Способ обнаружения минимальных количеств вируса гепатита а в водных объектах

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к способу обнаружения минимальных количеств вируса гепатита А в водных объектах с помощью метода ОТ-ПЦР. Способ обнаружения минимальных количеств вируса гепатита А в водных объектах с помощью метода ОТ-ПЦР осуществляют следующим образом. К исследуемым образцам проб воды добавляют оттитрованный вирус гепатита А из расчета конечного разведения, содержащего подпороговую дозу. Затем в подготовленных предлагаемым способом пробах проводят определение РНК ВГА методом ОТ-ПЦР. Параллельно с опытными исследуют контрольные пробы, представляющие собой суспензию ВГА на дистиллированной воде, содержащей его в пороговой - титр вируса 10^-5 и подпороговой - титр вируса 10^-6 концентрациях. Оценку результата производят путем сравнения данных, полученных в опыте и контроле. Изобретение позволяет повысить чувствительность метода обратной транскрипции - полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) при обнаружении вируса гепатита А в водных концентрациях. 1 ил.

 

Изобретение относится к области вирусологии, может быть использовано в эпидемиологическом надзоре за гепатитом А и научно-исследовательской работе для обнаружения ВГА.

Известны следующие способы определения вируса гепатита А.

1. Радиоиммунный анализ (РИА) обладает высокой специфичностью и чувствительностью на уровне 0,01-10 нг/мл при определении антигена ВГА в клинических областях [И.В.Шахгильдян // Автореф. дис.… докт. мед. наук. - М.,1980.- 56 с.]. Для реализации этого метода требуется дорогостоящая аппаратура, специальные лабораторные помещения, оборудованные для работы с радиоизотопами, что ограничивает его применение.

2. Иммуноферментный метод (ИФА) обеспечивает обнаружение антигена ВГА в образцах клинического материала и объектах внешней среды [М.Д.Алейник с соавт. // Вирусные гепатиты.- М., 1980. - с.69-73]. Он получил широкое распространение в лабораторной диагностике и эпидемиологических исследованиях. Метод обладает специфичностью и высокой чувствительностью на уровне РИА. Прост в реализации, не требует дорогостоящего оборудования, налажен выпуск коммерческих тест-систем. Все это в комплексе обеспечило распространение метода в широкой практике. В последние годы детекция антигена ВГА и уровень чувствительности его перестали соответствовать современным требованиям.

3. Обратная транскрипция-полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР). Метод обеспечивает определение отдельных фрагментов нуклеиновой кислоты вируса гепатита А (РНК ВГА) с помощью специфических праймеров [А.И.Глухов с соавторами. // ЖМЭИ. - 2004. - №4. - С.50-54]. ОТ-ПЦР обладает самой высокой чувствительностью из всех известных ныне методов детекции ВГА.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению (прототипом) является способ определения РНК вируса гепатита А в воде и слюне методом ОТ-ПЦР [Быстрова Т.Н., Попкова М.И., Блохин К.В. // патент на изобретение №2307168, С12Q 1/68, опубл. 27.09.2007]. В нем используется коммерческая тест-система, выпускаемая ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора (г.Москва). Данный способ заключается в том, что исследуемые субстраты подвергают предварительной обработке, включающей центрифугирование при 12000 об/мин в течение 5-10 мин, отбор супернатанта, добавление к осадку стерильной тридистиллированной воды в исходном объеме исследуемого субстрата, перемешивание на вортексе, прогревание до 60°С 3 мин, повторное перемешивание и центрифугирование с последующим объединением полученного супернатанта с первым для последующей детекции РНК вируса гепатита А методом ОТ-ПЦР. Этот метод по сравнению со всеми известными на сегодняшний день способами определения ВГА обладает самой высокой чувствительностью. Вместе с тем имеются теоретические предположения о том, что порог чувствительности его находится на уровне 10-100 вирионов. В более низких концентрациях вирус этим методом не определяется.

Целью изобретения является повышение чувствительности метода обратной транскрипции-полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) при обнаружении вируса гепатита А в водных концентратах.

Сущность изобретения и техническое решение заключается в том, что минимальные дозы ВГА, не определяемые с помощью метода ОТ-ПЦР, выявляются на основе «суммарного эффекта» при добавлении в пробы подпороговых доз (ПК×10^-1) ВГА с последующей постановкой реакции на наличие РНК вируса.

Способ осуществляется следующим образом. Вместо предварительной обработки перед постановкой ОТ-ПЦР к исследуемым образцам проб воды, обращающим на себя внимание с эпидемиологической и (или) санитарно-гигиенической точки зрения, добавляют заранее оттитрованный вирус гепатита А из расчета конечного разведения, содержащего подпороговую дозу (ПК×10^-1). Затем в подготовленных предлагаемым способом пробах проводят определение РНК ВГА методом ОТ-ПЦР, руководствуясь инструкцией к тест-системе «Ампли Сене HAV-430» производства ФГУН ЦННИЭ Роспотребнадзора, г.Москва. Параллельно с опытными исследуют контрольные пробы, представляющие собой суспензию ВГА на дистиллированной воде, содержащей его в пороговой (ПК) и подпороговой (ПК×10^-1) концентрациях. Оценку результата производят путем сравнения данных, полученных в опыте и контроле. Положительным считается результат, при котором определена РНК ВГА в опытной пробе с использованием подпороговой концентрации вируса (ПК×10^-1) в случае отрицательного ответа в соответствующем контроле и положительного ответа при применении пороговой концентрации (ПК).

