Способ получения стоматологической пленки, обладающей противовоспалительным действием
Владельцы патента RU 2395292:
Институт общей и экспериментальной биологии Сибирского отделения Российской академии наук (ИОЭБ СО РАН) (RU)
Изобретение относится к фармации. Измельченное сухое растительное сырье - листья какалии копьевидной - трижды экстрагируют при 96-98°С 70% этанолом при соотношении сырье: экстрагент (1:16-18) в течение 1,5 ч каждая, с последующим объединением экстрактов, отгоном этанола, упариванием и сушкой полупродукта в вакуум-сушильном аппарате, растиранием полупродукта со смесью Твин 80-диметилсульфоксид-глицерин в соотношении 1:1:10, и далее с 5% раствором карбоксиметилцеллюлозы в соотношении 1:5 и 10% раствором желатины в соотношении 1:5, заливанием пленочной массы в формы и сушкой при 20-22°С. Изобретение позволяет реализовать указанное назначение. 6 табл.
Изобретение относится к области фармации и касается способа получения средства из растительного сырья, применяемого при воспалительных заболеваниях пародонта.
Известен способ получения лекарственных пленок для коррекции иммунологического статуса организма [6]. Недостатками известного метода является использование в качестве носителя фармакологических свойств жидкой формы из растительных объектов (настоек, жидких экстрактов), что удлиняет процесс сушки пленки и в ряде случаев приводит к неравномерному распределению пленочной массы по заливочной форме. Более того, для настоек и жидких экстрактов характерно низкое содержание действующих веществ, что в свою очередь сказывается на качестве конечной лекарственной формы - пленки.
Технический результат изобретения - получение средства из листьев какалии копьевидной (Cacalia hastata L.), применяемого при воспалительных заболеваниях пародонта, который достигается за счет использования в ходе технологического процесса сухого экстракта.
Для достижения указанного технического результата измельченный растительный материал (листья какалии копьевидной) экстрагируют 70% этанолом в соотношении сырье: экстрагент 1:(16-18) с учетом коэффициента спиртопоглощения при температуре 96-98°С в течение 1.5 час. Извлечение фильтруют в сборник. Экстракцию повторяют в тех же условиях еще два раза. Спиртовые извлечения объединяют и концентрируют до 1/30 от первоначального объема. Полученный продукт высушивают в вакуум-сушильном шкафу и измельчают на мельнице пропеллерного типа. Выход готового полупродукта (сухого экстракта) составляет 29.5-32.7% от массы растительного сырья. Полупродукт (сухой экстракт) растирают до гомогенной массы со смесью Твин 80-диметилсульфоксид-глицерин в соотношении 1:1:10, после чего вводят 5% раствор карбоксиметилцеллюлозы в соотношении 1:5 и 10% раствор желатины в соотношении 1:5 и перемешивают в течение 30 мин. После этого массу выливают в формы и высушивают при температуре 20-22°С. Через 12 ч образовавшуюся пленку снимают, нарезают лентами необходимого размера и досушивают в термостате при температуре 50-55°С. Выход готового продукта (пленки) составляет 96-97.5% от массы исходных компонентов.
Выявленные отличительные признаки позволяют сделать вывод о соответствии предлагаемого технологического решения критерию "новизна".
Предложенный способ позволяет получить прозрачную пленку желто-коричневого цвета с кисло-горьким вкусом и специфическим приятным запахом. Потеря массы при высушивании - 10-12%.
Способ иллюстрируется нижеследующими примерами.
Пример 1. 1 кг листьев какалии копьевидной измельчают на мельнице до размера частиц диаметром (сито №50 ГОСТ 214-83). Измельченное сырье загружают в экстракционный аппарат с мешалкой и внешним паровым обогревателем и заливают 16 л 70% этанола. Экстрагируют при температуре 96-98°С и периодическом помешивании в течение 1.5 ч. Извлечение фильтруют в сборник. Проводят еще две экстракции в тех же условиях, подавая в экстрактор 70% этанол в количестве, равном объему слитого. Первый слив - 13.8 л, второй - 12.9 л, третий - 12.7 л. Объединенные спиртовые извлечения упаривают примерно до 1/30 первоначального объема, подвергают очистке сепарированием и сушат на нержавеющих противнях в вакуумной сушилке при температуре 60°С в течение 8 часов и измельчают на мельнице пропеллерного типа. Получают 0.295 кг готового продукта, что составляет 29.5% экстрактивных веществ от массы исходного сырья. Сухой экстракт представляет собой рассыпчатый аморфный негигроскопичный порошок коричневого цвета с горько-кислым вяжущим вкусом и приятным специфическим запахом. Потеря массы при высушивании составляет 7.85%.
