Состав раствора эритропоэтина
Изобретение относится к фармакологии и представляет собой устойчивый фармацевтический состав эритропоэтина, который содержит трис-(гидроксиметил)-аминометан в качестве стабилизатора и не содержит аминокислоты или человеческий сывороточный альбумина. Изобретение обеспечивает получение стабильного устойчивого состава эритропоэтина, в котором образование агрегатов даже при повышенных температурах в значительной мере подавлено или полностью устраненою. 11 з.п. ф-лы, 3 табл., 4 ил.
Эритропоэтин (далее ЭПО) является гликопротеиновым гормоном, который способствует дифференциации и пролиферации эритроидных клеток-предшественников. Эритроциты существуют в крови в течение определенного отрезка времени. По истечении среднего времени жизни в человеческом организме, составляющего примерно 120 дней, красные кровяные клетки разрушаются и выводятся из организма. С другой стороны, красные кровяные клетки постоянно поступают из костного мозга, так что общее число эритроцитов поддерживается на нормальном уровне. У пациентов, страдающих почечными заболеваниями, наблюдается недостаточное число эритроцитов в крови. ЭПО играет центральную роль в образовании эритроцитов и поэтому часто используется при лечении пациентов с анемией.
Состав лекарственного препарата ЭПО, поставляемый на рынок, должен обеспечивать стабильность препарата, в нем не должны происходить, насколько это возможно, химические изменения, такие как гидролиз, реакции обмена дисульфида, и физические изменения, такие как денатурирование, образование агрегатов или адсорбция, которые характерны для составов ЭПО. Поскольку ЭПО представляет собой гликозилированный полипептид, для его стабилизации часто используют лиофилизацию. Однако процесс лиофилизации увеличивает стоимость производства, кроме того, для получения водного раствора лиофилизированный лекарственный препарат необходимо растворять непосредственно перед употреблением. Это является дополнительной работой для медиков и может представлять определенные трудности, если твердые частицы трудно растворимы в водном растворе.
Было сделано несколько предложений по устранению проблем устойчивости. Продукты, поставляемые на рынок, содержали в качестве стабилизатора человеческий сывороточный альбумин или очищенный желатин. Однако, поскольку в этом случае практически невозможно исключить риск загрязнения препарата вирусом или трансмиссионной спонгиоформной энцефалопатией, эти стабилизаторы были заменены.
В ЕР-А909564 фирмы Chugai предлагается препарат раствора ЭПО, содержащий в качестве стабилизатора аминокислоту. В WO 00/61169 описаны фармацевтические составы ЭПО, в которых отсутствуют продукты сыворотки человеческой крови и которые стабилизируют с помощью аминокислоты и поли(окси-1,2-этанедил)производного сорбита моно-9-октадеценоата.
Было замечено, однако, что известные составы все-таки имеют тенденцию к образованию агрегатов. Образование агрегатов может быть связано со структурой ЭПО, хотя это не подтверждено теорией. Хорошо известная цепочка ЭПО содержит четыре цистеиновых остатка, в которых имеется два дисульфидных мостика цис7-цис161 и цис29-цис33. Можно предположить, что из-за окислительно-восстановительных процессов, имеющих место в частности при длительном хранении в водном растворе, могут происходить перегруппировки дисульфидных мостиков, приводящие к образованию агрегатов, которые невозможно растворить. Этот эффект может вызывать побочные иммунные реакции. Недавно такие побочные эффекты были описаны для некоторых пациентов с хронической почечной анемией, которые подвергались лечению ЭПО (Eprex®, эпоетин-альфа). В процессе лечения у этих больных развивалась истинная эритроцитарная аплазия, тяжелый побочный иммунологический эффект, приводящий к посттрансфузионной анемии (Casadevall 2002 "Antibodies against rHuEPO: native and recombinant." Nephrol Dial Transplant 17 Suppl 5: Casadevall, Nataf и др. 2002 "Pure red-cell aplasia and antierytropoietin antibodies in patients treated with recombinant erythropoietin" N Engi J Med 346 (7): 469-75). Очень похоже, что этот неблагоприятный эффект был вызван фармацевтическим составом Eprex®(Schellekens 2003 "Relationship between biopharmaceutical imunogenicity of epoetin alfa and pure red-cell aplasia." Curr Med Res Opin 19(5): 433-4).
Таким образом, целью настоящего изобретения является разработка устойчивого состава раствора эритропоэтина, в котором образование агрегатов даже при повышенных температурах в значительной мере подавлено или полностью устранено.
