Способ измерения тепловой мощности на капиллярном дифференциальном титрационном калориметре
Основными областями применения способа измерения тепловой мощности на капиллярном дифференциальном титрационном калориметре являются исследования разбавленных водных растворов белков в биологии, биотехнологии, биохимии, физико-химической биологии, медицине. Данный способ позволяет при исследовании разбавленных водных растворов белков выделять кинетическую и теплоемкостную составляющие из регистрируемого калориметром сигнала. При этом обеспечиваются исследования дисперсных систем. Решение задачи измерения тепловой мощности на капиллярном дифференциальном титрационном калориметре, который обеспечивает измерение тепловой мощности при введении модуляции в закон температурного сканирования калориметрических камер, достигается за счет того, что дополнительно выполняются измерения в сканирующем режиме с модуляцией, осуществляемом благодаря циклическому нагреву экрана, при котором нагрев экрана чередуется с переходом в изотермический режим во всем температурном диапазоне при заданном шаге изменения температуры экрана, в котором размещены измерительные объемы калориметрических камер. Технический результат - измерение тепловой мощности на капиллярном дифференциальном титрационном калориметре, который дополнительно обеспечивает измерения мощности тепловых процессов в сканирующем режиме с модуляцией. 3 з.п. ф-лы, 8 ил.
Основными областями применения способа измерения тепловой мощности на капиллярном дифференциальном титрационном калориметре являются исследования разбавленных водных растворов белков в биологии, биотехнологии, биохимии, физико-химической биологии, медицине.
Титрационные и сканирующие калориметры позволяют получать не только данные о термодинамике взаимодействий изучаемых систем, но и полное термодинамическое описание нативного состояния биомолекул и их промежуточных состояний, которые проявляются под воздействием температурного сканирования [1]. Кроме того, в последние годы активно развивается модуляционная динамическая сканирующая калориметрия, позволяющая выделять теплоемкостную и кинетическую составляющие из измеренного сигнала тепловой мощности [2]. В 2007 году на модуляционном сканирующем микрокалориметре (МДСМ), созданном в Институте биологического приборостроения РАН, выполнены измерения тепловой мощности при нагреве водного раствора белка коллаген, позволившие впервые обнаружить кинетическую составляющую в сигнале тепловой мощности при плавлении белка, что открывает перспективы изучения биосинтеза, структуры и функций белков на качественно новом уровне. Таким образом, результаты данных исследований показывают перспективность создания модуляционных сканирующих калориметров для изучения разбавленных водных растворов белков, которые до настоящего времени исследуются на адиабатических сканирующих калориметрах типа ДАСМ, которые, однако, не обеспечивают модуляционный режим работы. На фиг.1 приведены данные измерений теплоемкостной и кинетической составляющих тепловой мощности при нагреве раствора коллагена: 1.85 мг коллагена в 72.15 мкл воды; образец сравнения - 72.15 мкл воды; циклический режим сканирования с временем нагрева и изотермического режима 90 с; скорость нагрева 5 К/мин; диапазон температур от 15 до 75°С; С - зарегистрированный МДСМ сигнал, А - кинетическая составляющая тепловой мощности, В - теплоемкостная составляющая тепловой мощности. При этом калориметры типа ДАСМ регистрируют в десятки раз меньшие энергии, чем это могут сделать динамические ДСК. Однако калориметры типа ДАСМ наряду с указанным ограничением не обеспечивают исследования дисперсных систем, что существенно ограничивает выполнение современных исследований. Современные динамические сканирующие и адиабатические сканирующие калориметры при исследовании дисперсных систем не обеспечивают условий, предотвращающих выпадение осадка из исследуемого образца, что нарушает требуемые условия тепло- и массообмена. Динамическая модуляционная калориметрия также не решает в полном объеме поставленной задачи, так как накладывает еще и ограничения из-за недостаточной чувствительности при исследованиях белков малых концентраций. Выполненные исследования дисперсных систем на капиллярном дифференциальном титрационном калориметре КТД2156 [3] показали, что в данном приборе при исследовании дисперсной системы не возникает осадка благодаря эффективной системе перемешивания. Таким образом, в настоящее время актуальна задача комплексного решения указанных проблем. Это может быть достигнуто в капиллярном титрационном калориметре, благодаря новому способу измерения тепловой мощности на капиллярном дифференциальном титрационном калориметре.
