключичных и паховых лимфоузлов.

Высокая степень злокачественности, умеренная пролиферативная активность, наличие Б-симптомов.

Лечение: 6 курсов CHOP (циклофосфан, доксорубицин, винкристин, преднизолон).

Эффект лечения: положительный (уменьшение лимфатических узлов до нормальных размеров, исчезновение Б-симптомов, улучшение самочувствия, нормализация показателей периферической крови и костного мозга).

Международный прогностический индекс:

возраст - менее 60 лет 0 баллов, стадия IV 1 балл, число экстранодальных поражений 1 (костный мозг) 0 балл, общесоматический статус 2 - 1 балл, уровень ЛДГ 750,5 ед. 1 балл, максимальный размер опухоли - менее 5 см - 0 баллов.

Итого: 3 балла, 3 группа по МПИ, промежуточная/высокая степень тяжести заболевания и неэффективность терапии.

Прогноз по предлагаемому способу:

Уровень цитокинов: IL-1β - 58,0 пкг/мл (↓93,0),

IL-6 37,0 пкг/мл (↓44,0).

Уровень экспрессии рецепторов к цитокинам:

R-IL-1β 34,0% (↓38%),

R-IL-6 15,0% (↓30%).

По предлагаемому способу в данном случае следует прогнозировать низкую степень тяжести заболевания, положительный эффект от терапии.

2) Больная П., 25 лет.

Диагноз: Т-крупноклеточная анапластическая лимфома IV с поражением всех групп периферических лимфатических узлов, лимфатических узлов средостения, брюшной полости, костного мозга.

Жалобы: слабость, утомляемость, повышенная потливость, малопродуктивный кашель, одышка при минимальной физической нагрузке, увеличение периферических лимфатических узлов.

Высокая степень злокачественности (ВСЗ лимфома), высокая пролиферативная активность, наличие Б-симптомов интоксикации.

Лечение: 6 курсов СНОЕР (циклофосфан, доксорубицин, винкристин, этопозид, преднизолон).

Эффект лечения: отрицательный (рост лимфатических узлов, нарастание признаков интоксикации, ухудшение самочувствия и показателей периферической крови).

Международный прогностический индекс:

возраст - менее 60 лет 0 баллов, стадия IV 1 балл, число экстранодальных поражений 1 (костный мозг) 0 баллов, общесоматический статус 1 - 0 баллов, уровень ЛДГ 135 ед. 0 баллов, максимальный размер опухоли - менее 5 см 0 баллов.

Итого: 1 балл, 1 группа по МПИ, низкая степень тяжести заболевания и хороший эффект от терапии.

Прогноз по предлагаемому способу:

Уровень цитокинов: IL-1β - 193,0 пкг/мл (↑93,0)

IL-6 76,0 пкг/мл (↑44,0)

Уровень экспрессии рецепторов к цитокинам:

R-IL-1β 52,4% (↑38%)

R-IL-6 - 45,4 (↑30%)

По предлагаемому способу в данном случае следует прогнозировать высокую степень тяжести заболевания, неэффективность терапии.

3) Больная Ш., 56 лет

Диагноз: Фолликулярная лимфома (I тип градации) IV с поражением всех групп периферических лимфатических узлов, селезенки, желудка, костного мозга.

Жалобы: выраженная слабость, ночная профузная потливость, потеря массы тела 15 кг за 3 месяца, постоянные боли в левом подреберье и эпигастрии, лихорадка в вечернее время до 38,5°С.

Низкая степень злокачественности, наличие Б-симптомов.

Лечение: 6 курсов CHOP (циклофосфан, доксорубицин, винкристин, преднизолон).

Эффект лечения: отрицательный (рост лимфатических узлов, ухудшение самочувствия, плохая переносимость полихимиотерапии).

Международный прогностический индекс для фолликулярных лимфом:

возраст менее 60 лет - 0 баллов, стадия IV 1 балл, число нодальных областей поражения - более 3 1 балл, уровень ЛДГ в сыворотке крови 178 ед. 0 баллов, уровень гемоглобина в крови 125 г/л 0 баллов.

Итого: 2 балла, 2-я группа по МПИ, средняя степень тяжести заболевания, умеренный эффект от терапии.

Прогноз по предлагаемому способу:

Уровень цитокинов: IL-1β - 175,0 пкг/мл (↑93,0)

IL-6 60,0 пкг/мл (↑44,0)

Уровень экспрессии рецепторов к цитокинам:

R-IL-1β 56,7% (↑38%)

R-IL-6 77,0% (↑30%)

По предлагаемому способу в данном случае следует прогнозировать высокую степень тяжести заболевания, неэффективность терапии.