Таким образом, настоящее изобретение относится к устойчивым фармацевтическим составам эритропоэтина, отличительные признаки которых перечислены в формуле изобретения.
Устойчивый раствор ЭПО содержит фармацевтическое количество ЭПО, которое составляет от 1000 до 40000 МЕ/мл. В зависимости от необходимости клиницисты также предпочитают для внутривенной и подкожной инъекций концентрации 2000 МЕ/мл, 5000 МЕ/мл и 10000 МЕ/мл. Термин «эритропоэтин» в настоящем изобретении относится к тем протеинам, которые обладают биологической активностью эритропоэтина для человека, а также аналогам эритропоэтина, изоформам эритропоэтина, мемам эритропоэтина, фрагментам эритропоэтина, гибридным белкам эритропоэтина или сшитым белкам. Гликозилированная структура ЭПО обладает сильным воздействием и, следовательно, может оказывать влияние на части молекул, которые имеют определенное количество ЭПО.
В настоящем растворе в качестве буферного вещества используют фосфат натрия. Буферное вещество применяют для поддержания pH раствора на уровне от примерно 5,9 до примерно 6,8, предпочтительно от 6,2 до 6,6 и наиболее предпочтительно от 6,4 до 6,5. Уровень pH можно установить с помощью соответствующего основания. В фосфатной буферной системе настоящего изобретения для этой цели используют NaOH или фосфорную кислоту. Также вместо NaOH можно добавлять КОН. Количество буферного вещества в фармацевтическом составе составляет от примерно 5 до примерно 50 мМ, предпочтительно от примерно 10 до примерно 30 мМ.
Неожиданно было обнаружено, что раствор ЭПО можно стабилизировать путем добавления или NaCl или трис-(гидроксиметил)-аминометана (Трис) или обоих этих компонентов. Термин «Трис» относится ко всем формам этого соединения, таким как трис основание или трис НСl. Растворы, которые вводят в тело человека, предпочтительно должны иметь соответствующее осмотическое давление. Необходимое осмотическое давление можно получить путем добавления хлорида натрия. В контексте настоящего изобретения необходимо отметить, что добавление NaCl к буферному веществу фосфату значительно уменьшает образование агрегатов. Количество добавляемого NaCl составляет от примерно 20 до примерно 150 мМ, предпочтительно от 30 до 120 мМ и наиболее предпочтительно от 50 до 100 мМ.
Стабилизирующий эффект можно также получить путем добавления трис-(гидроксиметил)-аминометана в количестве от примерно 10 до примерно 150 мМ, предпочтительно от примерно 40 до примерно 100 мМ. Трис-(гидроксиметил)-аминометан является хорошо известной буферной системой для фармацевтических составов протеина (см., например, WO 03/072060). Обычно его используют при значениях pH от 7 до 9. При pH от 5,9 до 6,8 трис-(гидроксиметил)-аминометан проявляет очень слабые буферные свойства или не имеет их совсем. Таким образом, неожиданный стабилизирующий эффект трис-(гидроксиметил)-аминометана не связан с его буферными свойствами.
Стабилизирующий эффект может быть получен путем добавления или хлорида натрия или трис-(гидроксиметил)-аминометана. Вместе с тем при совместном добавлении к раствору обоих стабилизирующих компонентов, а именно NaCl и Трис, стабилизирующее воздействие значительно усиливается.
Кроме того, раствор ЭПО предпочтительно содержит неионное поверхностно-активное вещество (ПАВ), предпочтительно полисорбат. Полисорбаты представляют собой продукты поликонденсации эфиров сорбита и полиэтиленгликоля. Используемые в соответствии с настоящим изобретением остатки жирных кислот выделяют исключительно из растений, а не из животных, что является очень важным фактором для улучшения сохранности раствора ЭПО. Кроме того, очень важно, чтобы содержание пероксида, определенное в соответствии правилами п.2.5.5 Европейской фармакопеи (Ph Eur), составляло менее 1,00 мкМоль/г, предпочтительно менее 0,5 мкМоль/г, что соответствует содержанию пероксида в конечном фармацевтическом составе от 0,01 до 1 мкМоль, предпочтительно менее 0,5 мкМоль. Полисорбаты серийно выпускаются под торговыми марками соответственно TWEEN® 20 или TWEEN® 80.
