Способ выделения и культивирования аутологичных дермальных фибробластов для стимуляции регенеративных процессов и заместительной терапии

Изобретение относится к клеточной биологии, в частности к технологии получения культур клеток, и может быть использовано в медицине и косметологии. Разработан способ выделения и культивирования аутологических фибробластов, который включает а) получение клеток из биоптатов без ферментативной и механической обработки исходного материала, где биоптат помещается под покровное стекло и инкубируется на чашке Петри, покрытой синтетическим аналогом внеклеточного матрикса поли-D-лизином, в среде DMEM с 2%-ной ФБС до образования фибробластами, мигрировавшими из экспланта, монослоя и б) дальнейшее культивирование полученных на стадии а) клеток на чашке Петри с поли-D-лизином в питательной среде, в которой традиционно используемые сыворотки животного происхождения заменяют 10%-ной собственной сывороткой крови пациента. Совокупность показателей качества культуры аутологичных дермальных фибробластов, полученной предлагаемым способом, свидетельствует о высокой жизнеспособности и пролиферативной активности клеток, низком уровне апоптоза и относительной генетической стабильности получаемой культуры, что позволяет рекомендовать ее как безопасный препарат для клеточной терапии в эстетической медицине. 4 ил.

 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к технологии получения культур фибробластов, предназначенных для использования в качестве средства для регенеративной терапии в косметологии и эстетической медицине.

Методики клеточной терапии, использующие для восстановления и биостимуляции кожи внутрикожные клеточные инъекции, в последнее время получили широкое распространение [1]. Первоначально для клеточной терапии предлагалось применение линий эмбриональных клеток человека, фибробластов, выделенных из пуповинной крови, а также линейных диплоидных фибробластов легкого эмбриона человека. Однако введение (аллогенных) эмбриональных клеток, помимо этических вопросов, возникающих в связи с использованием эмбрионов человека, столкнулось с проблемой проявления побочных эффектов в виде иммунной реакции в организме пациента.

В настоящее время в косметологии и регенеративной медицине разрабатываются подходы к использованию аутологичных недифференцированных мезенхимальных клеток, а также аутологичных дермальных фибробластов. В результате исследований по культивированию фибробластов было достаточно убедительно показано, что аутологичные фибробласты, выращенные in vitro, способны при поддержании их в определенных условиях полностью сохранять свои физиологические функции. В частности, нами было установлено [2], что дермальные фибробласты, выделяемые из кожных биоптатов человека, имеют высокий уровень секреторной активности и продуцируют компоненты адгезивной системы клетки (рецептор гиалуроновой кислоты - CD44) и внеклеточного матрикса, участвующие в поддержании тургора и эластичности кожи (проколлаген I типа, коллаген IV типа, фибронектин и тропоэластин). Эти факты определили принципиальную возможность применения культур дермальных фибробластов в практической медицине и косметологии. Однако следует обратить внимание на то, что далеко не всегда попытки использования клеточной терапии приводят к желаемому результату. При этом причиной во многих случаях является недостаточно высокое качество клеточной культуры, которое может быть следствием применения к клеткам излишне «жестких» условий, а также длительности процедуры выделения и культивирования. В связи с этим не вызывает сомнений необходимость дальнейшего совершенствования способов культивирования фибробластов, предназначенных для целей регенеративной медицины и косметологии, в направлении, обеспечивающем сокращение сроков получения клеток и повышение качества получаемых культур.

Уровень техники

Наиболее близким к предлагаемому способу по технической сущности и достигаемому результату является способ культивирования фибробластов для заместительной терапии, описанный в патенте RU №2320720 [12]. Этот способ заключается в том, что биоптат кожи инкубируют в растворе ферментов диспазы и коллагеназы I типа на основе среды культивирования DMEM с добавлением 5% эмбриональной бычьей сыворотки (ЭБС) в течение 1,5 часов при постоянном помешивании и пипетировании. Получаемую суспензию клеток далее центрифугируют, осадок клеток ресуспендируют в стандартной среде для фибробластов (DMEM/10% ЭСБ /100 ед./мл пенициллина, 100 ед./мл стрептомицина, 100 ед./мл фунгизона) и высевают на чашки Петри. После прикрепления клетки переводят на длительное культивирование в среде, содержащей собственную сыворотку крови пациента (ССКП): DMEM/10% ССКП /100 ед./мл пенициллина, 100 ед./мл стрептомицина, 100 ед./мл фунгизона.