Наиболее близким по технической сущности является метод для дифференциального анализа с использованием реальной и мнимой компоненты сигнала по патенту ЕР 0803061 [4], реализованный, например, в калориметре DSC-7 (Perkin-Elmer Corporation). Начиная с 90-х годов в мировой практике развивается новый вид ДСМ - модуляционный ДСМ (МДСМ). Анализ патентов нескольких последних лет показал применимость метода МДСМ в широком спектре решаемых практических задач. Выявлены патенты USA 1999-2004 (6313216; 6613373; 6380154; 6399385; 6184269; 6171615; 6096835; 5958322; 5932626), касающиеся следующего: синтеза резин для покрышек; низкокалорийного крахмала; синтетических белков-носителей лекарств; технологий лиофильной сушки; решения экологических проблем при производстве материалов; технологий создания носителей лекарств; решения экологических проблем при создании красящих материалов; создания нетканых несминаемых материалов; создания оптических материалов с высоким оптическим преломлением). Основным достоинством модуляционного ДСМ является его способность выделять из суммарного сигнала теплоемкостную и кинетическую составляющие. Измеряемая на МДСМ тепловая мощность связана теплоемкостной и кинетической составляющими сигнала уравнением [2]
dQ/dt=CpdT/dt+f(t,T)
где dQ/dt - измеряемая тепловая мощность; Ср - теплоемкость образца при постоянном давлении; dT/dt - скорость нагрева; f(t,Т) - тепловая мощность кинетического процесса при химических и физических трансформациях.
Метод по патенту ЕР 0803061 [4] - распространенный метод для разделения взаимно перекрывающихся процессов, реализованный, например, в приборе DSC822e Mettler Toledo (Швейцария) и ряде других динамических сканирующих калориметров Q1000, Q100 и др. фирмы ТА Instruments (США). В данном методе температурная программа состоит из последовательности изотермических участков, разделенных участками нагрева. По тепловому потоку на стадии нагрева определяется теплоемкость, а кинетическая составляющая определяется по тепловому потоку на изотермических стадиях. Данный способ предусматривает регулирование температуры с помощью системы автоматического регулирования (CAP) непосредственно калориметрической ячейки динамического дифференциального сканирующего калориметра (ДСК). Учитывая то, что калориметрическая камера ДСК является малоинерционным объектом первого порядка, данный способ обеспечивает высокое быстродействие с длительностью переходных процессов не более нескольких секунд. Это позволяет выполнять исследования в модуляционном режиме при скоростях сканирования до десятков градусов в минуту, что обеспечивает изучение довольно тонких тепловых эффектов, как, например, процесс стеклования в полимерах в тонких пленках. Однако для исследования разбавленных растворов белков динамическая калориметрия не применяется, так как водные растворы белков исследуются при низких скоростях сканирования, максимальная скорость не превышает нескольких градусов в минуту, а при таких скоростях разрешение ДСК по измеряемой тепловой мощности недостаточно. Соответственно в научной литературе нет публикаций по исследованию разбавленных водных растворов белков с использованием ДСК.
Заявляемый способ измерения тепловой мощности на капиллярном дифференциальном титрационном калориметре в полном объеме может быть реализован в капиллярном дифференциальном титрационном калориметре (далее Трек-калориметр) [3, 5, 6]. Название «Трек-калориметр» подчеркивает новизну построения калориметра. В нем добавка равномерно распределяется по длине калориметрической камеры подобно следу, оставляемому дозирующей иглой при ее перемещении. Данный калориметр обладает чувствительностью на уровне 10 нановатт (2000), что может обеспечить измерения даже на минимальных скоростях сканирования порядка 0.1 град/мин. Система ввода образца и перемешивания в Трек-калориметре обеспечивает работу с дисперсными системами. В Трек-калориметре пассивный тепловой шунт и первый термостатирующий экран камер изготовлены из материала с высокой температуропроводностью с обеспечением надежного теплового контакта в месте их соединения. Калориметрические камеры также изготовлены из материала с высокой температуропроводностью. Заделка пассивных частей камер также обеспечивает надежный тепловой контакт между измерительными объемами калориметрических камер и тепловым шунтом. Это позволяет обеспечить соответствие температур между термостатирующим экраном камер и измерительными объемами калориметрических камер в пределах 0.1 град. при скорости изменения температуры экрана до 0.2 град/мин [7]. Однако Трек-калориметр до настоящего времени используется только для измерения мощности тепловых процессов в исследуемых перемешиваемых вибрационным устройством образцах в изотермическом режиме в калориметрических камерах. При этом Трек-калориметр не обеспечивает измерения мощности тепловых процессов в калориметрических камерах в сканирующем режиме с модуляцией.
