Способ выявления антигена или антитела в иммуноферментном анализе

Изобретение относится к иммунологии. Сущность способа заключается в том, что сенситин иммобилизуют на носителе, представляющем собой субмикронную (0,1 мкм) монодисперсную стабильную эмульсию перфторорганических соединений (ПФОС) 10 об.% 0,5 мл. ПФОС перед иммобилизацией предварительно освобождают от солей и глюкозы промыванием десятикратным объемом 0,15 М физиологического раствора рН 6,8. Сенситин иммобилизуют на поверхность капель очищенной эмульсии ПФОС. Способ по изобретению упрощает постановку иммуноферментного анализа (ИФА), обеспечивая при этом высокую чувствительность способа.

 

Изобретение относится к области медицины, а именно к иммунологии, и, в частности, может быть использовано для выявления различных антигенов и антител в иммуноферментном анализе в биологических жидкостях организма, объектах окружающей среды и др.

Из практики медицины известен способ выявления антигенов и антител в радиоиммунном анализе (РИА) с использованием пластмасс, целлюлозы, сефадекса в качестве твердых носителей гомологичных антител или антигенов (Фримель Г. Иммунологические методы. - М.: Медицина, 1987. - 472 с.).

Однако известный способ имеет следующие недостатки: необходимость использования радиоактивных изотопов, представляющих определенную опасность для персонала и окружающей среды, ограниченное время жизни реагентов. Кроме того, для учета результатов реакции требуется дорогостоящая регистрирующая γ-излучение аппаратура.

Таким образом, изложенные недостатки не дают возможность получить технический результат - упрощение способа.

Известен также способ выявления антигенов и антител в гомогенном иммуноферментном анализе - EMIT-анализ, состоящий в том, что иммунологическую реакцию взаимодействия антигенов с антителами и детекцию ее протекания осуществляют в гомогенном растворе. В этих условиях отсутствует необходимость в методах физического разделения связавшегося и несвязавшегося с антителами антигена. Основными принципами данного анализа являются механизмы стерического исключения субстрата, модуляция антителами действия субстратов или ингибиторов, индуцированные антителами конформации активного центра фермента (Гаврилова Е.М. Журнал Всесоюзного химического общества им. Д.И.Менделеева, том XXVII, 4, 1982. - с.90-97).

Однако известный способ имеет следующие недостатки: необходимость использования высокочувствительных ферментативных систем, существенное влияние физико-химической характеристики антител на возможность способа (равновесные и кинетические константы реакции антиген-антитело), содержание небольшой примеси свободного гаптена или фермента может значительно повысить фоновый сигнал, значительное снижение чувствительности способа, если присутствуют примеси в препарате фермента и образце, такие как эндогенный фермент или субстрат, перекрестно-реагирующие антигены, в случае использования макромолекулярных субстратов (эритроциты, микробные клетки) чувствительность способа составляет лишь 0,5-2 мкг/мл.

Таким образом, изложенные недостатки не дают возможность получить технический результат - упрощение способа.

Наиболее близким способом к предлагаемому является способ выявление антигенов и антител в иммуноферментном анализе с использованием полистироловых планшетов, пробирок, бус и т.д. в качестве твердого носителя сенситинов (Нго Т., Ленхофф Г. Иммуноферментный анализ. - М.: Мир, 1988. - 446 с.).

Однако недостатками данного способа являются:

- сложность процесса подготовки сенсибилизированной поверхности твердого носителя;

- необходимость изготовления твердых полимерных носителей сенситинов (планшеты, бусы, пробирки и т.д.);

- использование специальных дозирующих устройств в процессе массовой сенсибилизации твердых носителей;

- для конкретных сенситинов, ввиду различной связывающей способности, необходим обязательный подбор твердого носителя;

- ограниченная площадь контактной поверхности твердого носителя;

- низкая емкость твердых носителей, вследствие чего для определения содержания антигена необходимо брать большое количество антительного иммуносорбента либо иммобилизовывать на нем только высокоаффинную фракцию антител;

- негомогенность материала твердых носителей (неконтролируемый фактор).

Указанные недостатки не дают возможность получить технический результат - упрощение способа.

Сходство предлагаемого способа с известным состоит в том, что они оба относятся к иммунологии и основаны на использовании иммобилизованных сенситинов на носителе.

Предлагаемое изобретение решает основную задачу - упрощение способа. Сущность изобретения выражена совокупностью существенных признаков, достаточных для обеспечиваемого изобретением технического результата.

Решение поставленной задачи заключается в том, что субмикронную монодисперсную стабильную эмульсию перфторорганических соединений (ПФОС) 10 об.% 0,5 мл освобождают от солей и глюкозы промыванием 5 раз с помощью центрифугирования 6000 об/мин в течение 5 мин десятикратным объемом 0,15М физиологического раствора рН 6,8, затем иммобилизуют соответствующий сенситин на поверхность капель эмульсии.