В целом данный способ благодаря применению на стадии культивирования клеток ССКП вместо фетальных сывороток животных улучшает показатели получаемой культуры поскольку культивирование без использования сывороток животных снижает риски инфицирования культуры и дальнейшего иммунного ответа при введении в кожу пациента.

Вместе с тем, описанный выше способ, как и большинство других аналогов, предполагает достаточно «жесткую» обработку первичного материала (биоптата кожи), а именно инкубацию с протеазами животного происхождения при постоянном перемешивании и пипетировании, которая является травматичной для клеток процедурой, снижающей общее количество жизнеспособных клеток в получаемой суспензии дермальных фибробластов, а также приводящей к нарушениям адгезивной и рецепторной систем у части сохранивших жизнеспособность клеток. При использовании предлагаемых в способе-прототипе условий обработки биоптата кожи значительная часть клеток гибнет на начальном этапе, а получение необходимого количества клеток достигается в результате длительного наращивания клеточной массы из исходно небольшого количества клеток. Вследствие этого клетки в получаемой культуре приближаются к лимиту Хейфлика, характерному для стареющих клеток [9]. После описанных процедур выделенные клетки адаптируются к новым условиям, по меньшей мере, 2-3 недели. Известно, что длительное культивирование приводит к увеличению доли апоптотических клеток, снижению пролиферативной активности клеток [9], нарушению митотического деления, утрате основных функций или жировому перерождению клеток, поэтому используемые в прототипе сроки культивирования существенно повышают вероятность гибели клеток и появления клеток с измененным генотипом, а также с морфологическими и функциональными нарушениями, что недопустимо применительно к материалу, который предназначается для последующей трансплантации.

Настоящее изобретение представляет собой разработку, в которой предпринята попытка повысить эффективность и качество получаемой для последующей трансплантации культуры аутологичных фибробластов за счет использования технологии получения культуры клеток из кожного экспланта, не требующей дополнительных механических воздействий и применения протеаз для обработки первичного материала, а также за счет сокращения общих сроков культивирования.

Раскрытие изобретения

Разработан способ получения культуры аутологичных дермальных фибробластов, предназначенной для регенеративной терапии, который основан на изолировании клеток за счет их спонтанной миграции из биоптата кожи пациента с помощью усовершенствованной методики, предусматривающей его инкубацию на подложке под покровным стеклом в оптимальных для осуществления этого процесса условиях, и последующем культивировании фибробластов на подложке в питательной среде, содержащей собственную сыворотку крови пациента, где в качестве внеклеточного матрикса, покрывающего подложку, на обеих стадиях используется поли-D-лизин.

Технический результат, достигаемый при осуществлении настоящего способа по изобретению, заключается в повышении качества получаемой культуры, выражающемся в увеличении жизнеспособности клеток и в сокращении сроков получения достаточного для проведения соответствующей медицинской или косметической процедуры количества жизнеспособных клеток.

Указанный технический результат достигается, главным образом, за счет применения более мягких физиологических условий первичной обработки экспланта, исключающих использование протеаз животного происхождения и грубых механических воздействий и предусматривающих дополнительную защиту его от неблагоприятных воздействий путем помещения под покровное стекло, а также благодаря использованию при инкубировании биоптата (на первой стадии способа) и полученных из него клеток (на второй стадии способа) подложек, покрытых синтетическим аналогом внеклеточного матрикса поли-D-лизином, который, как было установлено, обеспечивает максимальную скорость миграции и пролиферации выделяемых фибробластов в предлагаемых условиях. В качестве дополнительного результата можно отметить, что исключение из процедуры ферментов животного происхождения существенно снижает риск контаминации культивируемых клеток различными инфекциями, а также иммунного ответа при введении в кожу пациента.