Необходимо отметить, что состав раствора ЭПО в соответствии с настоящим изобретении не содержит продукты, полученные из человеческой крови, в частности человеческого сывороточного альбумина. Предпочтительно состав настоящего изобретения не содержит мочевину. Состав настоящего изобретения также не содержит аминокислоты, которые добавляют в другие составы в качестве стабилизатора.
Растворы ЭПО применяют для инъекций. Таким образом, составы предпочтительно приготавливают в форме растворов, предназначенных для внутривенных и подкожных инъекций. В зависимости от применения состав может также содержать обычные для таких растворов для инъекций добавки.
Далее изобретение будет продемонстрировано на примерах.
Пример 1
Приготовление растворов ЭПО
Чтобы получить составы, приведенные в таблицах 1 и 2, основной объем растворов лекарственного препарата ЭПО разбавляли различными растворами до концентрации 100 мкг/мл.
В таблице 1 представлен известный состав. Этот состав имеет pH от 6,6 до 7,2 и содержит в качестве стабилизатора глицин.
| Таблица 1 | ||||||
| Состав | ЭПО (мкг/мл) | БФ (мМ) | NaCl (мас.%) | Глицин (мМ) | TWEEN 80 (мас.%) | pH |
| Известный состав | 100 | 20 | 0,438 | 67 | 0,03 | 7,0 |
БФ обозначает буферное вещество фосфат.
Кроме того, в таблице 2 приведены составы, которые были приготовлены в соответствии с настоящим изобретением. Эти составы отличаются содержанием NaCl и Трис.
| Таблица 2 | ||||||
| Состав | ЭПО (мкг/мл) | БФ (мМ) | NaCl (мас.%) | Трис (мМ) | Tween 80 (мас.%) | pH |
| А | 100 | 20 | 128 | 0 | 0,03 | 6,5 |
| Б | 100 | 20 | 113 | 20 | 0,03 | 6,5 |
| В | 100 | 20 | 67 | 70 | 0,03 | 6,5 |
| Г | 100 | 20 | 0 | 140 | 0,03 | 6,5 |
Приготовленные растворы фильтровали (PALL Gelman, Acrodisc, 0,2 мкм мембрана Supor, непирогенная, стерильная) и по 1 мл заливали в стеклянные флаконы вместимостью 2 мл. При этом не наблюдалось никакого поглощения ЭПО фильтром. Закупоренные (для закупоривания использовали 13 мм пробки Daiichi Flurotec из силанизированного бутилкаучука) и запечатанные флаконы хранили при условиях, соответствующих требованиями ICH (Международной конференции по согласованию технических требований к лекарственных препаратов, предназначенных для человека): в течение 8 недель в помещении при температуре 40±3°С и относительной влажности 80%.
Для получения сравнительных составов использовали TWEEN 80 и TWEEN 20 соответственно. Все используемые препараты TWEEN имели низкое исходное содержание пероксида.
Пример 2 - определение агрегатов
Степень агрегации измеряли методом высокоэффективной эксклюзионной хроматографии. Использование этого метода позволяет с высокой точностью определять количество мономера ЭПО. Димеры и полимеры элюируются различными пиками. Анализ выполняли на колонке TSK G3000 SWXL, 5 мкм, 300×7,8 мм. В качестве подвижной фазы использовали буферный раствор, содержащий 150 мМ NaCl, 10 мМ NaH2PO4×2H2O, с рН 7,2. Рассчитывали площадь пиков и определяли количество мономера ЭПО в течение 8 недель. Образцы хранились при 40°С. Полученные результаты приведены в таблице 3.
