Способ превращения алоэрезина а в алоэзин

Изобретение относится к способу гидролитического превращения алоэрезина А в алоэзин экстракцией алоэзина из горькой настойки алоэ из растения алоэ и включает следующие стадии: гидролиз алоэрезина А в горькой настойке алоэ до алоэзина и п-кумаровой кислоты; и селективная экстракция из горькой настойки алоэ природного алоэзина и алоэзина, полученного из алоэрезина А. Доступное для экстракции из сока растений алоэ количество алоэзина таким образом увеличивается, и экстракция и очистка алоэзина также становится более легкой и менее дорогой. Поскольку алоэзин имеет большее коммерческое значение по сравнению с алоэрезином А, способ также увеличивает коммерческую ценность сока или горькой настойки алоэ из растения алоэ. Способ также необязательно включает отделение алоэзина от п-кумаровой кислоты. Типичными стадиями гидролиза, которые применяются в способе, являются кислотный гидролиз, гидролиз с помощью основания и ферментативный гидролиз. В случае кислотного гидролиза кислота представляет собой любую подходящую органическую или неорганическую кислоту, такую как соляная кислота, серная кислота, азотная кислота или фосфорная кислота. В случае ферментативного гидролиза гидролитический фермент обычно представляет собой эстеразу, липазу или протеазу. 29 з.п. ф-лы.

 

Уровень техники

Изобретение относится к способу превращения алоэрезина А в алоэзин.

Алоэ является суккулентным растением, которое, как известно, существует в более 300 видах, большинство из которых свойственно Африке. Продукты из алоэ применяются в традиционной медицине в течение столетий и, в частности, используются в дерматологии для лечения ожогов, ран и других повреждений. Современные данные терапевтических исследований включают противовоспалительную активность, противораковую активность, антикислотную активность, антидиабетическую активность, активность ингибирования тирозиназы и антиоксидантную активность. Продукты алоэ также широко применяются в косметическом производстве и производстве диетических пищевых продуктов, особенно в связи с недавним увеличением популярности натуральных продуктов.

Основным видом африканского алоэ, из которого получают составы для фармацевтического, терапевтического, дерматологического или косметического применения, является Aloe ferox, распространенный в Северной Африке вид. Другие виды алоэ также используются для подобных целей. Aloe vera широко применяется в США в продуктах по уходу за кожей, шампунях и оздоравливающих напитках. Однако было обнаружено, что A. ferox обладает некоторыми свойствами, превосходящими A.vera. Например, A. ferox имеет более высокое содержание кальция и общее содержание аминокислот по сравнению с A. vera. Рассеченный лист культивируемого растения A. ferox также выделяет приблизительно в 20 раз больше горького сока, масса по отношению к массе, чем растущее рядом растение A. vera. После того, как листья A. ferox становятся более толстыми и широкими, общее количество горького сока на лист становится даже больше. Количество выделенного из A. ferox геля, соответственно, также значительно больше по объему, по сравнению с полученным в случае A. vera количеством.

Существует много методов для выделения отдельных компонентов алоэ (см., например, патенты США 4735935 и 4656029). Один из коммерческих продуктов алоэ получают из сока, выделяемого из листьев алоэ, и называют горькой настойкой алоэ благодаря его горькому вкусу. Сок собирают и сушат традиционными методами, которые хорошо известны специалистам в данной области техники, с получением темно-коричневой твердой субстанции, известной как горькая настойка алоэ или алоэ капское.

Коммерческие горькие настойки алоэ обычно содержат четыре основных компонента, а именно алоин А, алоин В, алоэзин и алоэрезин А.

Общая композиция основных соединений экссудата из листьев A.ferox значительно не изменяется, в частности, хотя принимается во внимание морфологическая вариация и обширная естественная область распространения этого вида. У A. ferox алоэрезин А, алоэзин и алоин (как эпимер А, так и В) составляют между 70% и 97% от общего веса сухой субстанции, в отношении приблизительно 4:3:2 соответственно.