Способы получения культуры кератиноцитов или фибробластов из кожного экспланта без ферментативной обработки применялись и ранее [7, 8]. Однако в известных способах кожный эксплант заключался в трехмерный гель, содержащий коллаген животного происхождения. Метод же культивирования кожного экспланта на подложке под стеклом, применяемый в данном изобретении, в научно-технической и патентной литературе не описан. Кроме того, имеющиеся в литературе данные свидетельствуют о том, что матриксами, в наибольшей степени стимулирующими адгезию фибробластов человека, являются коллаген, ламинин и фибронектин. Считается, что выживаемость клеток в культурах с использованием этих матриксов примерно на 15% выше, чем при использовании поли-L-лизина, а способность клеток, культивируемых в стандартных условиях, к адгезии на поли-D-лизине еще ниже, чем на поли-L-лизине [11]. Таким образом, при осуществлении изобретения был получен «неожиданный эффект», заключающийся в том, что в условиях предлагаемого способа именно использование поли-D-лизина в качестве внеклеточного матрикса дало наилучшие результаты в плане стимуляции миграции и пролиферации аутологичных фибробластов из кожного экспланта и при последующем культивировании выделенных клеток с использованием ССКП.

При осуществлении изобретения культуру аутологичных дермальных фибробластов получают в стерильных условиях из биоптатов кожи пациента. Используя питательную среду DMEM с добавлением 2% ФБС (фетальная бычья сыворотка) и раствора антибиотика-антимикотика, биоптат кожи помещают на чашки Петри, покрытые синтетическим аналогом внеклеточного матрикса поли-D-лизином, и располагают под стерильным покровным стеклом. Экспланты культивируют в инкубаторе при 37°С при 5%-ном содержании СО₂. При таких условиях культивирования отдельные фибробласты мигрируют из экспланта и начинают пролиферировать уже на 3-4 день после начала культивирования (фиг.1), в то время как после ферментативной обработки биоптатов кожи начало пролиферации наблюдается лишь через 12-15 дней. При достижении конфлюэнтного монослоя (фиг.1В) клетки пассируют, используя для снятия клеток с подложки обработку синтетическим аналогом трипсина (раствором HyQ®Tase™). Далее клетки культивируют до 3-4 пассажа в среде DMEM с добавлением 10% ССКП.

Для введения в кожу пациентам аутологичные дермальные фибробласты, выращенные данным способом, отмывают от среды культивирования в буфере Хэнкса, снимают с подложки и ресуспендируют в новой порции раствора Хэнкса в концентрации 1 миллион клеток в 1 мл.

Общая длительность предлагаемой процедуры получения культуры фибробластов составляет примерно 3-4 недели против 5-6 недель в способе-прототипе. Помимо повышения уровня сохранности клеток (числа исходно получаемых из экспланта кожи жизнеспособных клеток), на сокращение сроков культивирования в предлагаемом способе влияет оптимальный выбор внеклеточного матрикса, в качестве которого был применен поли-D-лизин, отобранный нами по результатам прямого сравнительного анализа шести наиболее широко используемых в практике вариантов (см. пример 2).

Указанное сокращение сроков культивирования снижает вероятность появления таких признаков «старения» клеток, как полиплоидия или многоядерность. В культуре фибробластов, полученной предлагаемым методом, указанных аномалий обнаружено не было ни в одном из экспериментов. Не было выявлено и изменений морфологии клеток или признаков нарушения митотического деления (патологических митозов, наличия микроядер). На всем протяжении культивирования фибробластов сохранялось контактное торможение деления клеток, характерное для нормальных нетрансформированных фибробластов: при достижении монослоя клеток пролиферативная активность фибробластов резко падала.

С целью более полной характеристики полученной предлагаемым способом культуры фибробластов была проведена оценка митотического и апоптотического индекса при культивировании клеток в среде с ССКП, а также анализ их генетической стабильности в указанных условиях. Для сравнения использовали клетки, культивируемые в среде без сыворотки или в среде с содержанием 10% ФБС, которая стандартно используется для культивирования большинства клеток.

