Комбинированный способ стерилизации костных трансплантатов

Изобретение относится к медицине, а именно к трансплантологии, и может быть использовано при заготовке биологических тканей с высокими трансплантационными свойствами. Предложен способ кислотной деминерализации костной ткани для трансплантации, включающий ее заготовку, механическую обработку и деминерализацию, при этом перед деминерализацией костную ткань выдерживают 24 часа при +5…+7°С в 1% растворе натрия хлорида, после чего извлекают из раствора, замораживают и в замороженном виде помещают в раствор хлороводородной или бромоводородной кислоты заданной концентрации, которая обеспечивает частичную или полную деминерализацию костных трансплантатов. Изобретение позволяет значительно (с 2,5 до 1,2 Мрад) снизить дозу лучевого воздействия на костную ткань, обеспечить надежный стерилизующий эффект и сохранить ее высокие трансплантационные качества. Двухэтапная комбинированная стерилизация позволяет накапливать пластический материал после первого этапа и стерилизовать его гамма-лучами по мере необходимости, в плановом порядке, сокращая тем самым число обращений в учреждения, имеющие радионуклидную установку с источником гамма-излучения Со⁶⁰. 1 табл., 7 ил.

 

Изобретение относится к медицине и может быть использовано в травматологии, ортопедии и в других областях восстановительной хирургии. Известны различные способы стерилизации костной ткани, применяемой с пластической целью в травматологии и ортопедии, нейрохирургии, челюстно-лицевой хирургии, офтальмологии. Их общая особенность: одноэтапность процедуры стерилизации и однородность (химическая или физическая) применяемых для этого средств (1, 2, 3, 4, 5). Известен способ стерилизации кости гамма-лучами, он же прототип (9), при котором стерилизацию трансплантатов осуществляют в специальной установке с источником гамма-излучения Со⁶⁰. До стерилизации образцы тканей подвергают либо замораживанию, либо высушиванию путем вымораживания, что предупреждает, по мнению специалистов, развитие нежелательных изменений, нарушающих в тканях их полезные качества. Оптимальной дозой при этом считают дозу в 2,5 Мрад, после использования которой гибнут бактерии, грибки, плесень и вирусы. Однако биологические ткани также не остаются интактными. В них возникают морфологические и биохимические нарушения, которые в зависимости от вида тканей могут привести к их полной клинической непригодности (6, 7, 8).

Чтобы снизить дозу радиации и предотвратить тем самым вредное влияние облучения на биологические объекты, предлагаем комбинированный способ двухэтапной лучевой стерилизации костных трансплантатов, при котором на первом этапе трансплантаты обрабатывают 24 часа при +5…+7°С в растворе, содержащем этанол, димексид и тимол при следующем соотношении компонентов, мас.%: этанол 70% - 15,0; димексид - 10,0; тимол - 0,25; дистиллированная вода - остальное; на втором - трансплантаты в стерильной упаковке замораживают при -70°С и облучают гамма-лучами дозой в 1,2 Мрад.

Техническим результатом изобретения являются: а) значительное снижение уровня радиоактивного облучения трансплантатов (с 2,5 до 1,2 Мрад), что способствует лучшему сохранению их морфологических и биопластических качеств; б) усиление стерилизующей активности способа за счет комбинированного использования гамма-лучей и антисептических средств химического происхождения.

Результат изобретения достигается следующим образом. Подготовленные к стерилизации образцы костной ткани (не деминерализованные и деминерализованные) помещают в общую тару и заливают стерилизующим раствором. Для приготовления последнего в колбу с дистиллированной водой на каждые 75 мл вносят 15,0 этанола (70%), 10,0 димексида, 0,25 г тимола. Раствор тщательно перемешивают и используют по назначению. Емкость с залитыми раствором трансплантатами герметизируют и помещают в бытовой холодильник с температурным режимом +5…+7°С. Через 24 часа в стерильных условиях бокса трансплантаты извлекают из раствора, подсушивают салфетками и размещают в индивидуальные стерильные пластиковые пакеты. Последние герметизируют и подвергают замораживанию в холодильной камере при температуре - 70°С. В день лучевой стерилизации пакеты с трансплантатами помещают в сумку-холодильник и подвергают обработке в установке, содержащей Со⁶⁰. После стерилизации трансплантаты в том же контейнере возвращаются в лабораторию, где часть из них направляется в бактериологическую лабораторию для исследования на стерильность. Остальные трансплантаты перекладывают в низкотемпературный холодильник для дальнейшего хранения и, если отсутствуют противопоказания, клинического использования.

В таблице показаны результаты стерилизации биологических тест-объектов различными способами.

Примечание: + рост микрофлоры; - отсутствие роста.

На чертежах изображены:

Фиг.1. Рентгенологический результат эктопической пересадки деминерализованных и стерилизованных предлагаемым способом костных аллотрансплантатов у крыс через 15 суток после операции.

Фиг.2. Рентгенологический результат эктопической пересадки деминерализованных и стерилизованных предлагаемым способом костных аллотрансплантатов у крыс через 90 суток после операции.