Алоин А и В (или барбалоин) выделяют из горькой настойки алоэ обычно путем селективной экстракции и используют, преимущественно, как слабительное средство. Алоэзин также выделяют из горькой настойки алоэ и используют для отбеливания кожи и в качестве солнцезащитного агента (патент США 4656029). Алоэрезин А обычно отбрасывают. Таким образом, хотя алоэрезин А присутствует в самом большом количестве в соке алоэ, он имеет незначительное или не имеет никакого коммерческого значения. Поэтому было бы выгодно превращать алоэрезин А в соединение, которое имеет большее коммерческое значение.

В представленном ниже описании любое упоминание сока алоэ также предполагает, что это относится к горькой настойке алоэ или экстракту горькой настойки алоэ.

Сущность изобретения

В соответствии с первым осуществлением изобретение относится к способу превращения алоэрезина А в алоэзин, включающему стадию гидролиза по меньшей части алоэрезина А до алоэзина и п-кумаровой кислоты.

Далее способ может включать стадию отделения алоэзина от п-кумаровой кислоты.

Стадия гидролиза алоэрезина А до алоэзина может осуществляться с использованием кислотного гидролиза.

Альтернативно, стадия гидролиза алоэрезина А до алоэзина может осуществляться с использованием гидролитического фермента.

В случае кислотного гидролиза кислота может быть любой органической или неорганической кислотой. В частности, кислота может быть одна или это может быть несколько кислот, которые выбирают из группы, состоящей из соляной кислоты, серной кислоты, азотной кислоты и фосфорной кислоты.

В случае ферментативного гидролиза гидролитический фермент может быть эстеразой, липазой или протеазой.

В частности, гидролитический фермент может быть выбран из группы, состоящей из протеазы Aspergillus oryzae, ESL 001-02^TM от Diversa, NOVO 388^TM от Nordisk и липазы Mucor miehei от Altus Chiroscreen Kit^TM. Более конкретно, ферментом может быть либо Amano Protease M^TM, либо Bioprotease P conc^TM от Quest International, где оба являются протеазой Aspergillus oryzae.

Альтернативно, фермент может быть ферментом, который кодируется ДНК или имеет аминокислотную последовательность, которые по меньшей мере по существу соответствуют ДНК или аминокислотной последовательности любого фермента, упомянутого выше, или части его последовательности.

ДНК или аминокислотная последовательность фермента может быть по меньшей мере на 70% гомологична ДНК или аминокислотной последовательности упомянутых выше ферментов.

Ферменты могут быть в твердой или жидкой форме.

Предпочтительно, алоэрезин А превращают в алоэзин и п-кумаровую кислоту без образования побочных продуктов и, в частности, без образования полимеров.

Алоэрезин А может быть получен из растения алоэ любого вида, в частности вида A. ferox или A. vera, и более конкретно вида A. ferox.

Алоэрезин А может быть получен из сока, производимого листьями растения алоэ. Сок может быть в твердой или жидкой форме.

Алоэрезин А может быть в частично очищенной форме.

Стадия гидролиза, в случае применения кислоты, может осуществляться при концентрации кислоты в диапазоне от приблизительно 0,5 н. до приблизительно 10 н., и предпочтительно, осуществляется при концентрации кислоты от приблизительно 2 н. до приблизительно 5 н.

Стадия гидролиза может проводиться при от приблизительно 20 до приблизительно 121°С, и в случае применения кислоты обычно осуществляется при приблизительно 90°С. В случае применения гидролитических ферментов стадию гидролиза осуществляют при приблизительно 37°С, за исключением применения ESL001-02^ТМ, в этом случае стадию гидролиза можно осуществлять при от приблизительно 50 до приблизительно 90°С, более конкретно при приблизительно 70°С.

В реакционной среде может использоваться буфер. Буфером может быть натрий фосфатный, карбонатный или боратный буфер или вода, или любой другой буфер, имеющий рК_а в диапазоне рН от приблизительно 4 до приблизительно 8. Концентрация буфера может находиться в диапазоне от 0,01 М до 1 М, и предпочтительно составляет 0,1 М.

Может быть добавлен органический растворитель, такой как этанол или ацетон, в концентрации от приблизительно 10 до 50%, и предпочтительно приблизительно 30%.

В соответствии со вторым осуществлением изобретение относится к способу экстракции алоэзина из сока растения алоэ, где способ включает стадии:

гидролиза по меньшей мере части алоэрезина А растения алоэ до алоэзина и п-кумаровой кислоты и

экстракции из сока природного алоэзина и алоэзина, полученного из алоэрезина А.

