Способ определения цитохромоксидазной активности у бактерий

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для видовой идентификации бактерий. Способ предусматривает приготовление инокулюма бактерий. В свежеприготовленный инокулюм бактерий вносят 0,02%-ный раствор пирокатехинового фиолетового и инкубируют при температуре 35-37С° в течение 4 часов. После инкубирования добавляют 10%-ный раствор аммиака. При этом инокулюм с оксидазоотрицательными бактериями сохраняет оранжевое окрашивание, а инокулюм с оксидазоположительными бактериями приобретает изумрудно-зеленое окрашивание. Изобретение позволяет упростить способ определения цитохромоксидазной активности.

 

Изобретение относится к области медицины, а конкретнее к области микробиологии и касается методов определения цитохромоксидазной активности у бактерий с целью их видовой идентификации.

Определение цитохромоксидазной активности у микроорганизмов является одним из первых этапов биохимической идентификации, и от ее верного определения зависит выбор дальнейших методов.

Известен способ определения цитохромоксидазной активности с помощью реактива Ковача (тетраметил-n-фенилендиамина гидрохлорид) [1, 2].

Недостатком данного способа является применение легко окисляемого реактива, раствор которого необходимо готовить непосредственно перед использованием. Для проведения реакции необходимо использовать петлю из инертных металлов или пластика. Вариабельные результаты при определении цитохромокеидазной активности у некоторых грамотрицательных неферментирующих бактерий. Невозможность определения цитохромоксидазной активности у бактерий, выросших на кровяном агаре.

Известен способ определения цитохромоксидазной активности с помощью реактива Gaby, Hadley (α-Нафтол, N₁N-диметил-n-фенилендиамин) [3].

Недостатком данного способа является необходимость приготовления рабочего раствора непосредственно перед использованием. Для проведения реакции необходимо использовать петлю из инертных металлов или пластика, α-нафтол является слаботоксичным веществом с раздражающим действием на кожу и слизистые. Невозможность определения цитохромоксидазной активности у бактерий, выросших на кровяном агаре.

Целью создания изобретения является повышение качества определения цитохромоксидазной активности у бактерий с использованием доступных реактивов, не требующих приготовления непосредственно перед использованием.

Эта цель достигается тем, что при внесении в свежеприготовленный инокулюм бактерий 0,02%-ного раствора пирокатехинового фиолетового, инкубации при температуре 35-37С° в течение 4 часов и добавлении 10% раствора аммиака инокулюм с цитохромоксидазоотрицательными бактериями сохраняет оранжевое окрашивание, а инокулюм с цитохромокидазоположительными приобретает изумрудно-зеленое окрашивание.

Цитохромоксидазная активность у бактерий в предлагаемом методе определяется с помощью окислительно-восстановительных биохимических реакций, вследствие более высокого сродства к электрону предлагаемого вещества - пирокатехинового фиолетового (ТУ 6-09-07-1087-78), чем у реактивов Ковача и Gaby, Hadley, с последующей реакцией нуклеофильного замещения с 10% раствором аммиака (ГОСТ 3760-79) для визуализации продуктов реакции первого этапа.

Сравнение предлагаемого метода с другими, известными в области микробиологии, показало его соответствие критериям изобретения.

Предлагаемый способ реализуется следующим образом.

В приготовленный инокулюм бактерий в сахарном бульоне объемом 1 мл (желтая опалесцирующая жидкость) вносится 0,5 мл 0,02% раствора пирокатехинового фиолетового, при этом инокулюм приобретает оранжевое окрашивание. После инкубации при температуре 35-37°С в течение 4 часов к инокулюму добавляют 0,5 мл 10% раствора аммиака. При этом инокулюм с оксидазоотрицательными микроорганизмами не изменяет цвет, что обусловлено выделением в бульон оксидазоотрицательными микроорганизмами продуктов обмена, по своей химической природе являющихся восстановителями, в результате чего не образуется окисленной формы пирокатехинового фиолетового и не происходит реакция с 10% раствором аммиака с образованием окрашенного соединения.

Инокулюм с оксидазоположительными микроорганизмами после инкубации при температуре 35-37°С в течение 4 часов и внесении 0,5 мл 10% раствора аммиака приобретал изумрудно-зеленое окрашивание, что обусловлено процессом постоянного окисления из-за переноса электронов по дыхательной цепи и системе цитохромоксидаз. При добавлении 10% раствора аммиака образовавшаяся форма пирокатехинового фиолетового вступала в реакцию нуклеофильного замещения с образованием окрашенного соединения.

В заявленном способе используется инокулюм бактерий, который представляет собой взвесь чистой культуры микроорганизмов, выросшей на плотной питательной среде и суспензированной в сахарном бульоне до стандартного показателя мутности (0,5 ед. по МакФарленду). Инокулюм готовили в соответствии с Методическими указаниями МУК 4.2.1890-04 «Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам». В методах с реактивами Ковача и Gaby, Hadley вместо инокулюма используется бактериальная масса, внесенная в реактивы с помощью микробиологической петли.

Метод не требует дорогостоящего оборудования и реактивов.

Таким образом, цитохромоксидазная активность в заявленном методе определяется по изменению окраски (из оранжевого в изумрудно-зеленый) инокулюма с оксидазоположительными бактериями. При этом инокулюм с оксидазоотрицательными бактериями сохраняет оранжевое окрашивание.

Способ прост и доступен для применения как в бактериологических лабораториях крупных медицинских учреждений, так и в небольших бактериологических лабораториях.

ЛИТЕРАТУРА

1. Частная медицинская микробиология с техникой микробиологических исследований: Учебное пособие / Под ред. А.С.Лабинской, Л.П.Блинковой, А.С.Ещиной. - М.: ОАО «Издательство «Медицина», 2005. - 600 с.

2. Определитель бактерий Берджи. В 2-х т.: Пер. с англ. / Под ред. Дж.Хоулта, Н.Крига, П.Снита, Дж.Стейли, С.Уильямса. - М.: Мир, 1997. - 432 с.

3. Определитель нетривиальных патогенных грамотрицательных бактерий (аэробных и факультативно анаэробных). Пер. с англ. - М.: Мир, 1999. - 791 с.

Способ определения цитохромоксидазной активности у бактерий, предусматривающий внесение в свежеприготовленный инокулюм бактерий 0,02%-ного раствора пирокатехинового фиолетового, инкубацию при температуре 35-37°С в течение 4 ч и добавление 10%-ного раствора аммиака, при этом инокулюм с цитохромоксидазоотрицательными бактериями сохраняет оранжевое окрашивание, а инокулюм с цитохромоксидазоположительными - приобретает изумрудно-зеленое окрашивание.