Способ поясняется следующими примерами.

1. В экспериментах с вирусом гепатита А (штамм HAS-15) показано, что методом ОТ-ПЦР (прототипом) удается обнаружить РНК ВГА в концентратах дистиллированной воды, полученных с помощью любого способа концентрирования, содержащий вирус в исходном разведении до 1·10^-6 (100%) и 1·10^-7 (около 30%). В более высоких разведениях ВГА никогда не определялся.

Для реализации предлагаемого способа готовят концентраты из одного литра дистиллированной воды с помощью мембран ММПА⁺ - 0,2 «Технофильтр» и прибора ПВФ-142 при исходном разведении вируса 1·10^-8. В них вносят расчетные количества, заранее оттитрованного ВГА с тем, чтобы в конечном итоге получить разведения его в концентрациях: пороговой (1·10^-5) и подпороговых (1·10^-6, 1·10^-7 и 1·10^-8). Затем методом ОТ-ПЦР определяют РНК ВГА. Элекрофореграмма опыта представлена на фиг.1. Положительными оказались пробы за №№3, 4 и 8.

Пробы №№4 и 8 содержали вирус HAS-15 после его добавления в пороговой концентрации (конечное разведение 1·10^-5) и с помощью ОТ-ПЦР была определена РНК ВГА. В пробе №3 вирус HAS-15 находился в подпороговой концентрации (1·10^-6), при которой он методом ОТ-ПЦР определяться не должен (см. пробу №7 контрольного ряда). Положительный ответ в этой пробе свидетельствует о том, что в концентрате содержался ВГА в минимальных количествах, которые привели к эффекту сложения и обеспечили его выявление. Следовательно, обнаружение РНК ВГА в пробе, содержащей в добавке вирус в подпороговой концентрации, свидетельствует о присутствии в «негативном» водном концентрате агента, обеспечивающего феномен сложения, в результате которого обнаруживается искомая РНК.

2. При исследовании концентрата сточной воды, отобранной с помощью «ловушек» на основе макропористого стекла 5.07.07 г. из 1 канала входного коллектора биологических очистных сооружений г.Балахны Нижегородской области с помощью метода по прототипу был получен «отрицательный» результат. После добавления в этот концентрат вируса (штамм HAS-15) в подпороговой концентрации (1·10^-6) с помощью метода ОТ-ПЦР удалось получить положительный эффект. Минимальные количества вируса, содержащиеся в основе (концентрате) и добавке, не выявляемые методом-прототипом в результате эффекта сложения дали положительный результат.

В общей сложности было исследовано таких 16 проб сточной воды, отобранных до обработки из входного коллектора различных очистных сооружений с помощью «ловушек» на основе макропористого стекла. Методом-прототипом в 5 из них была обнаружена РНК ВГА. Остальные пробы оказались отрицательными. Дополнительные исследования «негативных» образцов с помощью заявляемого способа выявили еще в 5 из них РНК ВГА. Таким образом, комплексное исследование 16 проб сточной воды, не прошедшей обработку на очистных сооружениях, позволило обнаружить вирус гепатита А в 10 образцах.

3. При исследовании методом ОТ-ПЦР (прототип) ни одна из 18 проб сточной воды, прошедшей обработку на различных биологических очистных сооружениях и отобранной перед выпуском в поверхностные водоемы, не содержала РНК ВГА. Во все эти пробы был внесен вирус гепатита А (шт. HAS-15) в расчете конечного разведения 1-10^-6 (подпороговая, не выявляемая с помощью ОТ-ПЦР доза). Повторная постановка метода-прототипа не обнаружила в исследованных пробах РНК ВГА. Таким образом, во всех случаях феномен сложения не осуществился из-за отсутствия вируса в водных концентратах. После очистки сточная вода уже не содержала вирус гепатита А.

Способ отработан и опробован в лаборатории эпидемиологии вирусных гепатитов ФГУН НИИЭМ им. акад. И.Н.Блохиной Роспотребнадзора.

Предлагаемый способ определения минимальных количеств вируса гепатита А в водных концентратах позволяет повысить чувствительность использованного метода и тем самым увеличить эффективность его при расшифровке скрытых процессов распространения вируса во внешней среде.

Чертеж. Результаты опыта по обнаружению вируса гепатита А в водном концентрате, полученном с помощью мембран ММПА⁺ - 0,2 «Технофильтр» и прибора ПВФ-142.

Примечания.

1-4 - основа пробы концентрат суспензии ВГА в разведении 1·10^-8 добавка к ней ВГА в разведениях:

1. 1·10^-8; 2. 1·10^-7; 3. 1·10^-6; 4. 1·10^-5

5-8 - контроли суспензии ВГА на дистиллированной воде в разведении

5. 1·10^-8; 6. 1·10^-7; 7. 1·10^-6; 8. 1·10^-5

9 - отрицательный контроль

10 - положительный контроль

Способ обнаружения минимальных количеств вируса гепатита А в водных объектах с помощью метода ОТ-ПЦР, отличающийся тем, что исследуемые образцы проб воды перед постановкой реакции перемешивают с предварительно оттитрованной суспензией вируса гепатита А, взятой в дозе в 10 раз меньшей порогового значения с последующим определением РНК ВГА, метод сопровождают контролями на дистиллированной воде, в которых применяют разведения вируса в пороговой - титр вируса 10^-5 и подпороговой - титр вируса 10^-6 концентрациях, оценку результатов проводят на основании сравнения показателей индикации РНК вируса гепатита А методом ОТ-ПЦР в исследуемых и контрольных образцах.