Задача изобретения - предложить способ измерения тепловой мощности на капиллярном дифференциальном титрационном калориметре, который дополнительно обеспечивает измерения мощности тепловых процессов в сканирующем режиме с модуляцией.
Предлагается:
1. Способ измерения тепловой мощности на капиллярном дифференциальном титрационном калориметре, заключающийся в измерении мощности тепловых процессов в исследуемых перемешиваемых вибрационным устройством образцах в изотермическом режиме в калориметрических камерах, измерительные объемы которых размещены в термостатирующем экране камер и ограничены тепловым шунтом, соединяющим калориметрические камеры с термостатирующим экраном, отличающийся тем, что дополнительно обеспечивают измерения мощности тепловых процессов в сканирующем режиме с модуляцией, осуществляемом путем циклического нагрева термостатирующего экрана камер, при этом нагрев термостатирующего экрана камер чередуют с переводом термостатирующего экрана камер в изотермический режим во всем температурном диапазоне при заданном шаге изменения температуры термостатирующего экрана камер.
2. Способ по п.1, при котором измеряют тепловую мощность в заданном интервале температур при выбранных скорости сканирования, продолжительности периода нагрева и продолжительности периода изотермического режима при калориметрических камерах, заполненных образцом сравнения, измеряют тепловую мощность в заданном интервале температур при выбранных скорости сканирования, продолжительности периода нагрева и продолжительности периода изотермического режима при рабочей калориметрической камере, заполненной исследуемым образцом, и при эталонной калориметрической камере, заполненной образцом сравнения.
3. Способ по п.1, при котором изотермические режимы осуществляют системой автоматического регулирования температуры, а режимы температурного сканирования осуществляют путем подачи в нагреватель термостатирующего экрана камер фиксированного значения тепловой мощности, обеспечивающей температурное сканирование калориметрических камер.
4. Способ по п.1, при котором изотермические режимы и режимы температурного сканирования калориметрических камер осуществляют системой автоматического регулирования.
Для иллюстрации реализации способа в Трек-калориметре на фиг.2, 3 и 4 представлены схематические диаграммы работы калориметра и обработки данных в модуляционном режиме.
Осуществление способа по п.1 представлено диаграммой D на фиг.3, на которой в виде импульсов зарегистрированы циклы нагрева экрана. В этих циклах разогрев ведется до установившегося значения переходного процесса. На диаграмме этот процесс регистрируется в виде нарастающей части импульса. Переход в изотермический режим регистрируется в виде спадающей части импульса. Частота импульсов определяется заданным шагом изменения температуры экрана, в котором размещены измерительные объемы калориметрических камер. Указанные импульсы регистрируются в Трек-калориметре по сигналу измерительной термобатареи, установленной на рабочих объемах калориметрических камер. Поскольку, как было отмечено выше, закон изменения температуры камер соответствуют закону изменения температуры экрана, то и камеры нагреваются циклически. В этом режиме в виде импульсов регистрируется тепловая мощность, соответствующая тепловым процессам, происходящим в рабочих объемах калориметрических камер. Диаграмма D соответствует наличию в рабочей камере исследуемого образца и наличию образца сравнения в эталонной камере. Данный режим температурного сканирования Трек-калориметра аналогичен по своей сути с организацией режима сканирования в адиабатическом калориметре. В адиабатическом калориметре этот режим осуществляется за счет интегрирования заданной в калориметрические камеры постоянной тепловой мощности, т.к. у калориметрических камер исключен теплообмен с термостатирующим экраном камер оболочкой за счет равенства температуры камер и оболочки. При этом закон изменения температуры в узком интервале температур линеен, т.к. в узком диапазоне температур теплоемкость камер постоянна. В Трек-калориметре изотермические условия обеспечиваются за счет автоматического поддержания заданной разности температур между термостатирующим экраном камер и экраном термохолодильника.