0.100 кг сухого экстракта растирают в ступке с 0.400 кг смеси Твин 80-диметилсульфоксид-глицерин (1:1:10) при температуре 20-22°С в течение 20-30 мин до однородной массы темно-коричневого цвета. После этого в смесь вводят 1 л 5% раствора карбоксиметилцеллюлозы, перемешивают и приливают 4.5 л 10% раствора желатины, нагретого до температуры 40°С. Полученную смесь перемешивают в течение 30 мин, не допуская образования в пленочной массе пузырьков воздуха. Полученную пленочную массу выливают в заливочные формы слоем толщиной 3.00±0.25 мм и высушивают на воздухе при температуре 20-22°С. Через 12 ч образовавшуюся пленку снимают, нарезают лентами необходимого размера и досушивают в термостате при температуре 50-55°С до значения остаточной влажности 10-12%.
Получают 0.975 кг готового продукта, что составляет 97.5% от массы исходных компонентов. Пленка представляет собой полимерный продукт желто-коричневого цвета; 1% водный раствор пленки кисло-горького вкуса со специфическим приятным запахом. Потеря массы при высушивании пленки - 10.52%.
Пример 2. 1 кг листьев какалии копьевидной измельчают на мельнице до размера частиц диаметром (сито №50 ГОСТ 214-83). Измельченное сырье загружают в экстракционный аппарат с мешалкой и внешним паровым обогревателем и заливают 17 л 70% этанола. Экстрагируют при температуре 96-98°С и периодическом помешивании в течение 1.5 ч. Извлечение фильтруют в сборник. Проводят еще две экстракции в тех же условиях, подавая в экстрактор 70% этанол в количестве, равном объему слитого. Первый слив - 14.5 л, второй - 14.0 л, третий - 13.9 л. Объединенные спиртовые извлечения упаривают примерно до 1/30 первоначального объема, подвергают очистке сепарированием и сушат на нержавеющих противнях в вакуумной сушилке при температуре 60°С в течение 8 часов и измельчают на мельнице пропеллерного типа. Получают 0.327 кг готового продукта, что составляет 32.7% экстрактивных веществ от массы исходного сырья. Сухой экстракт представляет собой рассыпчатый аморфный негигроскопичный порошок коричневого цвета с горько-кислым вяжущим вкусом и приятным специфическим запахом. Потеря массы при высушивании составляет 8.04%.
0.100 кг сухого экстракта растирают в ступке с 0.450 кг смеси Твин 80-диметилсульфоксид-глицерин (1:1:10) при температуре 20-22°С в течение 20-30 мин до однородной массы темно-коричневого цвета. После этого в смесь вводят 1.5 л 5% раствора карбоксиметилцеллюлозы, перемешивают и приливают 5.0 л 10% раствора желатины, нагретого до температуры 40°С. Полученную смесь перемешивают в течение 30 мин, не допуская образования в пленочной массе пузырьков воздуха. Полученную пленочную массу выливают в заливочные формы слоем толщиной 3.00±0.25 мм и высушивают на воздухе при температуре 20-22°С. Через 12 ч образовавшуюся пленку снимают, нарезают лентами необходимого размера и досушивают в термостате при температуре 50-55°С до значения остаточной влажности 10-12%.
Получают 1.085 кг готового продукта, что составляет 96.4% от массы исходных компонентов. Пленка представляет собой полимерный продукт желто-коричневого цвета; 1% водный раствор пленки кисло-горького вкуса со специфическим приятным запахом. Потеря массы при высушивании пленки - 9.38%.
Пример 3. 1 кг листьев какалии копьевидной измельчают на мельнице до размера частиц диаметром (сито №50 ГОСТ 214-83). Измельченное сырье загружают в экстракционный аппарат с мешалкой и внешним паровым обогревателем и заливают 18 л 70% этанола. Экстрагируют при температуре 96-98°С и периодическом помешивании в течение 1.5 ч. Извлечение фильтруют в сборник. Проводят еще две экстракции в тех же условиях, подавая в экстрактор 70% этанол в количестве, равном объему слитого. Первый слив - 16.7 л, второй - 16.2 л, третий - 16.1 л. Объединенные спиртовые извлечения упаривают примерно до 1/30 первоначального объема, подвергают очистке сепарированием и сушат на нержавеющих противнях в вакуумной сушилке при температуре 60°С в течение 8 часов и измельчают на мельнице пропеллерного типа. Получают 0.315 кг готового продукта, что составляет 31.5% экстрактивных веществ от массы исходного сырья. Сухой экстракт представляет собой рассыпчатый аморфный негигроскопичный порошок коричневого цвета с горько-кислым вяжущим вкусом и приятным специфическим запахом. Потеря массы при высушивании составляет 8.15%.