По результатам статистической обработки данных определения митотического индекса установлено, что через 48 часов происходит увеличение митотической активности фибробластов, культивированных в условиях, предусмотренных предлагаемым способом (культивирование на чашках Петри, покрытых поли-D-лизином, с использованием 10% аутологичной сыворотки крови пациента), которое достоверно больше наблюдаемого для клеток, культивируемых в тех же условиях, но в среде, не содержащей сыворотки. При этом митотическая активность фибробластов, культивированных с 10% ССКП, и митотическая активность клеток, культивированных с 10% ФБС, были сопоставимы (фиг.2), что свидетельствует о столь же высокой способности ССКП стимулировать рост клеток в предлагаемых условиях получения культуры, как и в случае традиционно используемой ФБС.

Оценка апоптотического индекса показала, что культивирование, осуществляемое согласно предлагаемому способу, не вызывает увеличения доли апоптотических фибробластов в отличие от эксперимента с заменой ССКП на ФБС, где несмотря на высокий митотический индекс (см. выше) увеличение доли апоптотических клеток более чем в 3 раза, превышает этот показатель, измеренный у фибробластов, культивированных с использованием ССКП (фиг.3).

Для изучения генетического полиморфизма в полученных культурах дермальных фибробластов был использован метод RAPD-PCR анализа ДНК с применением ряда случайных праймеров (447, Р29, R45). Данное исследование позволяет контролировать генетическую изменчивость фибробластов и возможное возникновение мутаций при длительном культивировании и пассировании клеток в условиях in vitro [4, 5, 6], где изменение подвижности тех или иных фрагментов ДНК рассматривают как следствие геномных перестроек или мутаций, затрагивающих участки комплементарного связывания ДНК с олигонуклеотидными праймерами. При исследовании образцов ДНК культур фибробластов визуально определимые отличия в RAPD-PCR спектрах образцов ДНК были обнаружены только при использовании праймера 447 (пример 4). В эксперименте анализировали ДНК, выделенную из аутологичных дермальных фибробластов линий, полученных от нескольких здоровых волонтеров, после культивирования либо в условиях согласно способу по изобретению (культивирование на чашках Петри, покрытых поли-D-лизином, с использованием 10% ССКП), либо в аналогичных условиях, но с 10% ФБС. При этом было показано, что фибробласты, культивируемые в условиях нового способа, проявляют большую генетическую стабильность, чем при культивировании в тех же условиях, но в присутствии 10% ФБС, которая используется в большинстве протоколов для культивирования клеток различного происхождения.

К сожалению, сравнение культуры фибробластов, получаемой новым способом и способом-прототипом, по трем названным выше показателям, которые объективно свидетельствуют о высоком качестве культуры по изобретению, не представляется возможным, поскольку в отношении культуры, описанной в патенте RU №2320720, эти показатели не анализировались.

Из проведенных при осуществлении изобретения исследований с очевидностью следует, что высокое качество получаемой культуры аутологичных фибробластов и сокращение сроков процедуры культивирования определяются комплексом применяемых для осуществления предлагаемого способа условий: применением «мягкой» обработки исходного материала; среды, содержащей ССКП, и поли-D-лизина в качестве внеклеточного матрикса.

Таким образом, объектом настоящего изобретения является способ выделения и культивирования аутологичных дермальных фибробластов для стимуляции регенеративных процессов и заместительной терапии, включающий получение клеток из экспланта кожи пациента и инкубацию их в питательной среде DMEM/раствор антибиотика-антимикотика, содержащей 10%-ную собственную сыворотку крови пациента (ССКП), отличающийся тем, что изолированные клетки получают из биоптата путем размещения его под стерильным покровным стеклом на чашке Петри, покрытой синтетическим аналогом внеклеточного матрикса поли-D-лизином, и инкубирования в питательной среде DMEM/раствор антибиотика-антимикотика, содержащей 2% фетальную бычью сыворотку, после образования монослоя клетки снимают раствором, содержащим синтетический аналог трипсина, и проводят их культивирование в питательной среде с ССКП на чашке Петри, покрытой поли-D-лизином.