Осуществление способа по п.2 представлено диаграммой на фиг.2 и диаграммой С на фиг.3. На диаграмме фиг.2 представлена измеренная тепловая мощность в интервале температур от 26.6 до 36.6°С (соответственно, временной интервал от 360 до 3960 с) при скорости сканирования 0.2 К/мин с интервалами нагрева и изотермического режима, равными 180 с, при калориметрических камерах, заполненных образцом сравнения (базовая линия). На диаграмме С фиг.3 представлена измеренная тепловая мощность в интервале температур от 26.6 до 36.6°С (соответственно, временной интервал от 360 до 3960 с) при скорости сканирования 0.2 К/мин с интервалами нагрева и изотермического режима, равными 180 с, при рабочей калориметрической камере, заполненной исследуемым образцом, и при эталонной калориметрической камере, заполненной образцом сравнения.
Осуществление способа по п.3 представлено диаграммами фиг.2 и 3. Алгоритм нагрева экрана предусматривает автоматический переход от управления подачей широтно-модулированных импульсов (далее ШИМ) фиксированной мощности в нагревательный элемент экрана в режиме разогрева к изотермическому режиму, который обеспечивается CAP температуры экрана. Переход из изотермического режима в режим температурного сканирования калориметрических камер обеспечивается благодаря увеличению или уменьшению тепловой мощности в нагревателе экрана в сравнении с мощностью, обеспечивающей изотермический режим. В случае уменьшения тепловой мощности в термостатирующем экране камер происходит охлаждение данного экрана с постоянной скоростью указанным приращением тепловой мощности. Отсутствие колебаний и перерегулирований при нагреве термостатирующего экрана камер в данном режиме исключает тепловые помехи в системе измерения тепловой мощности Трек-калориметра. В сканирующем режиме термостатирующий экран камер разогревается за счет интегрирования тепловой мощности, так как теплообмен термостатирующего экрана камер с экраном термохолодильника в режиме сканирования не изменяется благодаря тому, что автоматически поддерживается постоянная разность между указанными экранами.
Осуществление способа по п.4 предусматривается алгоритмом автоматического регулирования температуры экрана как в изотермическом режиме, так и в сканирующем режиме. Требуемая точность и качество регулирования температуры экрана, связанного через тепловой шунт хорошим тепловым контактом с калориметрическими камерами, в изотермическом режиме обеспечиваются CAP с астатизмом первого порядка благодаря низкой ее полосе пропускания и добротности. Данная CAP в режиме автоматического регулирования при температурном сканировании экрана требует значительных усложнений для обеспечения заданного качества и точности регулирования указанного распределенного объекта, т.к. все отклонения температуры экрана от заданного закона изменения температуры экрана приводят к снижению чувствительности калориметра за счет тепловых помех, передаваемых от экрана на камеры.
На фиг.4 представлены графики по расчетам кинетической и теплоемкостной составляющих зарегистрированного процесса: С - зарегистрированный Трек-калориметром сигнал, содержащий обе составляющих; А - кинетическая составляющая зарегистрированной тепловой мощности, вычисленная как разность между значениями тепловой мощности в изотермическом режиме диаграммы С (фиг.3) и базовой линии (фиг.2) для каждого цикла; В - теплоемкостная составляющая тепловой мощности, вычисленная как разность между графиками С и А.
Реализация заявленного способа осуществлена в известном Трек-калориметре.
На фиг.5 представлена функциональная схема Трек-калориметра, включающая следующие элементы: рабочую 1 и эталонную 2 калориметрические камеры, пассивный тепловой шунт 3, термостатирующий экран камер 4, активный тепловой шунт 5, измерительная термобатарея 6, нагревательные элементы 7 и 8, термохолодильник 9, датчики температуры 10 и 11, многоканальный измерительный усилитель 12, компьютер 13, усилитель мощности 14, нагреватель термостатирующего экрана камер 15, нагреватель активного шунта 16, нановольтметр 17, шприц для рабочей камеры 18, шприц для эталонной камеры 19, корпус шприцев 20, поршни дозирующих шприцев 21 и 22, связывающую пластину 23, винтовые механизмы 24 и 25, шаговые двигатели 26 и 27, вибрационное устройство 28.