0.100 кг сухого экстракта растирают в ступке с 0.350 кг смеси Твин 80-диметилсульфоксид-глицерин (1:1:10) при температуре 20-22°С в течение 20-30 мин до однородной массы темно-коричневого цвета. После этого в смесь вводят 1 л 5% раствора карбоксиметилцеллюлозы, перемешивают и приливают 5.0 л 10% раствора желатины, нагретого до температуры 40°С. Полученную смесь перемешивают в течение 30 мин, не допуская образования в пленочной массе пузырьков воздуха. Полученную пленочную массу выливают в заливочные формы слоем толщиной 3.00±0.25 мм и высушивают на воздухе при температуре 20-22°С. Через 12 ч образовавшуюся пленку снимают, нарезают лентами необходимого размера и досушивают в термостате при температуре 50-55°С до значения остаточной влажности 10-12%.
Получают 0.960 кг готового продукта, что составляет 96.0% от массы исходных компонентов. Пленка представляет собой полимерный продукт желто-коричневого цвета; 1% водный раствор пленки кисло-горького вкуса со специфическим приятным запахом. Потеря массы при высушивании пленки - 9.33%.
Разработка состава полимерной основы стоматологической пленки.
В эксперименте по определению оптимального состава полимерной основы стоматологической пленки изучались свойства 14 композиций, в состав которых входили желатина, агар и карбоксиметилцеллюлоза (КМЦ) в различных соотношениях. В качестве сопутствующих веществ для улучшения ряда показателей (адгезия, растворимость, внешний вид) использовались диметилсульфоксид, Твин 80, глицерин.
В таблице 1 приведены составы полимерных основ.
В таблице 2 описаны основные контрольные характеристики пленок, на основании которых происходил выбор оптимальной.
В результате проведенных исследований установлено, что по совокупности свойств наиболее оптимальными параметрами обладает полимерная композиция №3, которая была использована при разработке стоматологической пленки.
| Таблица 1 Составы полимерных основ, массовые части |
|||||||
| № | Желатина 10% р-р | КМЦ 5% р-р | Агар 5% р-р | Диметил сульфоксид |
Твин 80 20% р-р |
Глицерин | Этанол 40% р-р |
| 1 | 50 | 50 | - | 0.20 | - | 2.30 | 17.50 |
| 2 | 70 | 30 | - | 0.20 | - | 2.30 | 17.50 |
| 3 | 100 | 20 | - | 0.25 | 0.25 | 2.50 | - |
| 4 | 100 | - | - | 0.25 | 0.25 | 2.50 | 5.00 |
| 5 | 50 | 50 | - | 0.25 | - | 3.00 | - |
| 6 | 100 | - | - | 0.20 | - | 2.30 | 17.50 |
| 7 | 50 | - | 50 | 0.20 | - | 2.30 | 17.50 |
| 8 | 50 | 20 | 50 | 0.20 | - | 2.30 | - |
| 9 | - | 20 | 80 | 0.25 | 0.25 | 2.50 | 2.00 |
| 10 | 10 | 90 | - | 0.25 | 0.25 | 2.50 | - |
| 11 | 80 | - | - | 0.50 | - | 2.50 | 17.00 |
| 12 | 80 | - | - | 0.20 | - | 4.00 | 20.00 |
| 13 | 80 | - | - | - | 0.20 | 2.30 | 17.50 |
| 14 | 100 | - | - | - | 2.50 | 2.50 | - |
| Таблица 2 Результаты определения качества полимерных основ |
||||||
| № | ВВ | Сн | Эл | Ад | tSol | X |
| 1 | 1 | 1 | 1 | 3 | 1 (1-2) | 7 |
| 2 | 1 | 1 | 1 | 3 | 1 (1-2) | 7 |
| 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 (10-15) | 15 |
| 4 | 3 | 3 | 1 | 1 | 3 (10-15) | 11 |
| 5 | 1 | 1 | 1 | 3 | 1 (1-2) | 7 |
| 6 | 3 | 1 | 1 | 1 | 3 (10-15) | 9 |
| 7 | 3 | 2 | 2 | 1 | 2 (5-6) | 10 |
| 8 | 1 | 2 | 2 | 1 | 2 (5-6) | 8 |
| 9 | 3 | 3 | 2 | 1 | 2 (5-6) | 11 |
| 10 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 (1-2) | 5 |
| 11 | 3 | 1 | 2 | 1 | 2 (5-6) | 9 |
| 12 | 3 | 2 | 1 | 2 | 1 (1-2) | 9 |
| 13 | 2 | 3 | 1 | 2 | 1 (1-2) | 9 |
| 14 | 2 | 3 | 1 | 1 | 1 (1-2) | 8 |
| Примечания: *ВВ - внешний вид, баллов; Сн - снятие с заливочной формы, баллов; Эл - эластичность, баллов; Ад - адгезия к десне, баллов; tSol - время растворения в физиологическом растворе, баллов (мин); Х - относительная оценка качества, баллов. |
Химический состав стоматологической пленки.