Растение алоэ может быть растением вида A. ferox. Сок может быть в жидкой или твердой форме.

Алоэрезин А может подвергаться гидролизу в соответствии с методом, по существу, как описано выше.

В соответствии с третьим осуществлением изобретение относится к алоэзину, полученному путем гидролиза алоэрезина А до алоэзина и п-кумаровой кислоты, по существу, как описано выше.

Алоэрезин А может быть из сока растения алоэ и, более конкретно, может быть из сока вида A. ferox.

Алоэзин может быть комбинацией природного алоэзина и алоэзина, превращенного из алоэрезина А в соответствии с описанным выше способом.

Подробное описание изобретения

Далее описан способ гидролитического превращения алоэрезина А в алоэзин.

Алоэрезин А является алоэзиниловым эфиром п-кумаровой кислоты, и заявитель обнаружил, что возможно эффективно и экономично гидролизовать алоэрезин А до алоэзина (С-гликозид-5-метилхромон), таким образом увеличивая количество алоэзина, доступное для экстракции из сока растений алоэ. Так как алоэзин является коммерчески более выгодным, чем алоэрезин А, способ также позволяет увеличить коммерческую ценность сока или горькой настойки алоэ из растения алоэ. Реакция превращения алоэрезина А в алоэзин представлена ниже:

Превращение алоэрезина А в алоэзин также облегчает селективное извлечение алоэзина, а также побочных продуктов алоина А и В из горькой настойки алоэ. Экстракция и очистка алоэзина в отсутствие алоэрезина А является намного менее трудной и дорогостоящей, чем в присутствии алоэрезина А, по двум основным причинам:

(а) после конверсии больше алоэзина, который может быть экстрагирован и

(б) после конверсии только два основных компонента (алоэзин и алоин) необходимо выделять из горькой настойки алоэ, а так как они обладают сильно отличающимися физическими свойствами, селективная экстракция алоэзина значительно облегчается.

Метод может также включать стадию отделения алоэзина от п-кумаровой кислоты. Подходящие стадии разделения будут очевидны специалистам в данной области техники и не будут детально здесь обсуждаться, хотя обычные методы разделения включают экстракцию растворителем, хроматографию и кристаллизацию.

Примеры стадий гидролиза, которые могут использоваться в методе, представляют собой кислотный гидролиз, основный гидролиз и ферментативный гидролиз.

В случае кислотного гидролиза кислота может быть любой органической или неорганической кислотой, такой как соляная кислота, серная кислота, азотная кислота, фосфорная кислота и т.д.

В случае ферментативного гидролиза гидролитический фермент может быть эстеразой, липазой и протеазой, такой как протеаза Aspergillus oryzae, ESL 001-02^TM от Diversa, NOVO 388^TM от Nordisk (в частности, протеаза-контаминант в препарате) или липаза Mucor miehei от Altus Chiroscreen Kit^TM. Более конкретно, ферментом может быть либо Protease M^TM от Amano, либо Bioprotease P conc^TM от Quest International, где обе являются протеазой Aspergillus oryzae. Альтернативно, фермент может быть ферментом, который кодируется ДНК или аминокислотной последовательностью, которая по меньшей мере, по существу, соответствует ДНК или аминокислотной последовательности любого фермента, упомянутого выше, или части его последовательности. ДНК или аминокислотная последовательность фермента могут быть по меньшей мере на 70% гомологичными ДНК или аминокислотной последовательности упомянутых выше ферментов. Фермент может быть в твердой или жидкой форме.

Алоэрезин А обычно превращают в алоэзин и п-кумаровую кислоту без образования побочных продуктов, таких как полимеры.

Любой вид растения алоэ представляет собой приемлемый источник алоэрезина А, который доступен из сока, производимого листьями растения алоэ. Сок может быть в твердой или жидкой форме, и алоэрезин А может быть в очищенном виде, частично очищенном виде или может быть в неочищенном виде в соке или другой части растения алоэ.

Стадия гидролиза, в случае применения кислоты, обычно осуществляется при концентрации кислоты в диапазоне от приблизительно 0,5 н. до приблизительно 10 н. и, наиболее выгодно, осуществляется при концентрации кислоты от приблизительно 2 н. до приблизительно 5 н.