4) Больной Д, 56 лет

Диагноз: Фолликулярная лимфома (I тип градации) IV с поражением всех групп периферических лимфатических узлов, лимфатических узлов забрюшинного пространства, печени, селезенки, костного мозга.

Жалобы: выраженная слабость, повышенная потливость, снижение аппетита, потеря массы тела 5 кг за 2 месяца, увеличение подмышечных и шейных лимфатических узлов.

Низкая степень злокачественности, низкая пролиферативная активность, наличие Б-симптомов.

Лечение: 6 курсов CHOP (циклофосфан, доксорубицин, винкристин, преднизолон).

Эффект лечения: положительный (уменьшение лимфатических узлов, исчезновение Б-симптомов, нормализация показателей периферической крови и костного мозга).

Международный прогностический индекс для фолликулярных лимфом: возраст - менее 60 лет 0 балл, стадия IV 1 балл, число нодальных областей поражения - более 4 1 балл, уровень ЛДГ в сыворотке крови 205 ед. 0 баллов, уровень гемоглобина в крови 90,8 г/л 1 балл.

Итого: 3 балла, группа неблагоприятного прогноза, высокая степень тяжести заболевания, неэффективность терапии.

Прогноз по предлагаемому способу:

Уровень цитокинов: IL-1β - 52,0 пкг/мл (↓93,0)

IL-6 21,0 пкг/мл (↓44,0)

Уровень экспрессии рецепторов к цитокинам:

R-IL-1β 35,5% (↓38%)

R-IL-6 22,0% (↓30%)

По предлагаемому способу в данном случае следует прогнозировать низкую степень тяжести заболевания, хороший эффект от терапии.

Таблица 1
Международный прогностический индекс (МПИ, IPI)
	Факторы	Градация фактора	Прогностическая оценка (в баллах)
1	Возраст	Менее 60 лет	0
Более 60 лет	1
2	Стадия лимфомы	I/II	0
III/IV	1
3	Число экстранодальных поражений	0,1	0
2 и более	1
4	Общесоматический статус по ВОЗ	0,1	0
2 и более	1
5	Уровень общей ЛДГ	Нормальный	0
Повышен	1
6	Максимальный размер опухоли	Менее 5 см	0
5 см и более	1

Таблица 2
Связь между уровнем цитокинов IL-1β и IL-6 в сыворотке крови больных НХЛ и наличием Б-симптомов, концентрацией ЛДГ, уровнем фибриногена, отношением к группе МПИ
№ п.п.	Группы больных	Провоспалительные цитокины
IL-1β, пкг/мл	IL-6, пкг/мл
1	Здоровые доноры, n=20	24,3±3,2	28,9±4,3
2	Лимфома (все больные) n=63	106,4±49,8	47,3±14,3
3	Б-симптомы есть, n=32	136,2±44,0	55,0±12,3
4	Б-симптомов нет, n=31	75,6±34,9	39,2±11,6
Р3-4<0,01	Р3-4<0,01
5	Нормальный уровень ЛДГ, n=40	85,5±40,7	43,5±14,2
6	Повышенный уровень ЛДГ, n=23	121,3±49,5	51,1±14,6
Р5-6<0,01	Р5-6<0,01
7	Нормальный уровень фибриногена, n=38	78,9±37,1	39,1±9,8
8	Повышенный уровень фибриногена, n=25	148,1±35,9	59,9±10,8
Р7-8<0,05	Р7-8<0,05
9	Поражение КМ, n=40	144,6±36,7	59,3±9,8
10	Вовлечение КМ, n=23	66,4±17,1	35,4±5,4
Р9-10<0,001	Р9-10<0,001
11	1-я и 2-я группа по индексу МПИ, n=39	85,5±40,7	43,5±14,1
12	3-я группа по индексу МПИ, n=24	140,3±45,0	53,4±12,6
P11-12<0,001	Р11-12<0,01
n - число больных в группе

Таблица 3
Связь между уровнем экспрессии рецепторов к цитокинам IL-1β и IL-6 на клетках КМ больных НХЛ и наличием Б-симптомов, концентрацией ЛДГ, уровнем фибриногена, отношением к группе МПИ
№	Группы больных	Рецепторы к цитокинам
R-IL-1β, %	R-IL-6, %
1	Все больные НХЛ, n=63	42,5±19,3	34,7±19,1
2	Б-симптомы есть, n=32	54,0±17,9	47,7±17,5
3	Б-симптомов нет n=31	30,7±12,2	21,4±9,0
Р2-3<0,001	Р2-3<0,001
4	Нормальный уровень ЛДГ, n=40	34,7±14,7	27,1±15,7
5	Повышенный уровень ЛДГ, n=23	52,7±21,7	39,7±14,9
Р4-5<0,01	Р4-5<0,01
6	Нормальный уровень фибриногена, n=38	33,0±13,8	24,7±14,8
7	Повышенный уровень фибриногена, n=25	57,0±17,3	50,0±14,4
	Р6-7<0,001	Р6-7<0,001
8	1-я + 2-я группа по индексу МПИ, n=39	34,7±14,7	27,1±15,7
9	3-я группа по индексу МПИ, n=24	55,2±19,1	47,1±18,0
	Р8-9<0,01	P8-9<0,01
n - число пациентов в группе