Проведенный химический анализ стоматологической пленки выявил наличие фенольных кислот и флавоноидов.
ВЭЖХ. Условия: жидкостный хроматограф «Милихром А-02» на колонке (l=75 мм, ⌀ 2 мм), упакованной сорбентом Nucleosil, 100-5, С18, с эффективностью равной 5000 т.т. по пику хризена (k'=10). Вещества определяли в градиентном режиме элюирования: градиент элюента В от 15% до 70% за 23.3 мин, при расходе элюентов 0.2 мл/мин. Элюент А - смесь водного раствора фосфата калия (КН2РO4, 0.05 М, рН=3.0) и ацетонитрила при соотношении раствор фосфата калия: ацетонитрил 95:5 (об/об). Элюируемые вещества детектировали при 218, 236, 260 и 274 нм одновременно. Температура колонки 40°С. Количественное определение проводили методом внешнего стандарта. В качестве внешних стандартов использовали растворы индивидуальных соединений с известной концентрацией. Чистота соединений по данным ВЭЖХ составляла не менее 95%. Суммарная погрешность измерений не превышала 5%.
Около 1 г (точная навеска) пленки помещают в колбу со шлифом вместимостью 100 мл, приливают 10 мл воды очищенной, присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане в течение 15 мин. После охлаждения к содержимому колбы приливают 50 мл 95% спирта этилового, присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане в течение 15 мин. После охлаждения содержимое колбы фильтруют в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводят объем раствора до метки 50% спиртом этиловым.
В составе стоматологической пленки обнаружено присутствие 9 ароматических кислот, из которых идентифицированы галловая, ванилиновая, сиреневая, коричная, кофейная, феруловая и хлорогеновая кислоты. Доминирующими соединениями являются хлорогеновая и кофейная кислоты. Общее содержание фенольных кислот в стоматологической пленке составляет 1.15-1.27%. Также обнаружено присутствие флавоноидов кверцетина и кемпферола, причем их содержание составляет 0.07 и 0.02% соответственно.
Метод контроля качества стоматологической пленки.
Разработана методика количественного определения суммарного содержания фенолокислот (в пересчете на хлорогеновую кислоту) с применением спектрофотометрического метода.
Около 1 г (точная навеска) стоматологической пленки помещают в колбу со шлифом вместимостью 100 мл, приливают 10 мл воды очищенной, присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане в течение 15 мин. После охлаждения к содержимому колбы приливают 50 мл 95% спирта этилового, присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане в течение 15 мин. После охлаждения содержимое колбы фильтруют в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводят объем раствора до метки 50% спиртом этиловым (раствор А).
2 мл раствора А переносят в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводят объем раствора до метки 50% спиртом этиловым (раствор Б).
Оптическую плотность раствора Б измеряют при длине волны 330 нм. В качестве раствора сравнения используют 50% спирт этиловый. Суммарное содержание фенолокислот в пересчете на хлорогеновую кислоту в пленке в процентах (X) вычисляют по формуле
где D - оптическая плотность исследуемого раствора; КV - коэффициент разбавления исследуемого раствора (1250); 531 - удельный коэффициент погашения хлорогеновой кислоты в 50% спирте этиловом при длине волны 330 нм; m - масса пленки, г; W - потеря в массе при высушивании пленки, %.
Количественная оценка велась по содержанию фенолокислот (в пересчете на хлорогеновую кислоту). В таблице 3 приведены результаты метрологического анализа полученных результатов, проведенных для трех партий стоматологической пленки.
| Таблица 3 Метрологические характеристики результатов количественного анализа партий стоматологической пленки |
||||||
| Партия пленки |
|
S2 | Sx | t(p,f) |
|
E |
| 071107 | 0.151 | 3.53·10-5 | 1.79·10-3 | 2.23 | 0.004 | 2.65 |
| 241107 | 0.142 | 2.01·10-5 | 1.35·10-3 | 2.23 | 0.003 | 2.11 |
| 150508 | 0.170 | 5.53·10-5 | 2.24·10-3 | 2.23 | 0.005 | 2.94 |
В ходе исследований установлено, что содержание фенолокислот в пересчете на хлорогеновую кислоту в стоматологической пленке может составлять 0.14-0.17%, поэтому в качестве нижнего показателя содержания установлена величина не менее 0.10%.
Рассчитать экономическую целесообразность предлагаемого способа в настоящее время не представляется возможным, однако вышеуказанные преимущества в сочетании с простой схемой получения способствуют рациональному использованию лекарственного растительного сырья и определяют перспективность внедрения данного способа в фармацевтическую промышленность.