| Таблица 3 | |||
| А | |||
| БФ, NaCl рН 6,5 | |||
| Образование агрегатов, % | Неделя, 40°С | Стандартное отклонение | |
| 0 | 0 | 0,15 | |
| 4 | 1,05 | 0,42 | |
| 6 | 2,38 | 0,42 | |
| БФ, NaCl pH 6,5 | |||
| Образование агрегатов, % | Неделя, 40°С | Стандартное отклонение | |
| 0 | 0 | 0,15 | |
| 8 | 2,27 | 0,53 | |
| Б | |||
| БФ, 20 мМ Трис, NaCl pH 6.5, 0,03% TWEEN 20 | |||
| Образование агрегатов, % | Неделя, 40°С | Стандартное отклонение | |
| 0 | 0 | 0,15 | |
| 4 | 0,53 | 0,47 | |
| 6 | 1,35 | 0,41 | |
| 8 | 1,98 | 0,43 | |
| В | |||
| БФ, 70 мМ Трис, NaCl pH 6,5, 0,03% TWEEN 20 | |||
| Образование агрегатов, % | Неделя, 40°С | Стандартное отклонение | |
| 0 | 0 | 0,15 | |
| 4 | 0,31 | 0,43 | |
| 6 | 0,77 | 0,43 | |
| 8 | 2,14 | 0,61 | |
| Г | |||
| БФ, 140 мМ Трис, NaCl pH 6,5, 0,03% TWEEN 20 | |||
| Образование агрегатов, % | Неделя, 40°С | Стандартное отклонение | |
| 0 | 0 | 0,33 | |
| 4 | 0,49 | 0,6 | |
| 6 | 1,06 | 0,59 | |
| 8 | 0,13 | 0,68 | |
| Известный состав | |||
| Известный состав ЭПО, БФ, Глицин, pH 7,0, 0,03% TWEEN 80 | |||
| Образование агрегатов, % | Неделя, 40°С | Стандартное отклонение | |
| 0 | 0 | ||
| 4 | 6,11 | 0,96 | |
| 6 | 10,29 | 0,26 | |
| 8 |
Из таблицы 3 видно, что при замене глицина на NaCl и/или Трис образование агрегатов значительно уменьшается. Результаты, приведенные в таблице 3, показаны на фиг.1-4. Все опыты проводили с фосфатным буферным веществом.
На фиг.1 показан процесс образования агрегатов во времени (до 6 недель). Наибольшее количество агрегатов было найдено в составе, в котором в качестве стабилизатора использовали глицин (известный состав). Этот состав сравнивали с составами, предлагаемыми в настоящем изобретении, в которых использовали или NaCl или 70 мМ Трис и NaCl.
На фиг.2 в увеличенном масштабе показан эффект добавления к уже имеющемуся NaCl 70 мМ Трис и 0,03% TWEEN.
На фиг.3 показано влияние количества Трис, добавляемого в составы, содержащие также NaCl и TWEEN. Как видно, хорошие результаты могут быть получены для количества Трис от 20 до 140 мМ, причем оптимальные результаты достигнуты для примерно 70 мМ Трис. На Фиг.4 приведено сравнение известного состава и составов, приготовленных в соответствии с настоящим изобретением. Самое низкое образование агрегатов наблюдалось для состава с pH 6,5, содержащего примерно 70 мМ Трис, NaCl и 0,03% TWEEN 20.
1. Устойчивый фармацевтический состав эритропоэтина, который содержит от 10 до 200 мМ трис-(гидроксиметил)-аминометана в качестве стабилизатора и не содержит аминокислоты или человеческого сывороточного альбумина.
2. Устойчивый фармацевтический состав по п.1, содержащий:
а) фосфат натрия в качестве буферного вещества для поддержания необходимого уровня pH;
б) от 10 до 200 мМ трис-(гидроксиметил)-аминометана в качестве стабилизатора;
в) фармацевтически эффективное количество эритропоэтина.
3. Состав по любому из предыдущих пунктов, содержащий от 20 до 150 мМ NaCl.
4. Состав по по любому из предыдущих пунктов, который содержит NaCl в количестве от 50 до 100 мМ.
5. Состав по п.1, который представляет собой водный состав.
6. Состав по п.2, в котором буферное вещество, поддерживающее необходимый уровень pH, имеет формулу NaxHyPO4, где x равно 1 или 2 и у равно 1 или 2, и сумма x и у равна 3, и в котором количество буферного вещества составляет от 5 до 50 мМ.
7. Состав по п.1, в котором pH составляет от 5,9 до 6,8, предпочтительно от 6,2 до 6,6.
8. Состав по п.2, который содержит от 20 до 100 мМ трис-(гидроксиметил)-аминометана.
9. Состав по п.1, который также содержит неионное поверхностно-активное вещество в количестве от 0,005 до 0,1 мас.%.
10. Состав по п.9, в котором неионным поверхностно-активным веществом является полисорбат, предпочтительно TWEEN 20 или TWEEN 80.
11. Состав по п.10, в котором полисорбат получен не из животных и содержание в нем пероксида составляет менее 1,00 мкмоль/г.
12. Состав по одному из предыдущих пунктов, который дополнительно содержит этилендиаминтетрауксусную кислоту в количестве от 0,1 до 0,5 мМ.