Отмеченные выше технические решения позволили оптимизировать рабочий объем камеры, минимизировать тепловой шум прибора и упростить конструкцию калориметра. В результате использован прямой капилляр внутренним диаметром 1.4 мм, с рабочим объемом камеры 78.5 мкл; инъекционное устройство, содержащее иглу, перемещающуюся внутри калориметрической камеры по всей ее длине с помощью средства линейного перемещения.
Это позволяет равномерно распределять реагент, вводимый в виде тонкого жгута, в объеме другого реагента по всей длине капиллярных калориметрических камер. Изотермические условия калориметрических камер дифференциального титрационного калориметра обеспечиваются термостатирующим экраном камер и активным тепловым шунтом, размещенными в термохолодильнике. При введении дозы производится продольное перемещение шприцев механизмом 24 на всю длину калориметрических камер. Одновременно с этим производится перемещение поршней механизмом 25. За счет различной величины перемещений механизмов 24 и 25 шприцами осуществляется дозирование заданного количества реагентов. Для приведения игл инъекционного устройства в колебательное движение с компьютера 13 подается сигнал заданной частоты, который через блок 14 поступает на вибрационное устройство 28. В режиме измерения тепловой мощности без обратной связи сигнал с термобатареи 6, пропорциональный тепловой мощности, измеряется нановольтметром 17, снабженным интерфейсом RS-232, через который он подается на компьютер, регистрирующий тепловую мощность как функцию времени.
На Фиг.6 представлена структура программного обеспечения (ПО) Трек-калориметра. Этот калориметр является современным автоматизированным прибором. Программно в нем реализуются все основные функции: измерение, управление, обработка данных, отображение информации и др. Программирование осуществляется на уровне функциональных блок-диаграмм.
Алгоритм нагрева экрана предусматривает автоматический переход от управления температурой экрана через CAP к управлению подачей импульсов ШИМ фиксированной мощности в нагревательный элемент экрана 15 через усилитель мощности 14, управляемый компьютером 13. В этом режиме не создаются тепловые помехи в системе измерения тепловой мощности, трек-калориметр обеспечивает измерение на максимальной чувствительности в сканирующем режиме. Алгоритм нагрева экрана предусматривает автоматический переход от управления подачей импульсов ШИМ фиксированной мощности в нагревательный элемент экрана 15 через усилитель мощности 14, управляемый компьютером 13, к регулированию температурой экрана через CAP, подающей в нагреватель экрана 15 через усилитель 14 импульсы ШИМ в режиме следящей системы.
На фиг.7 приводится термограмма, полученная на Трек-калориметре, при охлаждении со скоростью 0.228 К/мин водного раствора poly(N-isopropylacrylamide), на фиг.8 приводится термограмма, полученная на Трек-калориметре, при нагревании со скоростью 0.276 К/мин этого же образца. Эти результаты впервые демонстрируют возможность работы в сканирующем режиме дифференциального титрационного калориметра (Трек-калориметра). Испытания показали, что чувствительность калориметра в сканирующем режиме не снижается, а переходной процесс заканчивается на интервале 0.6 град. при скорости сканирования около 0.25 К/мин, что заведомо достаточно при калориметрических измерениях модуляционным методом тепловых процессов в растворах белков. Таким образом, заявленный способ измерения тепловой мощности на капиллярном дифференциальном титрационном калориметре при его реализации в Трек-калориметре обеспечивает калориметрические исследования в модуляционном сканирующем режиме. При этом преимущество по чувствительности и массе образца Трек-калориметра в сравнении с динамическим ДСК позволяет изучать на Трек-калориметре процессы в разбавленных растворах белков (порядка 0.1% по весу), регистрируя в десятки раз меньшие энергии, чем это могут сделать динамические ДСК, и на порядок меньшие энергии в сравнении с адиабатическими калориметрами типа ДАСМ. Таким образом, предложенное изобретение решает задачу обеспечения калориметрических исследований разбавленных растворов белков комплексно: Трек-калориметр не уступает по чувствительности в сканирующем модуляционном режиме специализированному сканирующему калориметру типа ДАСМ и превосходит его благодаря новым возможностям разделения измеряемого сигнала на теплоемкостную и кинетическую составляющие; превосходит динамические и адиабатические калориметры благодаря наличию эффективного перемешивающего устройства, позволяющего работать с дисперсными системами; превосходит адиабатические сканирующие калориметры и титрационные калориметры благодаря обеспечению функций указанных калориметров в Трек-калориметре. Таким образом, способ измерения тепловой мощности на капиллярном дифференциальном титрационном калориметре предложен впервые, обладает важными преимуществами и имеет существенную новизну в сравнении с известным способом по патенту ЕР 0803061 [4].
