Диагностическая тест-система для выявления заболевания

Изобретение относится к медицине и биологии, а именно к молекулярной диагностике. Предложена диагностическая тест-система на базе зондовой микроскопии. Совокупности детектирующих молекул иммобилизуют на подложку, инкубируют на подложке исследуемый образец жидкости и при помощи атомно-силового микроскопа выявляют реперные изолированные комплексы молекул, образовавшихся на подложке при инкубации. Система обладает повышенной чувствительностью на уровне единичных молекул и позволяет одновременно определять несколько заболеваний. 1 з.п. ф-лы, 6 ил.

 

Предлагаемое изобретение относится к прикладной иммунологии в медицинской вирусологии, в частности к диагностической тест-системе для выявления вирусного заболевания, и может быть использовано для диагностики гепатитов А, В, С инфекционных и онкологических заболеваний.

В качестве устройств, с помощью которых проводят диагностику, могут быть использованы зондовые микроскопы (атомно-силовые, ближнепольные, туннельные и др.)

Известен способ иммуноферментного анализа (ИФА) для диагностики инфекционных заболеваний (Морозов С.Г., Иванов Ю.Д. и др. Аллергия, астма и клиническая иммунология, №9, 1999, с.187-189).

Этот способ имеет ряд существенных недостатков, а именно:

длительность постановки анализа (2-24 часа) и отсутствие жесткого контроля качества тест-систем.

Известен способ цепной полимеразной реакции (ЦПР) для диагностики инфекционных заболеваний (George A.J.T. et al. "Tumor targeting", V.2, №5, 1995, p.245-250).

К недостаткам известного способа относится высокая вероятность контаминации исследуемых образцов и громоздкость технологии.

Известен метод диагностики при помощи оптического биосенсора («Bio Techniques», V.11, №5, 1991, p.620-627).

Он позволяет в реальном масштабе времени по мониторингу изменения коэффициента преломления проследить за кинетикой взаимодействия, рассчитать константу равновесия реакции антиген/антитело без использования меток, менее продолжительным сроком выполнения анализа (до нескольких минут).

Однако он обладает рядом недостатков, а именно пределом концентрационной чувствительности, не превышающей 10^-12 M, сложно проводить контроль вклада в сигнал оптического биосенсора от неспецифических взаимодействий компонентов биологической жидкости.

Известна диагностическая тест-система для выявления вируса заболевания, включающая иммобилизацию физиологически активных биомолекул антигенов или антител на подложке, инкубирование на подложку раствора, содержащего маркер заболевания, и регистрацию диагностических показателей, по которым производят диагностику вируса (RU, патент №2065164, по кл. C01N 33/53, 1996 г.).

В известном способе диагностики гепатитов А, В и С методом иммуноферментного анализа в лунках тест-системы ковалентно иммобилизовывают антитела.

Они связывают антиген вируса из аналита. Полученные комплексы инкубируют с антителами, мечеными пероксидазой. После добавления соответствующего субстрата происходит ферментативная реакция с образованием продукта, имеющего характерный спектр поглощения, который регистрируют спектрофотометрически.

Известная диагностическая тест-система для выявления вируса заболевания обладает рядом недостатков:

- большая длительность анализа (несколько часов);

- высокая трудоемкость;

- низкая пороговая чувствительность (порядка пиконанограмм/мл);

- невозможность диагностирования нескольких заболеваний одновременно.

Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому техническому решению является протеиновая диагностическая тест-система (биочип), представляющая собой расположенные на твердой подложке молекулы (антитела, антигены или их фрагменты), с помощью которой осуществляют диагностику путем идентификации биологических молекул, специфичных для инфекционного заболевания (гепатит В, С, сифилиса и др. (CN 1373365, кл. G01N 33/68, опубл. 09.10.2002).