Фармакотерапевтические свойства стоматологической пленки.
Фармакотерапевтическая эффективность стоматологической пленки при повреждении тканей пародонта у белых крыс с помощью наложения шелковой лигатуры в зубодесневую борозду. Исследования произведены на 84 белых крысах линии Wistar обоего пола массой 160-180 г. Повреждение пародонта у животных вызывали путем наложения шелковой лигатуры в зубодесневую борозду [1]. Стоматологическую пленку накладывали на десну ежедневно, с фиксацией ее в течение 5 минут. Животным контрольной группы накладывали пленку, не содержащую растительное средство по аналогичной схеме. В качестве препарата сравнения использовали 3% раствор настойки календулы лекарственной, которым орошали полость рта животных по аналогичной схеме. Исследования проводили на 3, 7 и 14 сутки с начала эксперимента. Для объективной оценки состояния пародонта определяли гигиенический статус ротовой полости животных по методу Грина-Вермильона и интенсивность кровоточивости - по методу Мюллемана [4]. Для гистологического исследования материал фиксировали в 10% нейтральном формалине с последующей декальцинацией в 7% азотной кислоте. Полученные на санном микротоме срезы окрашивали гематоксилин эозином [7]. Для оценки влияния стоматологической пленки на состояние перекисного окисления липидов в крови определяли содержание малонового диальдегида (МДА) общепринятым методом [2] и диеновых конъюгатов (ДК) - спектрофотометрическим методом [3]. Для оценки влияния фитопленки на состояние антиоксидантной системы организма при повреждении тканей пародонта активность каталазы в сыворотке крови исследовали по методу М.А.Королюк [5] супероксиддисмутазы (СОД) в плазме крови - по методу С.Чевари [9] и содержание восстановленного глутатиона в крови - по методу Т.Anderson [10]. Значимость различий между указанными параметрами среди экспериментальных групп оценивали с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни. Различия считались существенными при Р≤0,05 [8].
Результаты исследований показали, что у животных контрольной группы на 3 сутки исследования наблюдались отек десны, гиперемия, накопление остатков пищи в области фиксации лигатуры, фибринозный налет. Гигиенический индекс и интенсивность кровоточивости составлял 1,6 и 1,8 балла соответственно. Морфологические исследования показали, что у животных контрольной группы в десне выявлялись дистрофические изменения эпителия, отек и воспалительная инфильтрация подэпителиальной соединительно-тканной стромы. На 7 сутки исследования у животных отмечались выраженный отек десны, ее гиперемия и интенсивный фибринозный налет. Гигиенический индекс и интенсивность кровоточивости составляли 2,3 и 2,0 балла соответственно. При микроскопическом исследовании в десне крыс наблюдались отек, нарушения со стороны микроциркуляторного русла: сосуды были полнокровны, в части из них определялись сладж-комплексы. Воспалительные инфильтраты выявлялись в более глубоких участках пародонта, на уровне периодонта. На 14 сутки исследования десна животных контрольной группы выглядела цианотичной, индекс кровоточивости составлял 2,5 балла. В периодонтальной ткани определялась выраженная реакция со стороны сосудов микроциркуляторного русла в виде их полнокровия, стромального отека и очагов лимфостаза. Отмечалась локальная клеточная инфильтрация в соединительнотканной строме десны. У большинства животных наблюдались разрушение эпителиального покрова слизистой оболочки десны и углубление зубодесневой борозды.
При аппликации стоматологической пленки на десну крыс было установлено, что на 3, 7 и 14 сутки опыта гигиенический статус тканей пародонта был значительно ниже такового у животных контрольной группы и составлял соответственно 0,7; 1,0 и 2,0 балла. У животных опытной группы процессы воспаления в десне были менее выражены, о чем свидетельствовало снижение степени кровоточивости по сравнению с таковой у крыс контрольной группы на 20, 25 и 16% соответственно. Микроскопическое исследование тканей пародонта животных опытной группы показало, что на 3 и 7 сутки эксперимента наблюдались характерные для гингивита морфологические признаки: отек и воспалительная инфильтрация подэпителиальной соединительнотканной стромы десны и нарушения со стороны микроциркуляции. На 14 сутки наблюдения в ткани периодонта животных опытной группы сохранялись клеточная инфильтрация, расстройства кровообращения, признаки мезенхимальной дистрофии в виде набухания и деструкции волокнистых структур соединительной ткани. Не отмечалось повреждение эпителиального покрова слизистой оболочки десны. Наряду с этим в инфильтратах выявлялись проявления активного новообразования капилляров, что свидетельствует о репаративных процессах в десне. Результаты макро- и микроскопических исследований показали, что во все исследуемые сроки фармакотерапевтическая эффективность стоматологической пленки не уступает, а в большинстве случаев превосходит таковую препарата сравнения - настойки календулы лекарственной.