Таблица 5
Концентрации цитокинов IL-1β и IL-6 в сыворотке крови больных НХЛ до лечения и фактический результат лечения
№ п.п.	Группы больных	Провоспалительные цитокины
IL-1β, пкг/мл	IL-6, пкг/мл
1	Здоровые доноры, n=20	24,3±3,2	28,9±4,3
2	НХЗЛ (все больные), n=63	106,4±49,8	47,3±14,3
P1-2<0,05	P1-2<0,05
3	Группа «+», n=32	65,6±15,6	35,5±4,85
P1-3<0,05	P1-3<0,05
4	Группа «-», n=31	148,5±35,8	59,3±10,0
Р3-4<0,01	Р3-4<0,01

Таблица 6
Уровень экспрессии рецепторов к цитокинам IL-1β и IL-6 на опухолевых клетках КМ больных НХЛ до начала терапии и фактический результат лечения
		R-IL-1β, %	R-IL-6, %
1	Группа «+», n=32	28,5±8,7	18,7±2,4
2	Группа «-», n=31	57,0±16,1	51,3±14,0
	P1-2<0,01	P1-2<0,01

Таблица 7
Значения исследуемых параметров и МПИ у пациентов, лечение которых было эффективным
№ пациента	IL-1β, пкг/мл	IL-6, пкг/мл	R-IL-1β, %	R-IL-6, %	Фактический эффект от терапии	МПИ
1	56	30	15,5	21	+	1
2	100	34	34,4	18,5	+	2
3	110	36	20,2	15	+	1
4	68	33	26	20	+	1
5	50	39	22	18	+	2
6	48	34	32,1	20	+	1
7	75	40	24,5	18	+	1
8	68	35	33	15,5	+	2
9	53	30	23	18	+	2
10	63	35	32,4	19	+	2
11	89	38	0	16,4	+	2
12	52	21	35,5	22	+	3
13	55	37	15,5	20,1	+	2
14	52	35	24,6	15,4	+	2
15	62	43	30	22,2	+	2
16	98	40	41,1	16	+	1
17	58	37	34	15	+	3
18	60	43	21,1	20,4	+	2
19	66	41	37	23,2	+	2
20	70	35	22,2	20,5	+	1
21	62	25	24	18	+	1
22	55	33	34,7	17	+	2
23	58	42	34,4	22,4	+	1
24	75	36	32,1	16	+	2
25	53	30	22	20	+	1
26	58	35	35,5	16	+	2
27	67	36	38	18	+	2
28	60	32	39	20	+	1
29	50	37	39	19	+	2
30	87	38	33,1	21	+	2
31	55	41	30,9	21	+	2
32	67	36	26	17	+	3

Таблица 8
Значения исследуемых параметров и МПИ у пациентов, лечение которых оказалось неэффективным
№ пациента	IL-1β, пкг/мл	IL-6, пкг/мл	R-IL-1β, %	R-IL-6, %	Фактический эффект от терапии	МПИ
1	175	60	56,7	77	-	2
2	168	63	55,5	57,6	-	2
3	176	62	41,5	40	-	3
4	180	46	72	55	-	3
5	106	55	48,5	52	-	3
6	95	63	67	58	-	1
7	193	76	52,4	45,5	-	1
8	100	64	90	57	-	3
9	167	54	38,4	45,2	-	3
10	168	65	92,1	36,6	-	3
11	100	69	36,6	56	-	2
12	94	72	48,3	55	-	3
13	106	60	67,7	34	-	3
14	97	55	44	58,6	-	2
15	188	48	48,2	48,2	-	3
16	160	44	45,2	42,2	-	3
17	189	76	46	35,5	-	1
18	145	75	75,5	38	-	2
19	155	65	89,9	92,1	-	3
20	190	75	35,6	39	-	3
21	99	48	66,3	89,1	-	3
22	165	52	46,7	56,2	-	3
23	145	65	56,7	44	-	2
24	175	45	55,5	47,5	-	3
25	188	44	41,5	56	-	3
26	108	54	72	55	-	3
27	193	62	43,1	38,5	-	3
28	108	52	47,1	42,3	-	2
29	176	61	75,5	55	-	3
30	145	45	45	46,6	-	3
31	150	66	67	38	-	3