Известный способ обладает рядом недостатков, а именно:

Невозможностью регистрации каждой отдельной молекулы, т.е нельзя достигнуть чувствительности регистрации на уровне единичных молекул из-за использования концентрационного детектора, которым производят регистрацию излучения, то есть оптического детектора, который регистрирует излучение не от единичной молекулы, а излучение от большого количества молекул.

Единичные молекулы в известном способе нельзя видеть, так как чувствительность концентрационных оптических детекторов очень невысокая.

Задачей, решаемой предлагаемым изобретением, является создание диагностической системы с расширенными функциональными возможностями, которая позволяет:

- значительно уменьшить длительность анализа (порядка нескольких минут),

- повысить чувствительность системы на уровне единичных молекул и определять одновременно несколько заболеваний.

Предлагаемая тест-система предназначена для зондовой микроскопии, а именно для атомно-силового микроскопа.,

Технический результат в предлагаемом изобретение достигают созданием диагностической тест-системы для выявления заболевания, включающей иммобилизацию поля молекул на подложку, инкубирование на подложке раствора, содержащего маркер заболевания, и регистрацию диагностических показателей, по которым производят диагностику заболевания, в которой согласно изобретению иммобилизацию на подложку производят отдельно расположенных единичных макромолекул, в качестве которых используют или антитела и/или антигены, образующие специфичные комплексы с маркерными молекулами заболеваний, и/или образованных ими монослоев, причем каждый тип молекул иммобилизуют в виде отдельных совокупностей, которые вместе формируют поле, а регистрацию проводят путем определения наличия реперных изолированных комплексов молекул в поле подложки, образованных на подложке при инкубации, и по их наличию определяют наличие заболевания.

Предлагаемое изобретение проводит несколько диагностик заболеваний одновременно, за счет чего сокращается время анализа, а использование поля одинаковых совокупностей повышает статистическую достоверность диагностики.

Изобретение характеризуется также тем, что регистрацию производят или одновременно всех совокупностей на поле или последовательно.

Это также сокращает время анализа за счет использования одной и той же подложки и уменьшения числа манипуляций.

Предлагаемая диагностическая тест-система для выявления вируса заболевания позволяет повысить чувствительность регистрации с 0,1 нг/мл (ИФА) до уровня единичных молекул и дает возможность определять одновременно несколько заболеваний.

Использование поля иммобилизованных молекул позволяет повысить быстроту анализа сразу нескольких заболеваний за счет одновременной регистрации сигнала в нескольких измерительных каналах от нескольких часов до порядка десяти минут.

Проведенные патентные исследования показали, что не известны технические решения с указанной совокупностью существенных признаков в аналогичных диагностических тест-системах для выявления аналита, т.е. предлагаемое решение соответствует критерию «новизна».

При анализе известных аналогов и прототипа не обнаружено предложение с совокупностью существенных признаков, изложенных в формуле изобретения, из чего следует, что для специалистов, занимающихся вирусологией и прикладной иммунологией, оно явным образом не следует из уровня техники и, следовательно, соответствует критерию изобретения «изобретательский уровень».

Считаем, что сведений, изложенных в материалах заявки, достаточно для практического осуществления изобретения.

Сущность предлагаемой диагностической тест-системы для выявления вируса заболевания поясняется нижеследующим описанием и чертежами, где:

На фиг.1 показано атомно-силовое микроскопное изображение (АСМ) поверхности сформированного слоя антител к HBs-Ag (А) и антител к кор-антигену вируса гепатита С (В), иммобилизованных на поверхности слюды.

На фиг.2 показано АСМ-изображение HBs-Ag (А) и кор-антигена, вируса гепатита С, иммобилизованных на поверхности слюды.

На фиг.3 показано АСМ-изображение HBs-Ag, иммобилизованных на поверхности слюды.

На фиг.4 показано атомно-силовое микроскопное изображение (АСМ) альфа-фетопротеина, антител к альфа-фетопротеину и комплексов альфа-фетопротеина с антителами к нему.

На фиг.5 показано АСМ-изображение гликоделина, антител к гликоделину и комплексов гликоделина с антителами к нему.