Промышленный выпуск в России эмульсии ПФОС как кровезаменителя с газотранспортной функцией осуществляет ОАО НПО «Перфторан». Образующими ее компонентами являются перфтордекалин и перфторметилциклогексилпиперидин с добавлением в качестве эмульгатора поверхностно-активного вещества проксанола, глюкозы и набора солей. Диаметр капель эмульсии около 0,1-0,15 мкм. Она стабильна, химически инертна, общая поверхность 1 мл составляет около 60 м². Нежелательным эффектом эмульсии как кровезаменителя является способность капель связывать на своей поверхности белки, липиды и другие вещества. Это свойство эмульсии использовано авторами для создания капель - сорбентов антигенов или антител, примененных в иммуноферментном анализе.

Предлагаемый способ дает возможность упростить процесс выявления антигена или антитела в иммуноферментном анализе за счет отсутствия трудоемкой процедуры приготовления сенсибилизированной поверхности твердого носителя. Эмульсия ПФОС является универсальным носителем сенситинов и снижает стоимость исследования.

Предлагаемый способ осуществляют следующим образом.

Субмикронную монодисперсную стабильную эмульсию ПФОС 10 об.% 0,5 мл освобождают от солей и глюкозы промыванием 5 раз с помощью центрифугирования при 6000 об/мин в течение 5 мин десятикратным объемом 0,15М физраствора рН 6,8, затем иммобилизуют соответствующий сенситин на поверхность капель эмульсии.

Предлагаемый способ прошел успешную апробацию на базе лабораторий НИИ краевой инфекционной патологии Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования Астраханская государственная медицинская академия Росздрава и Федерального государственного учреждения НИИ по изучению лепры Росздрава г.Астрахани.

Пример №1. С целью выявления поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg) подготовленный осадок эмульсии ПФОС ресуспендируют в 1 мл глицинового буфера рН 8,8.

Приготовление буфера: 46,7 мл 2М глицина (15 г на 100 мл дистиллированной воды) смешивают с 10 мл 1М NaOH (4 г на 100 мл дистиллированной воды) и добавляют равный объем физиологического раствора.

В уравновешенную глициновым буфером эмульсию ПФОС вносят 150 мкг козьих антител к HBsAg, произведенных предприятием «ИмБиО», г.Нижний Новгород, с содержанием белка 1 мг/мл, титр 1:128 в двойной иммунодиффузии по Оухтерлони. Полученную смесь инкубируют 2 часа при комнатной температуре и 16 часов в условиях бытового холодильника при температуре 8°С, после чего следовала пятикратная промывка глициновым буфером 5 мл рН 8,8 центрифугированием при 3000 об/мин в течение 10 мин до Е₂₈₀=0 для удаления несвязавшегося белка. Осадок ресуспендируют в 4 мл глицинового буфера рН 8,8. Сенсибилизированную эмульсию ПФОС используют в качестве сорбента HBsAg. Положительным и отрицательным контролями, иммунопероксидазным конъюгатом к HBsAg служат компоненты коммерческого набора «Вектогеп B-HBs-антиген-стрип » (комплект 3), производства ЗАО «Вектор-Бест», г.Новосибирск. В качестве исследуемых образцов используют сыворотки 34 больных острым гепатитом В, находившихся на лечении в Областной инфекционной клинической больнице г.Астрахани. Диагноз острого гепатита В подтвержден в иммуноферментном анализе на HBsAg по общепринятой методике. Кроме этого протестированы сыворотки доноров крови - 18 чел., отбракованные по результатам иммуноферментного анализа на наличие HBsAg. Для проверки специфичности реакции проведено исследование сывороток крови здоровых лиц - 11 чел., и больных хроническим гепатитом С - 8 чел.

Перед постановкой иммуноферментного анализа для каждого исследуемого образца берут 0,1 мл сенсибилизированной антителами эмульсии и после центрифугирования при 6000 об/мин в течение 5 мин в пробирках Эппендорф к осадку вносят положительный и отрицательный на HBsAg контроли, а также образцы сывороток крови в объеме 100 мкл с добавлением 50 мкл фосфатно-солевого раствора 0,05 М рН 7,2, содержащего твин-20 0,05% (ФСРТ). Содержимое пробирок перемешивают одноканальным дозатором со сменными наконечниками, после чего штатив с пробирками помещают в термостат на 2 часа при температуре 37°С. Во время инкубации через каждые 20-30 мин проводят встряхивание пробирок в течение 7-10 сек. По окончании инкубации пробирки с содержимым центрифугируют при 5000 об/мин в течение 5 мин. Надосадок удаляют одноканальным дозатором и проводят трехкратную промывку эмульсии перемешиванием с ФСРТ. Затем в каждую пробирку вносят 150 мкл иммунопероксидазного конъюгата, разведенного согласно инструкции к набору. После 1-часовой инкубации пробирок при температуре 37°С и периодического перемешивания эмульсии, как описано выше, следует четырехкратная промывка ФСРТ. Результаты реакции оценивают после добавления и перемешивания 100 мкл субстрат-хромогенной смеси с содержимым пробирок. Через 20 мин инкубации при комнатной температуре в темноте реакцию останавливают добавлением 50 мкл стоп-реагента. Пробирки вновь центрифугируют при 5000 об/мин в течение 5 мин и полученный надосадок в объеме 100 мкл переносят в 96-луночный планшет для регистрации оптической плотности продуктов ферментативной реакции при 450 нм.

