Способ определения цитохромоксидазной активности у бактерий

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для идентификации бактерий. Способ предусматривает приготовление инокулюма бактерий. В свежеприготовленный инокулюм бактерий вносят 0,05%-ный раствор индофенола и инкубируют при температуре 35-37°С в течение 4 часов. При этом инокулюм с цитохромоксидазоотрицательными бактериями обесцвечивается, а инокулюм с цитохромоксидазоположительными бактериями сохраняет синее окрашивание. Изобретение позволяет упростить способ определения цитохромоксидазной активности.

 

Изобретение относится к области медицины, а конкретнее к области микробиологии, и касается методов определения цитохромоксидазной активности у бактерий с целью их видовой идентификации.

Определение цитохромоксидазной активности у микроорганизмов является одним из первых этапов биохимической идентификации и от ее верного определения зависит выбор дальнейших методов.

Известен способ определения цитохромоксидазной активности с помощью реактива Ковача (тетраметил-n-фенилендиамина гидрохлорид) [1].

Недостатком данного способа является использование легко окисляемого реактива, раствор которого необходимо готовить непосредственно перед использованием. Для проведения реакции необходимо использовать петлю из инертных металлов или пластика. Вариабельные результаты при определении цитохромоксидазной активности у некоторых грамотрицательных неферментирующих бактерий. Невозможность определения цитохромоксидазной активности у бактерий, выросших на кровяном агаре.

Известен способ определения цитохромоксидазной активности с помощью реактива Gaby, Hadley (α-Нафтол, N₁N-диметил n-фенилендиамин) [2, 3].

Недостатком данного способа является необходимость приготовления рабочего раствора непосредственно перед использованием. Для проведения реакции необходимо использовать петлю из инертных металлов или пластика, α-нафтол является слаботоксичным веществом с раздражающим действием на кожу и слизистые. Невозможность определения оксидазной активности у бактерий, выросших на кровяном агаре.

Целью создания изобретения является повышение качества определения цитохромоксидазной активности у бактерий с использованием доступных реактивов, не требующих приготовления непосредственно перед использованием.

Эта цель достигается тем, что при внесении в свежеприготовленный инокулюм бактерий 0,05%-ного раствора индофенола, инкубации при температуре 35-37 С° в течение 4 часов, инокулюм с цитохромоксидазоотрицательными бактериями обесцвечивается, а инокулюм с цитохромокидазоположительными бактериями сохраняет синее окрашивание.

Сравнение предлагаемого метода с другими, известными в области микробиологии, показало его соответствие критериям изобретения. Предлагаемый способ реализуется следующим образом.

В приготовленный инокулюм бактерий в сахарном бульоне объемом 1 мл (желтоватая опалесцирующая жидкость) вносится 0,5 мл 0,05%-ного раствора индофенола, при этом инокулюм приобретает синее окрашивание. После инкубации при температуре 35-37 С° в течение 4 часов инокулюм с оксидазоотрицательными микроорганизмами обесцвечивается. Процесс обесцвечивания обусловлен выделением в бульон оксидазоотрицательными микроорганизмами продуктов обмена по своей химической природе, являющихся восстановителями, в результате чего происходит восстановление индофенола из окрашенной формы в бесцветную лейкоформу.

Инокулюм с оксидазоположительными микроорганизмами сохраняет синее окрашивание по причине постоянного процесса окисления из-за переноса электронов по дыхательной цепи и системе цитохромоксидаз. Данное положение подтверждается опытом с блокированием системы цитохромоксидаз азидом натрия, инокулюм с индофенолом при этом обесцвечивается.

В заявленном способе используется инокулюм бактерий, который представляет собой взвесь чистой культуры микроорганизмов, выросшей на плотной питательной среде и суспензированной в сахарном бульоне до стандартного показателя мутности (0,5 ед. по МакФарленду). Инокулюм готовили в соответствии с Методическими указаниями МУК 4.2.1890-04 «Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам». В методах с реактивами Ковача и Gaby, Hadley вместо инокулюма используется бактериальная масса, внесенная в реактивы с помощью микробиологической петли.

Таким образом, цитохромоксидазная активность в заявленном методе определяется по изменению окраски (из синего в бесцветный) инокулюма с окидазоотрицательными бактериями. При этом инокулюм с оксидазоположительными бактериями сохраняет синее окрашивание. Метод не требует дорогостоящего оборудования и реактивов. Способ прост и доступен для применения как в бактериологических лабораториях крупных медицинских учреждений, так и в небольших бактериологических лабораториях.

ЛИТЕРАТУРА

1. Частная медицинская микробиология с техникой микробиологических исследований: Учебное пособие / Под ред. А.С.Лабинской, Л.П.Блинковой, А.С.Ещиной. - М.: ОАО Издательство «Медицина», 2005. - 600 с.

2. Определитель бактерий Берджи. В 2-х т.: Пер. с англ./ Под ред. Дж.Хоулта, Н.Крига, П.Снита, Дж.Стейли, С.Уильямса. - М.: Мир, 1997. - 432 с.

3. Определитель нетривиальных патогенных грамотрицательных бактерий (аэробных и факультативно анаэробных). Пер. с англ. - М.: Мир, 1999. - 791 с.

Способ определения цитохромоксидазной активности у бактерий, предусматривающий внесение в свежеприготовленный инокулюм бактерий 0,05%-ного раствора индофенола, инкубацию при температуре 35-37°С в течение 4 ч, при этом инокулюм с цитохромоксидазоотрицательными бактериями обесцвечивается, а инокулюм с цитохромоксидазоположительными бактериями сохраняет синее окрашивание.