На фиг.6 показано АСМ-изображение сывороточного амилоида А, антител к нему и их комплексов.

На всех графиках справа представлено вертикальное сечение соответствующих объектов.

Предлагаемая диагностическая тест-система для выявления вируса заболевания может быть осуществлена с помощью зондового микроскопа.

Рассмотрим осуществление предлагаемого изобретения на примере использования атомно-силового микроскопа для диагностики гепатитов В и С.

Такое исследование может быть проведено как отдельно для каждого типа заболевания, так и одновременно. Различие и проведение диагностики будет заключаться в том, какие типы макромолекул будут иммобилизованы на подложку: одна совокупность или в виде нескольких совокупностей.

Например, на подложке инкубируют только антитела к антигенам вируса гепатита В, тогда мы проводим диагностику только заболевания гепатитом В.

Рассмотрим пример, когда на подложку наносят разные макромолекулы.

В этом случае используют, например, отдельные слюдяные или стеклянные подложки с иммобилизованными на них макромолекулами, в качестве которых применены антигены HBsAg (вируса гепатита В) и Соге-антигены вируса гепатита С, а также иммобилизованными моноклональными (макромолекулами) антителами к этим антигенам.

Заявитель в предлагаемом изобретение не претендует на новизну способа иммобилизации, т.к. известен метод физической адсорбции, она может быть проведена также ковалентно.

Иммобилизация с помощью физической адсорбции широко известна и применяется для иммобилизации белков (V.Yu. Kuznetsov, Y.D. Ivanov, V.A. Bykov. Atomic force microscopy detection of molecular complexes in multiprotein. P450cam-containing monooxygenase system. Proteornics. 2002, issue 12, vol.2, p.1699-1705).

На подложку методом физической адсорбции иммобилизуют единичные антигены или антитела, причем расстояние на подложке между молекулами может быть больше их размеров, что контролируется с помощью зондового микроскопа, позволяющего видеть единичные молекулы. Это зависит от технологических возможностей аппаратуры.

Это необходимо для корректного определения размеров макромолекул и их комплексов с маркерами заболеваний.

Для повышения адсорбционных свойств подложки при адсорбции антигенов или антител к ней производят модификацию подложки, в том числе ковалентно-связанным ровным (то есть с неровностями ниже размеров иммобилизованных молекул) слоем разных типов силанов.

Затем на подложку наносят (инкубируют) растворы, содержащие маркер заболевания, например, антитела к соответствующим антигенам (в случае иммобилизованных антигенов) или растворы, содержащие антигены (в случае иммобилизованных антител) со сшивающими кросс-линкерами.

Образование реперных изолированных комплексов молекул сопровождается увеличением размеров начальных молекул.

В качестве аналита, содержащего маркер заболевания, используют сыворотку больных пациентов. В качестве контроля следует использовать сыворотку здоровых людей.

В предлагаемом изобретении регистрацию производят с помощью атомно-силового микроскопа, представляющего собой молекулярный детектор, то есть детектор, позволяющий чувствовать одну молекулу.

В предлагаемом изобретении регистрируют (общупывают) каждую отдельную молекулу зондом, размер которого может быть от нескольких десятков нм (например, 20 нм) до 1 нм (то есть размер зонда и размер макромолекулы приблизительно одного порядка). Поэтому достигают чувствительности регистрации на уровне единичных молекул.

Теоретический предел чувствительность атомно-силового микроскопа - одна молекула в объеме раствора (так, при объеме пробы 1 л - теоретическая чувствительность соответствует (1/6)·10-23 М).

В предлагаемой диагностической тест-системе для выявления заболевания регистрацию диагностических показателей могут проводить по сравнению измеренных высот или латеральных размеров реперных изолированных комплексов молекул, образованных на подложке при инкубации в аналите подложки с иммобилизованными макромолекулами, с высотами или длинами иммобилизованных изолированных реперных единичных макромолекул.