Краткое описание чертежей

Фиг.1. Фазово-контрастное изображение миграции фибробластов из экспланта кожи и формирования клетками монослоя. А - мигрирующие фибробласты (4 день культивирования). Б - начало формирования монослоя фибробластов. В - сформированный монослой фибробластов (10-12 день культивирования). Ядра докрашены DAPI.

Фиг.2. Определение митотического индекса клеток в получаемой культуре аутологичных фибробластов.

Фиг.3. Определение апоптотического индекса клеток в получаемой культуре аутологичных фибробластов.

Фиг.4. Метод RAPD-PCR анализа геномной ДНК клеток полученной культуры с применением праймера 447. Профили амплификации образцов ДНК клеточных линий, полученных от различных индивидуумов, обозначены номерами #11, #14 и #20. Номера дорожек внутри образца (1, 5, 10) соответствуют номеру пассажа данной линии фибробластов, культивированных с использованием 10% ФБС. Дорожка 10* соответствует 10 пассажу линии фибробластов того же образца при культивировании с использованием 10% ССКП.

Осуществление изобретения

При осуществлении изобретения, помимо методов, подробно раскрытых в нижеследующих примерах, были использованы хорошо известные специалистам методики по культивированию клеток, описанные также в цитированных источниках.

Пример 1

Для получения культуры дермальных фибробластов использовали биоптаты кожи человека размером 2×3×4 мм. Работа с биоптатом проводилась стерильными инструментами.

После выделения биоптат помещали в одноразовую пробирку с питательной средой HyQ^® DMEM RS™ (Hyclone) (без добавления сыворотки), содержащей раствор антибиотика/антимикотика (HyQ Antibiotic/Antimycotic Solution, Нуclone). Следует отметить, что в качестве питательной среды и раствора антибиотика/антимикотика могут быть использованы не только продукты избранной нами фирмы, но и аналогичные продукты любых других фирм-производителей. Затем в стерильных условиях культурального бокса биоптат переносили в раствор HyQ^® DMEM/F12-RS™ (Нуclone) с добавлением 2% ФБС (фетальная бычья сыворотка), раствора антибиотика-антимикотика (Hyclone) и помещали на чашки Петри CELLCOAT, покрытые внеклеточным матриксом (выбор его оптимального варианта описан в примере 2), располагая кусочек кожи под стерильным покровным стеклом. Эксплант кожи культивировали в инкубаторе при 37°С при 5%-ном содержании CO₂. Уже на 2-3 день из кожного экспланта наблюдали начало миграции фибробластов из кожного экспланта, на 4 день - деление клеток и постепенное формирование монослоя на поверхности чашки Петри (фиг.1). При достижении конфлюэнтного монослоя, образующегося примерно на 10 день (фиг.2), клетки пассировали.

Для снятия с подложки монослой клеток обрабатывали раствором HyQ®Tase™ (Hyclone), который является синтетическим аналогом трипсина, не содержащим добавок животного или бактериального происхождения. Снятые с подложки клетки рассаживали в соотношении 1:3. Далее клетки культивировали до 3-4 пассажа в среде HyQ^® DMEM/F12-RS™ (Hyclone) с добавлением 10% ССКП (собственной сыворотки крови пациента).

Для использования в процедуре трансплантации аутологические дермальные фибробласты, выращенные на аутологической сыворотке, отмывали от среды культивирования в буфере Хэнкса (Hank's Balanced Salt Solution, HyQ HBSS, Hyclone), обрабатывали раствором Версена для снятия клеток с подложки в течение 15 мин и центрифугировали в течение 5 мин при 200 g. Супернатант сливали, а клетки ресуспендировали в новой порции раствора Хэнкса в концентрации 1 миллион клеток в 1 мл. Полученная суспензия аутологических фибробластов в растворе Хэнкса пригодна для введения фибробластов в кожу человека.