Литература
1. E.Freire, R.L.Biltonen // Biopolymers. - 1978. - Vol.l7. - P.463-479.
2. M.Reading. Modulated Differential Scanning Calorimetry - A New Way Forward In Materials Characterization. TRIP 1(1993) 248-253.
3. STUDYING DISPERSOID SYSTEMS Method of introducing an injecting needle into calorimetric chamber of capillary titration calorimeter / G.V.Kotelnikov, Sophia P.Moiseyeva, E.V.Mezhburd, E.I.Maevsky and Elena V.Grishina // Journal of Thermal Analysis and Calorimetry, Vol.81 (2005) 255-259 (Springer, Dordrecht, The Netherlands).
4. Patent EP 0803061, Int. Cl.7: G01N 25/00 Apparatus and method for differential analysis using real and imaginery signal components / Schawe J. and Margulies M. - 23 p.: fig.
5. G.V.Kotelnikov, S.P.Moiseyeva, E.V.Mezhburd and V.P.Krayev METHOD OF SEPARATING THE SENSITIVE VOLUME OF CALORIMETRIC CELLS IN A DIFFERENTIAL TITRATION CALORIMETER Journal of Thermal Analysis and Calorimetry, 2000, vol.62, 39-50. (Kluwer Academic Publishers Dordrecht).
6. Моисеева С.П. РАЗРАБОТКА КАЛОРИМЕТРИЧЕСКОГО МЕТОДА И КАПИЛЛЯРНОГО ТИТРАЦИОННОГО КАЛОРИМЕТРА ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ БИОХИМИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук, Москва, 2005.
7. Г.В.Котельников, С.П.Моисеева, Е.В.Межбурд СКАНИРУЮЩИЙ КАПИЛЛЯРНЫЙ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНЫЙ ТИТРАЦИОННЫЙ КАЛОРИМЕТР // Актуальные вопросы инновационной деятельности в биологии и медицине: Материалы третьей конференции МЕДБИОТЕК, Москва, 4-5 декабря 2006. - С.49-50.
1. Способ измерения тепловой мощности на капиллярном дифференциальном титрационном калориметре, заключающийся в измерении мощности тепловых процессов в исследуемых перемешиваемых вибрационным устройством образцах в изотермическом режиме в калориметрических камерах, измерительные объемы которых размещены в термостатирующем экране камер и ограничены тепловым шунтом, соединяющим калориметрические камеры с термостатирующим экраном, отличающийся тем, что дополнительно обеспечивают измерения мощности тепловых процессов в сканирующем режиме с модуляцией, осуществляемом путем циклического нагрева термостатирующего экрана камер, при этом нагрев термостатирующего экрана камер чередуют с переводом термостатирующего экрана камер в изотермический режим во всем температурном диапазоне при заданном шаге изменения температуры термостатирующего экрана камер.
2. Способ по п.1, при котором измеряют тепловую мощность в заданном интервале температур при выбранных скорости сканирования, продолжительности периода нагрева и продолжительности периода изотермического режима при калориметрических камерах, заполненных образцом сравнения, измеряют тепловую мощность в заданном интервале температур при выбранных скорости сканирования, продолжительности периода нагрева и продолжительности периода изотермического режима при рабочей калориметрической камере, заполненной исследуемым образцом, и при эталонной калориметрической камере, заполненной образцом сравнения.
3. Способ по п.1, при котором изотермические режимы осуществляют системой автоматического регулирования температуры, а режимы температурного сканирования осуществляют путем подачи в нагреватель термостатирующего экрана камер фиксированного значения тепловой мощности, обеспечивающей температурное сканирование калориметрических камер.
4. Способ по п.1, при котором изотермические режимы и режимы температурного сканирования калориметрических камер осуществляют системой автоматического регулирования.