Проведенное тестирование образцов сыворотки крови больных острым гепатитом В и потенциальных доноров крови, у которых был обнаружен HBsAg, показывает полное совпадение результатов ИФА с использованием в качестве носителя антител полистироловых планшетов и предлагаемой авторами эмульсии ПФОС. Величина ОП₄₅₀ отрицательного контроля сывороток здоровых лиц и больных хроническим гепатитом С (ХГС) не превышает 0,15 оптических единиц (о.е.). Показатель ОП₄₅₀ образцов сывороток крови, содержащих HBsAg, составляет 0,315 о.е. и выше.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет выявить HBsAg в сыворотках крови в иммуноферментном анализе с использованием сенсибилизированной антителами эмульсии перфторорганических соединений.

Пример №2. К отмытой центрифугированием 0,5 мл эмульсии ПФОС при 6000 об/мин в течение 5 мин десятикратным по объему 0,15М физиологическим раствором рН 6,8 от глюкозы и солей, входящих в состав «Перфторана», вносят 3000 ТЕ в 1 мл забуференного физиологического раствора 0,1М рН 7,2 (ЗФР) сухого туберкулина, производства Санкт-Петербургского института вакцин и сывороток. Сенсибилизацию ПФОС проводят при комнатной температуре в течение 3 часов и при температуре 8°С 48 часов. По ее окончании следует промывка центрифугированием десятикратным по объему ЗФР при 3000 об/мин в течение 10 мин до Е₂₈₀=0. После последнего центрифугирования осадок эмульсии растворяют в 4 мл того же буфера и используют для постановки ИФА в пробирках Эппендорф в объеме 100 мкл с предварительным центрифугированием при 5000 об/мин в течение 5 мин на 1 пробу. Материалом для исследований служат образцы сывороток крови от 13 здоровых лиц и от 17 больных туберкулезом легких, диагноз у которых подтвержден бактериологически. Все образцы сывороток крови предварительно тестируют в ИФА согласно инструкции к набору «ИФА-Анти-Туб», производства Санкт-Петербургского НИИ вакцин и сывороток им. Л. Пастера. При постановке ИФА с сенсибилизированной эмульсией «Перфторан» используют иммунопероксидазный конъюгат и субстрат-хромогенную смесь из набора «ИФА-Анти-Туб». Исследуемые сыворотки разводят 1:10 ФСРТ и вносят по 100 мкл в каждую пробирку. После одночасовой инкубации в термостате при температуре 37°С следует трехкратная промывка эмульсии центрифугированием при 5000 об/мин в течение 5 мин 200 мкл ФСРТ. Процедуру инкубации иммунопероксидазного конъюгата и последующую промывку эмульсии ПФОС проводят при тех же условиях и параметрах, что и сывороток. Результаты реакции оценивают по величине ОП₄₅₀ продуктов ферментативной реакции. Сопоставление величин ОП₄₅₀, полученных по данным ИФА с использованием 96-луночных планшетов и эмульсии «Перфторан», показывает их совпадение. Величина отрицательных результатов на наличие антител в сыворотке крови к туберкулину составляла не более 0,2 о.е. Показатели ОП₄₅₀, превышающие 0,5 о.е., свидетельствуют о наличии антител к туберкулину.

Предложенным способом выявляют антитела к туберкулину в иммуноферментном анализе в сыворотках крови больных туберкулезом и здоровых лиц с применением эмульсии перфторорганических соединений, сенсибилизированной сухим туберкулином.

Таким образом, авторами представлен способ, в котором используют субмикронную эмульсию ПФОС, никем ранее не предложенную в качестве носителя сенситинов для выявления антигена или антитела в ИФА.

Хранение диагностических препаратов в течение шести месяцев не снижает их эффективности (срок наблюдения).

Предлагаемый способ упрощает процесс приготовления сенсибилизированных капель-сорбентов, обеспечивает высокую чувствительность способа, стандартность и стабильность препаратов, сравнительно низкую стоимость эмульсии ПФОС. Эмульсия ПФОС обладает большой площадью реакционно-способной поверхности. Осуществление предлагаемого способа безопасно для персонала, не требует использования дорогостоящего оборудования.

Предложенный способ может быть рекомендован для использования иммунологическими лабораториями противотуберкулезных и инфекционных учреждений системы здравоохранения.

Способ выявления антигена или антитела в иммуноферментном анализе (ИФА), предусматривающий использование иммобилизованных сенситинов на носителе и учет результатов ИФА, отличающийся тем, что в качестве носителя используют субмикронную монодисперсную стабильную эмульсию перфторорганических соединений (ПФОС) 10 об.% 0,5 мл, освобожденную от солей и глюкозы промыванием десятикратным объемом 0,15М физиологического раствора рН 6,8, и соответствующий сенситин иммобилизуют на поверхность капель эмульсии ПФОС.