Стадия гидролиза обычно проводится при от приблизительно 20 до приблизительно 121°С и, в случае применения кислоты, обычно осуществляется при приблизительно 90°С. В случае применения гидролитического фермента стадию гидролиза обычно осуществляют при приблизительно 37°С, исключая, когда используют фермент ESL001-02^ТМ, в этом случае стадию гидролиза осуществляют при от приблизительно 50 до приблизительно 90°С, более конкретно при приблизительно 70°С.

В реакционной среде может использоваться буфер. Буфером может быть натрийфосфатный, карбонатный или боратный буфер или вода, или любой другой буфер, имеющий рК_а в диапазоне рН от приблизительно 4 до приблизительно 8. Концентрация буфера может находиться в диапазоне от приблизительно 0,01 М до 1 М, и предпочтительно составляет 0,1 М.

Алоэзин, полученный описанным выше методом гидролиза, может применяться в композициях для местного применения на коже. Алоин может применяться в различных композициях для распространения на рынке ветеринарных и медицинских препаратов.

ПРИМЕРЫ

В примерах использовали соляную кислоту и серную кислоту для демонстрации способности кислот гидролизовать алоэрезин А до алоэзина и использовали протеазу Aspergillus oryzae для демонстрации ферментативного гидролиза алоэрезина А до алоэзина.

Метод количественной ВЭЖХ был разработан как аналитический инструмент для контроля количества алоэрезина А, алоэзина и п-кумаровой кислоты в течение оптимизации описанного выше метода гидролиза. Подробные данные опытов и результаты представлены в примерах ниже.

Пример 1. Кислотный гидролиз с использованием HCl и ацетона

Сок алоэ, содержащий алоэрезин А (15%), подвергали гидролизу при 90°С с помощью 1,3 или 5 н. HCl в присутствии в течение реакции ацетона или без ацетона. Ацетон использовали для увеличения растворимости субстрата сока алоэ. Отбирали через промежутки времени аликвоты (20 мкл) реакции и добавляли к 100 мМ фосфатному буферу, рН 7,2, содержащему 30% ацетона. Образцы анализировали с помощью ВЭЖХ, используя известные методы.

Результаты демонстрировали, что скорость гидролиза зависела от силы кислоты, и что достигалось превращение от 40% до 80% при использовании 5 н. HCl. Присутствие 10% ацетона незначительно улучшало результаты гидролиза. Скорость исчезновения алоэрезина А была выше при более высокой силе кислоты. Результаты также показали, что 90-95% алоэрезина А исчезает в течение 2 ч при применении 3-5 н. HCl.

Пример 2. Кислотный гидролиз с использованием HCl или H ₂ SO ₄ и этанола

Этанол применяли в качестве альтернативы ацетону. Содержащий алоэрезин А экстракт алоэ подвергали гидролизу при 90°С с помощью 1 н. HCl или H₂SO₄ в присутствии 50% (об./об.) этанола в течение указанного времени. Количество экстракта алоэ варьировали от 10 до 50 (об./об.). Отбирали через определенные промежутки времени аликвоты (1 мл) реакции и добавляли к 0,5 мл холодного ацетона. Образцы анализировали с помощью ВЭЖХ, используя известные методы.

При применении H₂SO₄ в качестве кислоты для гидролиза и сока алоэ в концентрации 30% смыкание мольного соотношения между алоэрезином А и алоэзином находилось в области 80% после 4 ч реакции (и было возможно более высоким в течение этого периода). Смыкание мольного соотношения было на приблизительно 10% выше при применении в качестве кислоты H₂SO₄, но наблюдали более быструю убыль в мольном соотношении по сравнению с HCl.

Пример 3. Ферментативный гидролиз с применением протеазы Aspergillus oryzae

Были испытаны различные условия, для того чтобы предварительно оптимизировать ферментативный гидролиз алоэрезина А до алоэзина в экстракте алоэ или чистого алоэрезина А. Протеаза Aspergillus oryzae была выбрана в качестве примера гидролитического фермента, и было протестировано две протеазы Aspergillus oryzae, где одной являлась Protease M^TM от Amano, а другой Bioprotease P conc^TM от Quest International.