В случае необходимости длительного хранения культивированных фибробластов клетки замораживали в среде культивирования с добавлением 15-20% ССКП и 10% ДМСО в качестве криопротектора.

Пример 2

Для подбора наиболее благоприятного субстрата для выделения и культивирования дермальных фибробластов было протестировано несколько видов культурального пластика, покрытого разными типами внеклеточного матрикса или без него. Были использованы: 1) чашки Петри CELLCOAT^®, покрытые коллагеном I типа (Greiner bio-one) 2) чашки Петри CELLCOAT^®, покрытые синтетическим аналогом внеклеточного матрикса поли-D-лизином (Greiner bio-one) 3) чашки Петри CELLCOAT^®, покрытые фибронектином человека (Greiner bio-one) 4) чашки Петри CELLCOAT^® покрытые ламинином (Greiner bio-one) 5) стандартные без покрытия полистириновые чашки Петри Corning^®, предназначенные для культивирования клеток (Corning Incorporated) 6) стандартные без покрытия полистириновые чашки Петри Corning^®, покрытые 0,2% желатином.

Биоптат делили на 6 фрагментов и помещали в каждую из указанных типов чашек, добавляя по 4 мл среды HyQ^® DMEM/F12-RS™ (Hyclone)/20% ФБС (Hyclone). Было обнаружено, что оптимальным типом внеклеточного матрикса для стимуляции миграции и пролиферации дермальных фибробластов в условиях in vitro является поли-D-лизин. На чашках Петри CELLCOAT^®, покрытых синтетическим аналогом внеклеточного матрикса поли-D-лизином (Greiner bio-one), одиночные фибробласты мигрируют из биоптата уже на 3-4 сутки, а через 7-10 дней формируют монослой. При использовании всех других типов внеклеточного матрикса миграция отдельных фибробластов из биоптата происходит не ранее, чем на 5-7 сутки, а монослой формируется не ранее, чем через 12-14 дней. Таким образом, использование культурального пластика, покрытого поли-D-лизином, позволяет существенно ускорить процедуру выделения и выращивания клеток из кожного экспланта.

Пример 3

Для оценки скорости роста и апоптотического индекса фибробластов кожи в культуре, полученной описанным в примере 1 способом, клетки высаживали на чашки Петри, покрытые поли-D-лизином в концентрации 100 тыс. клеток/мл. Через сутки клетки депревировали в течение 24 часов. Для проведения эксперимента клетки помещали в среду DMEM HyQ^® DMEM/F12-RS™ (Hyclone) с антибиотиком-антимикотиком, содержащую разные концентрации сыворотки: 0%, 10% фетальной бычьей сыворотки (ФБС) или 10% собственной сыворотки крови пациента (ССКП). Клетки фиксировали 4% нейтральным формалином через 48 часов и окрашивали гематоксилином.

На препаратах оценивали число митотических (фиг.2) и апоптотических (фиг.3) клеток на 1000 клеток. Статистическая обработка полученных результатов показала, что через 48 часов происходит достоверное увеличение митотической активности фибробластов, культивируемых в среде, содержащей 10% аутологичной сыворотки (по сравнению со средой, не содержащей сыворотки). При этом митотическая активность клеток, культивированных в присутствии 10% ФБС и 10% ССКП, сопоставима, что свидетельствует о том, что ССКП способна так же эффективно, как и ФСБ, считающаяся у специалистов оптимальной, стимулировать рост клеток в культуре. Существенно, однако, что использование ССКП позволяет избежать риска заражения культуры клеток инфекциями, которые потенциально могут присутствовать в сыворотках животных, и с этой точки зрения оно является предпочтительным.

Оценка апоптотического индекса показала, что культивирование полученных предлагаемым методом фибробластов в среде с собственной сывороткой крови пациента не вызывает достоверного увеличения доли апоптотических клеток через 48 часов (фиг.3). Следует отметить, что при использовании среды культивирования, содержащей 10% ФБС, рост доли апоптотических клеток за то же время более чем в 3 раза превышает показатель для фибробластов, культивированных с использованием ССКП.