На 3, 7 и 14 сутки опыта у животных контрольной группы наблюдалась активация процессов перекисного окисления липидов: содержание МДА увеличивалось 1,9; 3,3 и 4,0 раза, концентрация ДК - в 1,4; 2,4 и 3,4 раза соответственно по сравнению с таковыми показателями у животных интактной группы. Интенсификация процессов перекисного окисления липидов сопровождалась снижением активности антиоксидантных ферментов: каталазы и СОД, содержания восстановленного глутатиона по сравнению с таковыми у животных интактной группы во все сроки наблюдения (табл.4). Применение стоматологической пленки у животных на фоне повреждения тканей пародонта, вызывало ингибирование процессов перекисного окисления липидов и повышение антиоксидантного статуса организма. Так, у животных опытной группы, на 3, 7 и 14 сутки опыта содержание МДА снижалось на 28, 32 и 24%, а концентрация ДК - на 24, 38 и 30% соответственно и активность каталазы повышалась в 1,2; 1,6 и 1,9 раза, СОД - в 1,4; 1,5 и 1,4 раза и содержание восстановленного глутатиона - на 10, 23 и 28% соответственно по сравнению с таковыми у животных контрольной группы.
Таким образом, при аппликации на десну стоматологической пленки наблюдаются менее выраженные структурные изменения в тканях пародонта и отмечается появление репаративных процессов, что обусловлено способностью исследуемого средства ингибировать процессы перекисного окисления липидов и активировать антиоксидантную систему при повреждении тканей пародонта.
Фармакотерапевтическая эффективность стоматологической пленки при повреждении тканей пародонта, вызванных хронической иммобилизацией белых крыс. Исследования проведены на 40 белых крысах линии Wistar обоего пола с исходной массой тела 160-180 г. Хронический иммобилизационный стресс у белых крыс вызывали ежедневным помещением голодных животных в тесные домики на 6 часов в течение 12 дней. Животным первой опытной группы ежедневно перед иммобилизацией накладывали на десну стоматологическую пленку. В качестве препарата сравнения использовали настойку календулы лекарственной в виде 3% раствора, которым орошали полость рта животных второй опытной группы, крысам контрольной группы накладывали пленку, не содержащую растительный экстракт, по аналогичной схеме.
Исследования проводили на 12 сутки с начала эксперимента. Влияние хронического стресса на состояние пародонта оценивали по клинической картине и гистологическим исследованиям. Для гистологического исследования нижнюю челюсть крыс фиксировали в 10% нейтральном формалине с последующей декальцинацией в 7% азотной кислоте. Полученные на санном микротоме срезы окрашивали гематоксилин-эозином и по Ван Гизону [7]. Показатели периферической крови определяли на автоматическом гематологическом анализаторе «Абакус» со стандартным набором реактивов (Австрия). Реакцию перекисного окисления липидов при хроническом стрессе определяли по содержанию в крови животных малонового диальдегида (МДА) [2] и диеновых коньюгатов (ДК) [3].
| Таблица 4 Влияние стоматологической пленки на показатели перекисного окисления липидов и антиоксидантной системы организма при повреждении тканей пародонта у белых крыс |
||||
| Показатели | Группы животных | |||
| Интактная | Контрольная | Стоматологическая пленка | 3% Р-р настойки календулы лекарственной | |
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| 3 сутки | ||||
| МДА, нмоль/г | 0,90±0,01 | 1,68±0,05* | 1,21±0,09** | 1,33±0,56 |
| ДК, ед.оп. | 1,50±0,03 | 2,09±0,09* | 1,58±0,07** | 1,80±0,42 |
| Каталаза, мкат/л | 12,50±0,38 | 7,13±0,15* | 8,50±0,04** | 8,80±0,19** |
| СОД, мкмоль/мл | 26,2±1,16 | 12,25±1,09* | 16,68±0,78** | 16,25±0,86** |