Фиг.3. Рентгенологический результат ортотопической пересадки деминерализованных и стерилизованных предлагаемым способом костных аллотрансплантатов у кролика через 30 суток после операции.

Фиг.4. Рентгенологический результат ортотопической пересадки деминерализованных и стерилизованных предлагаемым способом костных аллотрансплантатов у кролика через 180 суток после операции.

Фиг.5. Рентгенограмма левой пяточной кости больного И. до операции.

Фиг.6. Компьютерная томограмма левой пяточной кости до операции.

Фиг.7. Рентгенограмма левой пяточной кости через 7 месяцев после операции.

Таким образом, новизна способа состоит в комбинированном двухэтапном применении комплекса химических (этанол, димексид, тимол) и физических (гамма-лучи) стерилизующих средств, что позволяет значительно (с 2,5 до 1,2 Мрад) снизить дозу лучевого воздействия на костную ткань, обеспечить надежный стерилизующий эффект и сохранить ее высокие трансплантационные качества. Двухэтапная комбинированная стерилизация позволяет накапливать пластический материал после первого этапа и стерилизовать его гамма-лучами по мере необходимости, в плановом порядке, сокращая тем самым число обращений в учреждения, имеющие радионуклидную установку с источником гамма-излучения Со⁶⁰.

Для обоснования способа были проведены бактериологические, гистологические исследования и опыты на животных.

1. Стерилизующая активность способа.

Для проведения бактериологических исследований до и после стерилизации предлагаемым способом были использованы образцы тканей, наиболее инфицированные в естественных условиях смешанной микрофлорой, в которой наиболее часто встречались стафилококки, споровая и кишечная палочки, стрептококк, плесень и др. Речь идет о кожных тест-объектах, полученных у трупов-доноров, хранившихся в условиях морга при комнатной температуре, а также о хвостовых фрагментах крыс, забитых после выполнения тех или иных операций. В общем итоге бактериологическому исследованию было подвергнуто 600 тест-объектов, разделенных в зависимости от вида стерилизации на 3 серии, а от времени стерилизации - на 4 группы (Таблица 1). При химической стерилизации одна часть тест-объектов направлялась в бактериологическую лабораторию, другая хранилась в холодильнике при минус 70°С. Стерилизация накопленных таким образом тест-объектов гамма-лучами была выполнена дважды (по 200 образцов тканей на каждый сеанс).

Результаты исследований, приведенные в таблице, показали, что при раздельном использовании химической (этанол, димексид и тимол) и физической (гамма-лучи) стерилизации необходимого бактерицидного эффекта получено не было. Во все сроки наблюдался рост микрофлоры, преимущественно того же состава, что был обнаружен в контрольных посевах. Правда, при химической стерилизации, начиная с первых суток, наблюдалось постепенное повышение бактерицидной активности антисептического комплекса к концу третьих суток. После изолированной гамма-стерилизации тест-объектов такой закономерности отмечено не было.

При комбинированном использовании химических и физического агентов стерилизующий эффект был установлен только при 24-часовой экспозиции. Аналогичный результат сохранялся и дальше (на 2 и 3 сутки после начала опыта).

Таким образом, результаты эксперимента свидетельствуют о том, что раздельное применение использованных в заявке способов стерилизации биологических тканей не эффективно. Лишь при комплексном двухэтапном применении в установленные сроки они, действуя как синергисты, обеспечивают надежный стерилизующий эффект и могут быть рекомендованы для заготовки костных трансплантатов, полученных от трупов-доноров в условиях морга.

2. Гистологические исследования.

Проведены на 5 образцах костной ткани, взятой посмертно у донора 40 лет, умершего от обширного инфаркта стенки левого желудочка. Для гистологического исследования фрагменты кости до (контроль) и после стерилизации (опыт) помещали в фиксирующий раствор Кайзерлинга и декальцинировали в 10% растворе селектона. После этого препараты заливали либо в целлоидин, либо в целлоидин-парафин по общепринятой методике. Полученные из препаратов срезы окрашивали гематоксилином и эозином. Результаты исследований не обнаружили в стерилизованной костной ткани морфологических нарушений, которые могли бы явиться противопоказанием для их применения в качестве трансплантатов.

3. Остеоиндуктивная активность деминерализованных костных трансплантатов, стерилизованных предлагаемым способом.

Эксперименты проведены на 11 беспородных белых крысах и 5 кроликах. Первым производили эктопические пересадки в мышечный массив бедра, вторым - ортотопические в дефект лучевой кости. Деминерализацию костных трансплантатов осуществляли в 0,6 н. растворе соляной кислоты на протяжении 24-48 часов при температуре +7°С. Стерилизацию трансплантатов выполняли в два этапа: на первом - в растворе, содержащем (мас.%): этанол 70% - 15,0; димексид - 10,0; тимол - 0,25; дистиллированную воду - остальное. Время стерилизации при +7°С составляло 24 часа. После стерилизации в боксе трансплантаты извлекали из раствора, осушали салфетками и помещали в стерильную тару. Последнюю герметично опечатывали и переносили в низкотемпературный холодильник для замораживания и хранения при минус 70°С.