Пример 4

Безопасность трансплантации фибробластов в значительной мере связана с сохранением клетками нормального (исходного) генетического статуса. В связи с этим полученная способом по изобретению культура была исследована на предмет возможной трансформации фибробластов в процессе культивирования. Для этого использовали фибробласты, полученные от 8 здоровых доноров, на 1, 5 и 10 пассажах культивирования в среде HyQ^® DMEM/F12-RS™ (Hyclone) с добавлением 10% ССКП; для сравнения использовались фибробласты, полученные от тех же пациентов, но культивированные в среде HyQ^® DMEM/F12-RS™ (Hyclone) с добавлением 10% или 20% ФБС (Hyclone).

Из культур клеток фибробластов выделяли ДНК при помощи стандартной фенольно-хлороформной методики с применением протеиназы К [3]. Затем проводили PCR-амплификацию на четырехканальном ДНК-амплификаторе «Терцик» (ТП4-ПЦР-01), используя в качестве матрицы 100 нг геномной ДНК (в объеме 20 мкл) и набор «GenePak PCR Core» («Лаборатория Изоген»). Продукты амплификации фракционировали в 2% агарозном геле в течение 18 часов при температуре 4°С в 1х трис-боратном (ТБЕ) буфере: 89 mM трис-борат, 89 mM борная кислота, 2 mM ЭДТА, pH 8.0, с последующей визуализацией с использованием раствора бромистого этидия 50 мкг/л. В качестве маркеров молекулярного веса использовали 100 bp Ladder + (Fermentas) и Ladder 1kb (Fermentas).

Для выявления генетической изменчивости применяли метод полимеразной цепной реакции RAPD-PCR со случайными праймерами. В данном случае использовали три праймера - Р92, R45, 447: Р92 5'-CATTCCGGCC-3', R45 5'-GCCGTCCGAG-3', 447 5'-AACGGTCACG-3', которые были отобраны на основании ранее полученных результатов [4, 5, 6]. Чувствительность данных праймеров позволяет использовать их для оценки внутривидовой специфичности, а также проводить геномную характеристику клеточных культур (заявка на патент №2008114535 от 16.04.2008 г.).

При исследовании полученных образцов ДНК значительные отличия в RAPD-PCR спектрах были обнаружены только в случае использования праймера 447. Данные отличия выражались в изменении электрофоретической подвижности отдельных фрагментов, а также появлении или утрате фрагментов в спектрах ДНК, выделенных из фибробластов длительного пассирования. На фиг.4 представлены результаты амплификации с олигонуклеотидом 447, из которых видно, что RAPD спектры представлены в среднем 12 фрагментами в зоне электрофоретического фракционирования от 250 п.о. до 1500 п.о. Исходные профили амплификации образцов ДНК различных клеточных линий, полученных от разных доноров, были в целом идентичными, хотя имелись определенные индивидуальные различия (номера #11, #14 и #20 соответствуют номерам клеточных образцов). Обращает на себя внимание то, что в клетках, культивированных с использованием ФБС, иногда уже к 5 пассажу (образец #20), хотя в основном к 10 пассажу (образец #14, #11), проявлялись изменения RAPD спектров образцов ДНК. В частности, при культивировании клеток образца #14 с использованием ФБС нестабильность RAPD спектров образцов ДНК отмечалась к 10 пассажу (ср. дорожки 1, 5, 10), в то время как при культивировании клеток этого же образца с использованием ССКП RAPD спектры образцов ДНК на этот момент никаких изменений не обнаруживали (дорожка 10*).

По результатам применения метода RAPD-PCR анализа ДНК может быть сделан вывод о том, что культуры фибробластов по изобретению демонстрируют достаточно продолжительную генетическую стабильность клеток в условиях in vitro.