Характеристики Protease M^TM:

Источник: Asp. oryzae (не является ГМО);

Разбавитель: картофельный декстрин (не является ГМО);

Содержание разбавителя: приблизительно 15%.

Характеристики P conc^TM:

минимум 400000 HUT ед. протеазы/г

- общее количество жизнеспособных организмов <50000/г;

- дрожжевые и плесневые грибки <200/г;

- E. coli: отсутствует в 25 г;

- Salmonella: отсутствует в 25 г;

- соответствует всем международным характеристикам (тяжелые металлы, свинец, мышьяк и т.д.), что изложено у FCC&JECFA.

Исследовали следующие параметры в небольшом масштабе:

Концентрация фермента:	1-50 мг энзима/л
Экстракт алоэ:	15 мкл - 200 мкл на 3 мл
Вид буфера:	Натрий фосфатный, боратный или карбонатный
Концентрация буфера:	0,001 М - 1 М
рН:	4-7
Концентрация Твина:	0, 1 и 10% об./об.
Концентрация ацетона:	0-50%

В случае применения сока алоэ в качестве субстрата обычно наблюдали по меньшей мере 50% увеличение концентрации алоэзина.

Пример 4. Ферментативный гидролиз с применением протеазы Aspergillus oryzae

Реакцию проводили с применением 3 мг чистого (91%) алоэрезина А на 1 мл реакции, используя в качестве фермента Amano Protease M^TM или Quest Bioprotease P conc^TM.

Концентрация фермента:	2 и 20 мг
Концентрация буфера:	0,01 М натрий фосфата
рН:	5,5

Реакцию проводили при 37°С при перемешивании на вибрационном устройстве для перемешивания в течение 20 часов. Достигали полного превращения алоэрезина А в алоэзин.

В случае всех реакций вся реакция объемом 3 мл подвергалась анализу. Образцы доводили до 25 мл водой:метанолом:ТГФ (20:40:40) и анализировали с помощью ВЭЖХ.

Было обнаружено, что Aspergillus oryzae оптимально функционирует при 37°С. Ферментативное превращение алоэрезина А в алоэзин и п-кумаровую кислоту оптимизировали по параметрам, описанным выше, и были подобраны условия, в которых алоэрезин А полностью превращался в алоэзин и п-кумаровую кислоту. После 4 ч происходило 100% увеличение содержания алоэзина и на 100% уменьшалось содержание алоэрезина А. Поэтому превращение было полным с мольным балансом, близким к 100%, при использовании в качестве субстрата чистого алоэрезина А.

Пример 5. Производство алоэзина в крупном масштабе

Реакции осуществляли в эмалированном реакторе с мешалкой и рубашкой. Сок алоэ подвергали гидролизу, используя эквивалентную массу 2 молярного раствора HCl, в атмосфере азота. Реактор нагревали до 90°С и температуру поддерживали приблизительно в течение 5,5 часов. Полученное превращение алоэрезина составило приблизительно 94%, со средней селективностью по алоэзину приблизительно 30%.

В конце реакции содержимое реактора охлаждали до 70°С, пропуская через рубашку охлажденную воду. Смесь нейтрализовали с помощью 45% раствора каустика (приблизительно 0,75 эквивалента на кислоту) до значения рН приблизительно 4,5.

Далее реактор охлаждали до 28°С и прекращали перемешивание. Позволяли реакционной смеси разделиться на 2 фазы. Водная фаза (называемая гидролизатом) оказывалась внизу, а верхний слой, содержащий твердую фазу, собирался наверху (называемый верхним слоем). Гидролизат отводили в сливной резервуар.

Через верхний слой пропускали азот при перемешивании до добавления воды. Содержимое реактора затем промывали эквивалентной массой воды. Осуществляли перемешивание в реакторе при 25°С в течение 30 минут и затем позволяли отстояться в течение дополнительных 30 минут.

Разделение смеси производили при 25°С с остающимся наверху верхним слоем. Водную фазу отводили в сливной резервуар. Промывные воды объединяли с собранным ранее гидролизатом. Общее количество алоэзина из послереакционного потока составляло около 84%.

Оставшуюся твердую фазу удаляли из реактора путем растворения в 10% каустическом растворе. Промывной раствор затем отводили и обрабатывали как отходы.