Таблица 9
Таблица для расчета чувствительности, специфичности и прогностичности предлагаемого способа (тяжесть течения, эффективность лечения)
Концентрации цитокинов IL-1β, IL-6, пкг/мл; уровень экспрессии RIL-1β и RIL-6, %	Количество пациентов
1-я, 2-я группы по МПИ, положительный эффект от терапии	3-я группа по МПИ, отрицательный эффект от терапии	Всего пациентов
IL-1β<93, IL-6<44, RIL-1β<38, RIL-6<30%, или 3 из данных параметров имеют величины ниже точек разделения	(28) а	0 (b)	28 (a+b)
IL-1β≥93, IL-6≥44, RIL-1β≥38, RIL-6≥30%, или 3 из данных параметров имеют величины, равные или превышающие точки разделения	1 (с)	21 (d)	22 (c+d)
Всего пациентов:	29	21	50 (n=a+b+c+d)

Таблица 10
Таблица для расчета чувствительности, специфичности и прогностичности предлагаемого способа (тяжесть течения заболевания)
Концентрации цитокинов IL-1β, IL-6, пкг/мл; уровень экспрессии RIL-1β и RIL-6, %	Количество пациентов
1,2 группа по МПИ	3-я группа по МПИ	Всего
IL-1β<93, IL-6<44, RIL-1β<38, RIL-6<30%, или 3 из данных параметров имеют величины ниже точек разделения	28 (а)	3(b)	31 (a+b)
IL-1β≥93, IL-6≥44, RIL-1β≥38, RIL-6≥30%, или 3 из данных параметров имеют величины, равные или превышающие точки разделения	11 (с)	21 (d)	32 (c+d)
Всего пациентов:	39	24	63

Таблица 11 Таблица для расчета чувствительности, специфичности и прогностичности предлагаемого способа (эффективность лечения)
Концентрации цитокинов IL-1β, IL-6, пкг/мл; уровень экспрессии RIL-1β и RIL-6, %	Количество пациентов, лечение которых оказалось эффективным	Количество пациентов, лечение которых оказалось неэффективным	Всего пациентов
IL-1β<93, IL-6<44, RIL-1β<38, RIL-6<30%, или 3 из данных параметров имеют величины ниже точек разделения	31 (а)	0 (b)	31 (a+b)
IL-1β≥93, IL-6≥44, RIL-1β≥38, RIL-6≥30%, или 3 из данных параметров имеют величины, равные или превышающие точки разделения	1 (с)	31 (d)	32 (c+d)
Всего пациентов:	32	31	63 (n=a+b+c+d)

Таблица 12
Таблица для расчета чувствительности, специфичности и прогностичности МПИ (эффективность лечения)
Группа прогноза по МПИ	Количество пациентов
Лечение было эффективным	Лечение было неэффективным	Всего
МПИ=1, 2	29 (а)	10 (b)	39 (a+b)
МПИ=3	3 (с)	21 (d)	24 (c+d)
Всего пациентов:	32	31	63 (n=a+b+c+d)

Способ прогнозирования тяжести течения, эффективности терапии лимфом, отличающийся тем, что до лечения в сыворотке крови пациента определяют концентрации провоспалительных цитокинов интерлейкинов IL-1β и IL-6, а в мазках костного мозга определяют доли тех лимфоидных опухолевых клеток среди всех лимфоидных опухолевых клеток, которые несут на своей поверхности рецепторы к цитокинам IL-1β и IL-6, и при концентрации IL-1β, равной или превышающей 93 пкг/мл, концентрации IL-6, равной или превышающей 44 пкг/мл, доле лимфоидных опухолевых клеток, несущих рецепторы к цитокину IL-1β, равной или превышающей 38% от всех лимфоидных опухолевых клеток, доле лимфоидных опухолевых клеток, несущих рецепторы к цитокину IL-6, равной или превышающей 30% от всех лимфоидных опухолевых клеток, а также в случае, когда значения трех параметров из указанных четырех равны их значениям в точках разделения или превышают их, делают вывод о неблагоприятном прогнозе, а при концентрации IL-1β ниже 93 пкг/мл, концентрации IL-6 ниже 44 пкг/мл, доле лимфоидных опухолевых клеток, несущих рецепторы к цитокину IL-1β, ниже 38% от всех лимфоидных опухолевых клеток, доле лимфоидных опухолевых клеток, несущих рецепторы к цитокину IL-6, ниже 30% от всех лимфоидных опухолевых клеток, а также в случае, когда значения трех параметров из указанных четырех ниже их значений в точках разделения, делают вывод о благоприятном прогнозе.