Совокупность всех исследованных при осуществлении изобретения показателей качества культуры аутологичных дермальных фибробластов, полученной предлагаемым способом («мягкие» условия на стадии выделения клеток, использование поли-D-лизина в качестве внеклеточного матрикса и включение ССКП в среду для культивирования), демонстрирует высокую жизнеспособность и пролиферативную активность, низкий апоптотический уровень и относительную генетическую стабильность, в связи с чем может быть рекомендована как безопасный препарат для клеточной терапии в эстетической медицине.

Литература

1. Lim I.J., Phan T.T., Bay B.H., Qi R., Huynh H., Tan W.T., Lee S.T., Longaker M.T. Fibroblasts cocultured with keloid keratinocytes: normal fibroblasts secrete collagen in a keloidlike manner. Am J Physiol Cell Physiol. 2002, 283: C212-C222.

2. Рубина К.А., Калинина Н.И., Сысоева В.Ю., Беренбейн М.Б., Парфенова Е.В. Фенотипическая и функциональная характеристика клеток, используемых для аутотрансплантации. Эстетическая Медицина. 2006. 5(3): 291-298.

3. Mathew, C.G.P. Methods in Molecular Biology, Walker J.M., Ed., New York: Human Press, 1984, Vol.2, pp.31-34.

4. Alexandrova S.A., Shvemberg I.N. Genetic variability of the mouse hepatoma cells MH-22a revealed by RAPDPCR-fingerprinting under different conditions of cultivation.//Experimental Oncology. 2005. V. 27. (2). P.114-119.

5. Малышева Д.Н., Токарская О.Н., Петросян В.Г. и др. Генетическая дифференциация партеногенетических ящериц Darevskia rostombekowi (сем. Lacertidae) по данным ядерных и митохондриальных маркеров ДНК.// Докл. РАН. 2006. Т.410. №4. С.560-563.

6. Бутовская П.В., Мартиросян И.А., Баранов B.C., Егорова А.А., Киселев А.В., Павлова Г.В., Корочкин Л.И. Выявление соматического мозаицизма у человека с помощью полимеразной цепной реакции со случайными праймерами.//Генетика. 2007. Т.43. №12. С.1-5.

7. Duong H.S., Zhang Q., Kobi A., Le A., Messadi D.V.^a Assessment of morphological and Immunohistological Alterations in Long-Term Keloid Skin Explants.//Cells Tissues Organs 2005. V.181: P.89-102.

8. Froget S., Barthelemy E., Guillot F., Soler C., Coudert M.C., Benbunan M., Dosquet C. Wound healing mediator production by human dermal fibroblasts grown within a collagen-GAG matrix for skin repair in humans. //Eur Cytokine Netw. 2003. V.14. P.60-64.

9. Hayflick L., Moorhead P.S. The serial cultivation of human diploid cell strains.//Exp Cell Res. 1961. 25. P.585-621.

10. Asano Y., Ihn H., Yamane K., Jinnin M., Tamaki K. Increased Expression of Integrin αvβ5 Induces the Myofibroblastic Differentiation of Dermal Fibroblasts.// Am J Pathol. 2006. 168. P.499-510.

11. Baust M., Fowler A., Toner M. Effect of Cell Substrate Interactions on the Desiccation Behavior of Human Fibroblasts. //Cell Preservation Technology. 2004. V.2. P.188-197.

12. Патент РФ №2320720 С2, 27.03.2008.

Способ выделения и культивирования аутологичных дермальных фибробластов для стимуляции регенеративных процессов и заместительной терапии, включающий получение клеток из биоптата (экспланта) кожи пациента и культивирование клеток в питательной среде DMEM/раствор антибиотика-антимикотика, содержащей 10%-ную собственную сыворотку крови пациента (ССКП), отличающийся тем, что изолированные клетки получают из биоптата путем размещения его под покровным стеклом на чашке Петри, покрытой синтетическим аналогом внеклеточного матрикса поли-D-лизином, и инкубирования в питательной среде DMEM/раствор антибиотика-антимикотика, содержащей 2%-ную фетальную бычью сыворотку, после образования монослоя клетки снимают раствором, содержащим синтетический аналог трипсина, и проводят их культивирование в питательной среде с ССКП на чашке Петри, также покрытой поли-D-лизином.