| Восстановленный глутатион, мкмоль/мл | 627,3±11,2 | 471,7±23,4* | 502,3±45,7 | 486,9±29,6 |
| 7 сутки | ||||
| МДА, нмоль/г | 0,90±0,01 | 2,94±0,11* | 2,01±0,08** | 2,28±0,12** |
| ДК, ед. оп. | 1,50±0,03 | 3,62±0,45* | 2,23±0,10** | 2,59+0,12** |
| Каталаза, мкат/л | 12,50±0,38 | 3,6±0,19* | 5,7±0,12** | 5,3±0,13** |
| СОД, мкмоль/мл | 26,2±1,16 | 8,74±0,32* | 13,26±1,01** | 10,41±0,97 |
| Восстановленный глутатион, мкмоль/мл | 627,3±11,2 | 346,32±12,9* | 427,13±21,9** | 392,94±27,9 |
| 14 сутки | ||||
| МДА, нмоль/г | 0,90±0,01 | 3,68±0,34* | 2,79±0,12** | 3,12±0,34 |
| ДК, ед. оп. | 1,50±0,03 | 5,12±0,12* | 3,58±0,23** | 3,83±0,19** |
| Каталаза, мкат/л | 12,50±0,38 | 1,30±0,09* | 2,40±0,12** | 1,90±0,14** |
| СОД, мкмоль/мл | 26,2±1,16 | 6,7410,34* | 9,63±0,47** | 8,24±0,45** |
| Восстановленный глутатион, мкмоль/мл | 627,3±11,2 | 252,7±10,9* | 323,7±12,4** | 312,7±21,2** |
| Примечание. * - различия достоверны по сравнению с показателями у животных интактной группы при Р<0,05; ** - различия достоверны по сравнению с показателями у животных контрольной группы при Р<0,05. |
Состояние антиоксидантной системы организма при повреждении пародонта оценивали по активности каталазы в сыворотке крови [5], супероксид-дисмутазы (СОД) в плазме крови [9] и содержанию восстановленного глутатиона в крови [10]. Значимость различий между указанными параметрами среди экспериментальных групп оценивали с помощью непараметрического критерия Манна - Уитни. Различия считались существенными при Р≤0,05 [8].
Результаты исследований показали, что 12-дневная иммобилизация вызывала у животных контрольной группы выраженные признаки катарального гингивита: отек слизистой на протяжении всего пародонта, гиперемия десны с ярко выраженным сосудистым рисунком, визуально выявлялся зубной налет. Кровоточивость десен наблюдалась только при легком зондировании. У животных первой опытной группы признаки клинического воспаления десны были менее выражены по сравнению с контролем, так наблюдались небольшие изменения в цвете десны, отек слизистой выявлялся только в области маргинального пародонта, сосудистый рисунок у большинства животных был слабо выражен. У животных второй опытной группы отек слизистой определялся в области маргинального пародонта и межзубного сосочка, отмечался умеренный сосудистый рисунок.
Патоморфологические исследования показали, что у животных контрольной группы в десне выявлялись дистрофические изменения эпителия, отек и воспалительная инфильтрация подэпителиальной соединительнотканной стромы, нарушения со стороны микроциркуляторного русла: сосуды полнокровны, в части из них определялись сладж-комплексы. Микроскопическое исследование тканей пародонта животных опытных групп показало, что на 12 сутки эксперимента наблюдались характерные для гингивита морфологические признаки: отек и воспалительная инфильтрация подэпителиальной соединительнотканной стромы десны и нарушения со стороны микроциркуляции. При этом у 30% животных получавших аппликацию фитопленки воспалительный инфильтрат под эпителиальным подкреплением отсутствовал.
Исследования периферической крови показали, что у животных контрольной группы наблюдалась анемия (табл.5). О выраженности воспалительного процесса свидетельствовало повышение количества лейкоцитов по сравнению с таковыми показателями у животных интактной группы. У животных опытных групп наблюдалась менее выраженная анемия по сравнению с данными у животных контрольной группы. Снижение СОЭ и лейкоцитоза свидетельствовало о менее выраженном воспалительном процессе при применении исследуемых средств.