На втором этапом препараты в замороженном виде стерилизовали гамма-лучами Со⁶⁰ и вновь помещали на хранение в низкотемпературный холодильник до момента операции. После операции полученные у животных макропрепараты подвергали рентгенологическому и гистологическому изучению. Максимальный срок наблюдения за животными составлял: для крыс - 3 месяца, для кроликов - 6 месяцев. Проведенные исследования показали, что через три месяца у 9 из 11 крыс на месте пересадки были обнаружены очаги индукционного остеогенеза, состоящие в основном из спонгиозной костной ткани, содержащей элементы миелоидного и жирового костного мозга (Фиг.1 и 2).

При ортотопической пересадке у всех кроликов в области бывшего дефекта лучевой кости через 6 месяцев после операции была выявлена новообразованная костная ткань органотипического строения, полностью замещающая дефект. В ее толще еще попадались мелкие фрагменты перестраивающегося трансплантата, к этому времени практически полностью рассосавшегося и заместившегося новыми костными структурами (Фиг.3 и 4).

Эксперимент подтвердил, таким образом, что предлагаемый способ стерилизации костной ткани не нарушает ее остеоиндуктивных и биопластических свойств, что позволяет рекомендовать его для изготовления трансплантатов, используемых в клинической практике.

4. Клинический пример.

Больной И., 18 лет. Поступил в РосНИИТО им. Р.Р.Вредена с диагнозом: киста левой пяточной кости (Фиг.5 и 6). Выполнена операция экскохлеация, комбинированная пластика замороженными и деминерализованными костными трансплантатами, которые были стерилизованы предлагаемым способом. Конечность фиксирована гипсовой повязкой. Послеоперационный период протекал гладко. Рана зажила первичным натяжением. Нагрузка была разрешена через 3 месяца после операции. При контрольном осмотре больной жалоб не предъявлял. Движения в голеностопном суставе восстановились полностью. На рентгенограммах через 7 месяцев после операции видны признаки перестройки костных трансплантатов с формированием полноценной костной структуры (Фиг.7).

Список литературы

1. Савельев В.И. Заготовка и консервация биологических тканей на современном этапе // Вестник хирургии. - 1979. - Т.122. N5 - С.131-137.

2. Иванкин Д.Е. Стерилизация и консервация костных трансплантатов слабыми растворами формальдегида в сочетании с другими антисептиками. / Автореф. канд. дисс., Санкт-Петербург, 1999. - 21 с.

3. Савельев В.И. Аллотрансплантация формалинизированной костной ткани в травматологии и ортопедии. / В.И.Савельев, Н.В.Корнилов, Д.Е.Иванкин, С.А.Линник. СПб.: «Морсар АВ», 2001. - с.48-54.

4. Губин А.В. Костная пластика аллогенным фетотрансплантатом в хирургии позвоночника у детей. / Автореф. канд. дисс., Санкт-Петербург, 2001. - 24 с.

5. Савельев В.И. Газовая стерилизация тканевых трансплантатов и стационарная установка для этой цели. / Ортопед. травматол. - 1971. - N3. - С.76-78.

6. Мощная радиационная техника (основы радиационной технологии). / Под ред.С.Джеферсона, пер. с англ. - М.: «Атомиздат», 1967. - С.40-56, 58-63.

7. Вашков В.И. Средства и методы стерилизации, применяемые в медицине. М.: Медицина, - 1973. - 368 с. (С.124-154).

8. Меркулов Г.А. Курс патологогистологической техники. - Л.: Медицина, 1969. - 423 с.

9. Cornu О. Effect of freeze-drying and gamma irradiation on the mechanical properties of human cancellous bone. / O.Cornu, X.Banse, P.L.Docquier et al. // J.Orthop.Res. - 2000. - Vol.18, N 3. - P.426-431.

Комбинированный способ стерилизации костных трансплантатов.

Таблица 1
Вид стерилизации	Время (часы)
	12	24	48	72
+	-	+	-	+	-	+	-
Химическая (этанол, димексид, тимол)	50	0	24	26	12	38	7	43
Физическая (гамма-лучи)	50	0	21	29	19	31	22	28
Комбинированная	23	27	0	50	0	50	0	50
Количество тест-объектов	150	150	150	150

Комбинированный способ стерилизации костных трансплантатов химическими антисептиками и гамма-лучами, отличающийся тем, что стерилизацию ведут в два этапа, на первом трансплантаты выдерживают 24 ч при +5…+7°С в растворе, содержащем этанол, димексид и тимол при следующем соотношении компонентов, мас.%: этанол 70%-ный 15,0; димексид 10,0; тимол 0,25; дистиллированная вода - остальное, и на втором этапе трансплантаты замораживают в стерильной упаковке при -70°С и облучают гамма-лучами дозой в 1,2 Мрад.