Предполагается, что изобретение не ограничивается определенными деталями, такими, как описаны здесь. Например, заявитель предусматривает, что могут также применяться другие гидролитические агенты в реакции гидролиза, такие как кислоты и ферменты, которые являются химически или биохимически эквивалентными исследованным кислотам или ферментам.

1. Способ экстракции алоэзина из горькой настойки алоэ из растения алоэ, где способ включает следующие стадии:
гидролиз алоэрезина А в горькой настойке алоэ до алоэзина и п-кумаровой кислоты; и
селективная экстракция из горькой настойки алоэ природного алоэзина и алоэзина, полученного из алоэрезина А.

2. Способ по п.1, где растение алоэ представляет собой вид A. ferox.

3. Способ по п.1, где алоэрезин А подвергается гидролизу до алоэзина путем кислотного гидролиза.

4. Способ по п.1, где алоэрезин А подвергается гидролизу до алоэзина путем ферментативного гидролиза.

5. Способ по п.3, где для кислотного гидролиза используют органическую кислоту.

6. Способ по п.3, где для кислотного гидролиза используют неорганическую кислоту.

7. Способ по п.6, где кислоту выбирают из группы, состоящей из соляной кислоты, серной кислоты, азотной кислоты и фосфорной кислоты.

8. Способ по п.4, где для осуществления ферментативного гидролиза используют фермент, который выбирают из группы, состоящей из эстеразы, липазы и протеазы.

9. Способ по п.4, где фермент выбирают из группы, состоящей из протеазы Asperglllus oryzae, ESL 001-02™, NOVO 388™ и липазы Mucor miehei.

10. Способ по п.9, где протеаза Aspergillus oryzae является ферментом либо Protease M™, либо Bioprotease P cone™.

11. Способ по п.8, где фермент выбирают из группы, состоящей из протеазы Aspergillus oryzae, ESL 001-02™, NOVO 388™ и липазы Mucor miehei.

12. Способ по п.11, где протеаза Aspergillus oryzae является ферментом либо Protease M™, либо Bioprotease P сonе™.

13. Способ по п.2, где алоэрезин А подвергается гидролизу до алоэзина путем кислотного гидролиза.

14. Способ по п.2, где алоэрезин А подвергается гидролизу до алоэзина путем ферментативного гидролиза.

15. Способ по п.13, где для кислотного гидролиза используют органическую кислоту.

16. Способ по п.13, где для кислотного гидролиза используют неорганическую кислоту.

17. Способ по п.16, где кислоту выбирают из группы, состоящей из соляной кислоты, серной кислоты, азотной кислоты и фосфорной кислоты.

18. Способ по п.14, где для осуществления ферментативного гидролиза используют фермент, который выбирают из группы, состоящей из эстеразы, липазы и протеазы.

19. Способ по п.14, где фермент выбирают из группы, состоящей из протеазы Aspergillus oryzae, ESL 001-02™, NOVO 388™ и липазы Mucor miehei.

20. Способ по п.19, где протеаза Aspergillus oryzae является ферментом либо Protease M™, либо Bioprotease P cone™.

21. Способ по п.18, где фермент выбирают из группы, состоящей из протеазы Aspergillus oryzae, ESL 001-02™, NOVO 388™ и липазы Mucor miehei.

22. Способ по п.21, где протеаза Aspergillus oryzae является ферментом либо Protease M™, либо Bioprotease P cone™.

23. Способ по п.1, где алоэрезин А превращается в алоэзин и п-кумаровую кислоту без формирования побочных продуктов.

24. Способ по п.1, где алоэрезин А превращается в алоэзин и п-кумаровую кислоту без формирования полимеров.

25. Способ по п.3, который осуществляют при диапазоне концентрации кислоты от приблизительно 0,5 до приблизительно 10 н. кислоты.

26. Способ по п.3, который осуществляют при диапазоне концентрации кислоты от приблизительно 2 до приблизительно 5 н. кислоты.

27. Способ по п.1, где используют буфер.

28. Способ по п.3, где на стадии гидролиза добавляют органический растворитель.

29. Способ по п.28, где органический растворитель представляет собой этанол или ацетон.

30. Способ по п.1, где алоэзин не экстрагируют из горькой настойки алоэ с применением метода хроматографии.