| Таблица 5 Влияние стоматологической пленки на показатели периферической крови белых крыс при хроническом иммобилизационном стрессе |
||||
| Показатели | Группы животных | |||
| Интактная | Контрольная (стресс) | Опытная 1 (стоматологическая пленка) | Опытная 2 (3% раствор настойки календулы) | |
| Гемоглобин, г/л | 130,4±0,97 | 110,1±0,81* | 126,6±2,05** | 113,8±1,41 |
| Лейкоциты, ×109/л | 3,8±0,18 | 6,7±0,51* | 4,5±0,39** | 4,8±0,42 |
| СОЭ, мм/час | 1,3±0,11 | 1,8±0,08 | 1,4±0,09** | 1,4±0,13 |
| Примечание. Различия существенны по сравнению с показателями у животных: * - интактной группы; ** - контрольной группы. |
| Таблица 6 Влияние стоматологической пленки на показатели перекисного окисления липидов и антиоксидантной системы организма при хроническом стрессе у белых крыс |
||||
| Показатели | Группы животных | |||
| Интактная | Контрольная (стресс) | Опытная 1 (стоматологическая пленка) | Опытная 2 (3% раствор настойки календулы) | |
| МДА, нмоль/г | 0,9±0,01 | 2,72±0,15* | 2,24±0,18 | 2,46±0,16 |
| ДК, ед.оп. | 1,5±0,03 | 4,4±0,34* | 2,8±0,34** | 4,1±0,58 |
| Каталаза, мкат/л | 12,5±0,38 | 8,3±0,45* | 10,7±0,73** | 7,9±1,33 |
| СОД, мкмоль/мл | 26,2±1,16 | 16,3±1,59* | 20,9±1,34** | 17,05±1,11 |
| Восстановленный глутатион, мкмоль/мл | 627,3±11,2 | 433,2±29,42* | 461,6±19,22 | 387,6+25,74 |
| Примечание. Различия существенны по сравнению с показателями у животных: * - интактной группы; ** - контрольной группы. |
Установлено, что хронический иммобилизационный стресс сопровождается индукцией ПОЛ и угнетением антиокислительной системы организма (табл.6). Так, у животных контрольной группы концентрация МДА и ДК в сыворотке крови повышалась в 3,0 и 2,9 раза, активность каталазы и СОД, а также содержание восстановленного глутатиона снижались на 34, 38 и 31% соответственно по сравнению с таковыми показателями у животных интактной группы. Более выраженное стресспротекторное действие фитопленки по сравнению с настойкой календулы лекарственной обусловлено его выраженным антиоксидантным действием. Представленные в таблице 2 результаты показывают, что аппликация на десну крыс стоматологической пленки на фоне иммобилизационного стресса снижают в сыворотке крови концентрацию ДК в 1,6 раз и повышают активность каталазы и СОД в среднем на 28% по сравнению с таковыми показателями у животных контрольной группы (табл.6).
Таким образом, хронический иммобилизационный стресс вызывает патологические изменения во внутренних органах и выраженные воспалительные изменения в пародонте на фоне активации перекисного окисления липидов и снижения эндогенной антиоксидантной системы организма. Курсовое введение ЭКК и аппликация на десну стоматологической пленки оказывают стресспротекторное действие, улучшая состояние микроциркуляции, устраняя отечность и усиливая трофику в тканях пародонта за счет ингибирования ПОЛ и активации антиоксидантной системы организма.
Источники информации
1. Воложин А.И., Виноградова С.И, Патогенез экспериментального пародонтита у кроликов // Стоматология. - 1991. - №4. - С.10-12.
2. Владимиров Ю.А., Арчаков А.И. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. М., 1972. 115 с.
3. Гаврилов В.Б., Мишкорудная М.И. Спектрофотометрическое определение содержания гидроперекисей липидов в плазме крови // Лаб. дело. - 1983. - №3. - С.33-35.
4. Григорян А.С., Грудянов А.И., Рабухина Н.А., Фролова О.А. Болезни пародонта. М., 2004. 288 с.
5. Королюк М.А., Иванова Л.И., Майорова И.Г., Токарев В.Е. Методы определения активности каталазы // Лаб. дело. - 1998. - №6. - С.16-19.
6. Мизина П.Г., Куркин В.А. Лекарственные фитопленки с фенилпропаноидами как лечебно-профилактические средства // Химия и компьютерное моделирование. Бутлеровские сообщения. - 2003. - №1. - С.229-236. - прототип.
7. Микроскопическая техника: Руководство / Под ред. Д.С.Саркисова, Ю.Л.Перова. М.: Медицина, 1996. 544 с.
8. Сергиенко В.И., Бондарева И.Б. Математическая статистика в клинических исследованиях. М., 2001. 256 с.
9. Чевари С., Чаба И., Секей Й. Роль супероксиддисмутазы в окислительных процессах клетки и метод определения ее в биологических материалах // Лаб. дело. - 1985. - №11. - С.678-681.
10. Anderson Т.Omeprazole drug interaction studies // Clin. Pharmacokinet. - 1991. - Vol.21. - №38. - P.1603.
Способ получения пленки, обладающей противовоспалительной активностью, путем экстрагирования этанолом, упаривания, сушки, получения пленочной массы, заливки и сушки, отличающийся тем, что предварительно измельченное сухое растительное сырье - листья какалии копьевидной - трижды экстрагируют в течение 1,5 ч каждый раз при 96-98°С 70%-ным этанолом при соотношении сырье: экстрагент (1:16-18) с последующим объединением экстрактов, отгоном этанола, упариванием и сушкой полупродукта в вакуум-сушильном аппарате, растиранием полупродукта со смесью Твин 80-диметилсульфоксид-глицерин в соотношении 1:1:10, и далее с 5%-ным раствором карбоксиметилцеллюлозы в соотношении 1:5 и 10%-ным раствором желатины в соотношении 1:5, заливанием в формы и сушкой 20-22°С.