Предлагаемая диагностическая тест-система для одновременного выявления заболевания позволяет проводить диагностику гепатита В, С в течение порядка 10 мин.

Это дает основание предполагать потенциальную возможность широкого внедрения предлагаемого изобретения в клиническую практику.

Были проведены сравнительные исследования с использованием предлагаемого изобретения и прототипа и получены следующие результаты:

Использовались моноклональные антитела (МКА) к поверхностному антигену вируса гепатита В, и МКА против кор-белка вируса гепатита С.

Использовались также поверхностный антиген вируса гепатита В и рекомбинантный кор-антиген. Комплексы антиген-антитело были получены инкубацией смеси растворов антигенов и их соответствующих МКА в соотношении 1:1 в течение 30 минут при 37°С.

Изображения МКА и отдельных антигенов представляют собой объекты высотой от 4 до 9 нм (фиг.1, 2).

При визуализации комплексов антиген-антитело среди объектов высотой до 8 нм были обнаружены также объекты высотой от 12 до 15 нм (фиг.3). Отсутствие последних как на изображениях антигенов, так и МКА позволяет сделать вывод, что они являются комплексами антиген-антитело.

Предлагаемая диагностическая тест-система для выявления заболевания может быть применена и для определения одновременно нескольких заболеваний, например, белков соматических заболеваний, в частности, онкологических заболеваний и патологии беременности.

Были проведены эксперименты по выявлению в аналите комплексов с антителами альфа-фетопротеина и гликоделина - маркерных белковоонкологических заболеваний и патологии беременности, соответственно и показано, что наблюдается увеличение высот комплексов по сравнению с высотой изолированных молекул как антител, так и альфа-фетопротеина и гликоделина.

Предлагаемая диагностическая тест-система для выявления альфа-фетопротеина - маркера онкологического заболевания и гликоделина - маркера причин бесплодия и невынашивания поясняется нижеследующим описанием и фиг.4 и 5.

Изображения белков альфа-фетопротеина, гликоделина и антител к этим белкам представляют собой объекты высотой от 2 до 3 нм.

При визуализации комплексов альфа-фетопротеин-антитело гликоделин - антитело среди объектов высотой до 2-3 нм были обнаружены также объекты высотой от 4 до 8 нм (фиг.4 и 5).

Отсутствие последних как на изображениях альфа-фетопротеина и гликоделина, так и антител к этим антителам позволяет сделать вывод, что они являются комплексами белок-антитело. Изображения белков альфа-фетопротеина, гликоделина и антител к этим белкам представляют собой объекты высотой от 2 до 3 нм.

Аналогично, предлагаемая диагностическая тест-система может быть использована для выявления маркеров воспаления сывороточного амилоида A (SAA) (который может являться и маркером ранней диагностики рака). Изображения SAA, антител к SAA и комплексов SAA-анти-SAA приведены на фиг.6. Изображения белков - ковалентно-иммобилизованных антител к SAA, представляют собой объекты высотой от 1.6 нм, а комплексы, полученные после инкубации иммобилизованных антител в растворе с SAA, - объекты с большей высотой - с максимумом распределения высотой 2.2 нм.

Таким образом, предлагаемое изобретение позволяет проводить диагностику вирусных заболеваний, а также и других заболеваний, в том числе неинфекционных.

1. Диагностическая тест-система, включающая иммобилизацию совокупностей детектирующих молекул на подложку, инкубирование на подложке раствора, содержащего маркер заболевания, и регистрацию диагностических показателей, по которым производят диагностику заболевания, отличающаяся тем, что на подложку иммобилизуют отдельно расположенные единичные детектирующие молекулы, а регистрацию проводят при помощи атомно-силового микроскопа путем выявления реперных изолированных комплексов молекул, образовавшихся на подложке при инкубации, и по их наличию проводят диагностику заболевания.

2. Диагностическая тест-система по п.1, отличающаяся тем, что регистрируют наличие всех совокупностей детектирующих молекул на подложке одновременно или последовательно.